全 文 ：响应面法优化火炭母中总黄酮的提取工艺研究
昌水平，余香，梁志云，蒋三元(江门市新会区中医院，广东 江门 529100)
摘要:目的 采用响应面法优化火炭母中总黄酮的提取工艺。方法 在单因素试验的基础之上，根据 Box-Behnken 中心组合
实验设计原理，采用 3因素 3水平的响应面分析方法，考察了乙醇浓度、料液比和提取温度等因素对提取工艺的影响，依据回
归分析确定工艺条件，以火炭母总黄酮提取率为响应值作响应面和等高线。结果 在分析各个因素的显著性和交互作用后，
得出火炭母总黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度 67%，提取时间 1．5 h，料液比 1 ∶79，总黄酮提取率为 20．03 mg /g。结论 该含量
测定方法简便、准确、重复性好，提取工艺经济、合理，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
关键词:火炭母;总黄酮;紫外－可见分光光度法;响应面法
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1673-4610(2016)01-0036-03
作者简介:昌水平，副主任中药师，Tel:13702209929，E－mail:zyysbk001@ 126．com
Optimization of Extraction Technique of Total Flavonoids in Polygonum Chinense by Ｒesponse Surface
Methodoloy
CHANG Shuiping，YU Xiang，LIANG Zhiyun，JIANG Sanyuan(Jiangmen Xinhui Hospital of Traditional Chinese Medicine，
Jiangmen，Guangdong 529100，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To optimize the extraction technique of total flavonoids from Polygonum chinense by response surface
methodology． METHODS The effects of ethanol concentration，extraction time and the ratio of solid to liquid on extraction technique
were studied． Base of the single factor test，an orthogonal test design was developed by Box－Behnken central composite test．ＲESULTS
The optimum conditions for total flavonoids in Polygonum chinense were ethanol concentration of 67%，extraction time of 1．5 h，the ratio
of solid to liquid of 1 ∶ 79． Under the optimized conditions，the maximum extraction yield of total flavonoids was 20． 03 mg /g．
CONCLUSION The optimization of extraction technique of total flavonoids in Polygonum chinense was stable，feasible and simple．
KEY WOＲDS:Polygonum chinense;total flavonoids;uv－vis spectrophotometry;response surface methodology
火炭母为蓼科蓼属植物火炭母(Polygonum
chinense L．)的干燥全草，别名火炭毛、乌炭子等，生
于山谷、水边、湿地，其性凉，味酸、涩，归肝、脾经，具
有清热利湿、凉血解毒的功效，用于湿热泄泻、痢疾、
黄疸、咽喉肿痛、湿热疮疹［1］。本品为广东地区常用
中草药，同时也是多种广东凉茶的主要成分之一［2］。
火炭母化学成分研究始于 20世纪，按其化合物结构
类型，大致可分为黄酮类、酚酸类、鞣质类、挥发油类
及甾体类［3］。现代药理研究表明火炭母具有抗
炎［4］、抗病源微生物［4］、镇痛［5］、抗氧化及消除自由
基活性［6－7］等作用。黄酮类 成分为火炭母化学成分
之一。因此，本文对火炭母总黄酮的提取工艺进行
研究，通过响应面法优化得到火炭母中总黄酮的最
佳提取工艺，为进一步的工艺开发提供参考依据。
1 材料与仪器
电子天平(CP225D 型，德国赛多利斯公司) ;紫
外分光光度计(UV1102 型，上海天美科学仪器有限
公司)。
芦丁对照品(批号 110753－200413，购自中国药
品生物制品检定所) ，火炭母药材(20130801，广东中
智中药饮片有限公司) ，其他药品、试剂均为分析纯。
2 试验方法与结果
2．1 供试品溶液的制备
取火炭母粉末(过四号筛)0．5 g，精密称定，加
70%乙醇溶液 40 mL，加热回流提取 1 h，取提取液滤
过，滤液蒸干，残渣加 70%乙醇溶液使溶解，转移至
100 mL量瓶中，用 70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得
供试品溶液。
2．2 对照品储备溶液的制备
取芦丁对照品约 3 mg，精密称定，置 25 mL量瓶
中，加 70%乙醇适量，振摇使溶解，用 70%乙醇稀释
至刻度，摇匀，作为对照品储备液 I(浓度为 0．120 0
mg /mL)。同法配制对照品储备液Ⅱ(浓度为 4．950
mg /mL)。
·63· Pharmacy Today，2016 January，Vol．26 No．1 今日药学 2016年 1月第 26卷第 1期
