全 文 ：第 28卷 第 2期
2 0 1 1 年 2 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.28　　No.2
Feb.2011 p.148
收稿日期:2010-01-07
作者简介:马丹凤(1984-),女(汉族), 辽宁沈阳人 ,硕士研究生 , E-mailxiaofengfeng307@126.com;赵怀清(1955-),
男(汉族),辽宁锦州人 ,教授 , 主要从事中药质量控制方法与药动学研究 , Tel.024-23986250, E-mailzhaohq1955@
sina.com。
文章编号:1006-2858(2011)02-0148-04
RP-HPLC法测定蝙蝠葛酚性碱片中蝙蝠葛碱
在大鼠体内的血药质量浓度
马丹凤1 , 王运君 2 , 赵怀清1 , 金玉坤 3
(1.沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016;2.辽河油