2．3 标准曲线绘制
精密吸取 1．0、2．0、3．0、4．0 和 5．0 mL 的对照品
储备液 I，分别置于 10 mL量瓶中，加入 5%亚硝酸钠
溶液 0．3 mL，摇匀，放置 6 min，加入 10%硝酸铝溶液
0．3 mL，摇匀，放置 6 min，加入 4%氢氧化钠溶液 4．0
mL，加入 70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min，
作为对照品系列溶液，以不含芦丁的空白溶液为参
比，于 510 nm波长处测定显色后溶液吸光度，以对
照品吸光度(Y)为纵坐，相应标芦丁对照品浓度(X)
为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁的回归方程为 Y =
1．050×10－2X－6．000×10－3(r= 0．999 9) ，结果表明，芦
丁的浓度在 12．33～61．65 μg /mL范围内与吸光度呈
良好的线性关系。
2．4 精密度试验
取火炭母粉末(过四号筛)0．5 g，精密称定，按
“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精
密量取供试品溶液 5 mL，按“标准曲线绘制”项下方
法显色，测定其吸光度，平行测定 6 次。计算吸光度
的 ＲSD为 0．34%，结果表明仪器精密度良好。
2．5 重复性试验
取火炭母粉末(过四号筛)0．5 g，精密称定，共 6
份，按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶
液，精密量取供试品溶液 5 mL，按“2．3”项下方法显
色，测定其吸光度，计算火炭母中总黄酮的含量平均
值为 19．84 mg /g，ＲSD 为 1．0%，结果表明方法重复
性良好。
2．6 稳定性试验
取火炭母粉末(过四号筛)0．5 g，精密称定，按
“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，精
密量取供试品溶液 5 mL，按“2．3”项下方法显色，分
别在 0、0．5、1．0、1．5 和 2．0 h，测定其吸光度，计算得
吸光度的 ＲSD 为 1． 4%，结果表明样品室温放置
2．0 h内稳定。
2．7 加样回收率试验
取火炭母粉末(总黄酮的含量为 19．84 mg /g)9
份，每份 0．25 g，精密称定，分别加入对照品储备液
Ⅱ0．5、1．0 和 1．5 mL，按“2．1”项下方法制备供试品
溶液，每个浓度 3份，精密量取供试品溶液 5 mL，按
“2．3”项下方法显色，测定其吸光度。低、中、和高浓
度的火炭母总黄酮的平均回收率分别为 99． 1%、
100．4%和 101． 1%，ＲSD 分别为 1． 7%、1． 8% 和
0．29%，结果见表 1。
表 1 加样回收率试验结果(n= 3)
称样量
(g)
加入量
(mg)
样品含量
(mg)
测得总量
(mg)
平均回收
率(%)
ＲSD
(%)
低 0．250 1 2．475 4．962 7．390 99．1 1．7
0．250 9 2．475 4．978 7．410
0．250 3 2．475 4．966 7．467
中 0．250 8 4．950 4．976 9．981 100．4 1．8
0．250 3 4．950 4．966 10．00
0．250 7 4．950 4．974 9．848
高 0．250 2 7．425 4．964 12．48 101．1 0．29
0．250 5 7．425 4．970 12．46
0．250 3 7．425 4．966 12．50
2．8 单因素试验
2．8．1 乙醇浓度对提取的影响 取火炭母粉末(过
四号筛)0．5 g，5份，精密称定，分别加入 50%、60%、
70%、80%和 90%乙醇溶液 40 mL，70 ℃下，回流提
取 1 h，按“2．1”项下方法制备供试品溶液，精密量取
供试品溶液 5 mL，按“2．3”项下方法显色，测定其吸
光度，计算火炭母中总黄酮的含量。试验结果表明，
60%乙醇溶液提取出的火炭母总黄酮含量最佳。
2．8．2 提取时间对提取的影响 取火炭母粉末(过
四号筛)0．5 g，5份，精密称定，分别加入 70%乙醇溶
液 40 mL，分别回流 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0 和 2． 5 h，按
“2．1”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶
液 5 mL，按“2．3”项下方法显色，测定其吸光度，计
算火炭母中总黄酮的含量。试验结果表明，随着提
取时间的延长，火炭母总黄酮的提取率明显增加，
1．5 h后，增加不明显，故 1．5 h 为火炭母总黄酮的最
佳提取时间。
2．8．3 料液比对提取的影响 取火炭母粉末(过四
号筛)0．5 g，5份，精密称定，分别加入 70%乙醇溶液
20、30、40、50 和 60 mL，70 ℃下，回流提取 1 h，按
“2．1”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶
液 5 mL，按“2．3”项下方法显色，测定其吸光度，计
算火炭母中总黄酮的含量。试验结果表明，料液比
为 1 ∶80时，火炭母总黄酮提取率最佳。
2．9 响应面法优化提取工艺
在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度(X1)、
提取时间(X2)、料液比(X3)为考察对象，以火炭母
总黄酮含量为响应值(Y) ，根据 Box-Behnken 的中心
组合试验设计原理，采用 Design Expert 8．0．6 统计分
析软件的响应面分析法安排试验，以获取最适合工
艺参数。采用 3因素 3水平的响应面分析方法进行
试验设计，试验因素水平设计见表 2。
·73·今日药学 2016年 1月第 26卷第 1期 Pharmacy Today，2016 January，Vol．26 No．1
表 2 响应面试验因素水平表
因素
水平
－1 0 1
X1 乙醇浓度(%) 50 60 70
X2 提取时间(h) 1．0 1．5 2．0
X3 料液比(g ∶mL) 1 ∶60 1 ∶80 1 ∶100
表 3 响应面试验方案与结果
编号
X1
乙醇浓度
(%)
X2
提取温度
(h)
X3
料液比
(g ∶mL)
Y
总黄酮含
量(mg /g)
1 1 0 1 20．07
2 1 －1 0 20．28
3 1 1 0 20．31
4 1 0 －1 20．16
5 －1 0 1 19．92
6 －1 0 －1 19．86
7 －1 1 0 20．22
8 －1 －1 0 19．80
9 0 －1 1 19．48
10 0 1 －1 19．84
11 0 －1 －1 19．46
12 0 1 1 19．60
13 0 0 0 20．78
14 0 0 0 20．53
15 0 0 0 20．68
16 0 0 0 20．75
17 0 0 0 20．94
火炭母中总黄酮提取工艺优化结果见表 3，共
17个试验，其中，1 ～ 12 为析因试验，12 ～ 17 为中心
试验，用来分析试验误差。经回归拟合后，各因子与
响应值的回归方程为:Y = +3．032+6．361×10－3X1 +
5．994× 10－3 X2 － 1． 575 × 10
－3 X3 － 4． 878 × 10
－3 X1X2 －
1．873×10－3X1X3 －3．299×10
－3X2X3 －3．990×10
－3X12 －
2．459×10－1X22－3．202×10
－2X32。
火炭母中总黄酮响应面试验方差分析见表 4，
由方差分析结果可知，各因素中 X22和 X32是高度显
著的，X1 和 X2 是显著的，表明各试验因子对响应值
的影响不是简单的线性关系。上述回归方程中各变
量对响应值影响的显著性，是由 F 检验来判定。概
率 P值越小，则相应变量的显著程度越高。P＜0．05
时，影响为显著;P＜0．01时，影响为高度显著。
从整体分析，该回归模型 F检验是高度显著的，
其失拟项检验是不显著的，表明该模型与实际情况
拟合程度较好，可用此模型对试验进行分析与预测。
其决定系数 Ｒ2 = 0．972 4，说明预测值和实测值之间
具有高度相关性，响应值的变化有 97．24%与所选变
量相关，说明试验由较好的精确度和可靠，可以用该
回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析和预
测。因此，此模型能较好地描述各因素与响应值之
间的关系，可用此模型火炭母总黄酮得率进行分析
预测。
表 4 响应面试验方差分析结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
X1 0．13 1 0．13 9．49 0．017 8 *
X2 0．11 1 0．11 8．23 0．024 *
X3 7．812×10－3 1 7．812×10－3 0．57 0．474 9
X1 X2 0．038 1 0．038 2．77 0．139 7
X1 X3 5．625×10－3 1 5．625×10－3 0．41 0．542 2
X2 X3 0．017 1 0．017 1．23 0．303 5
X12 0．033 1 0．033 2．38 0．166 9
X22 1．03 1 1．03 75．42 ＜0．000 1 ＊＊
X32 1．75 1 1．75 128．00 ＜0．000 1 ＊＊
模型 3．35 9 0．37 27．13 0．000 1 ＊＊
残差 0．096 7 0．014
失拟项 6．625×10－3 3 2．208×10－3 0．099 0．956 5
纯误差 0．089 4 0．22
总和 3．44 16
注:* 为显著(P＜0．05);＊＊为高度显著(P＜0．01)
(下转第 50页)
·83· Pharmacy Today，2016 January，Vol．26 No．1 今日药学 2016年 1月第 26卷第 1期
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(收稿日期:2015-12-29)
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(上接第 38页)
图 1 各因素之间的响应面图
根据回归模型预测各因素对黄酮得率的影响如
图 1所示。3组图分别显示了不同交叉因素对黄酮
得率的交互影响趋势，响应面图根据曲面的倾斜程
度来反映两因素交互作用的显著程度，当曲面越陡，
交互作用越显著，而曲面越光滑，交互作用越小。通
过对各因素交互作用影响的响应面图和等高线图的
分析，可以直观地判断各因素间的交互作用显著程
度以及各单因素的变化趋势。进一步对回归模型进
行预测得出火炭母总黄酮提取率的最佳工艺为:乙
醇浓度 67．04%，提取时间 1．53 h，料液比 1 ∶79．04，
此条件下火炭母总黄酮提取率为 20．79 mg /g。考虑
到实际操作的可行性，将火炭母总黄酮的提取条件
在回归方程得到的基础上修正为乙醇浓度 67%，提
取时间 1．5 h，料液比 1 ∶79。在此条件下进行重复试
验，重复试验值为 20．03 mg /g，与理论预测值误差仅
为 3．8%，与预测值较为接近，说明采用响应面法得
到的工艺参数可靠，具有一定的实用价值。
3 结论
响应面法优化火炭母总黄酮提取的最佳工艺条
件为:乙醇浓度 67%，提取时间 1．5 h，料液比 1 ∶79，
此条件下总黄酮提取率为 20．03 mg /g，与理论预测
值误差仅为 3．8%，表明该模型能较好地预测火炭母
总黄酮得率。响应面法能较好地优化火炭母总黄酮
的提取工艺。
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(收稿日期:2015－12－01)
·05· Pharmacy Today，2016 January，Vol．26 No．1 今日药学 2016年 1月第 26卷第 1期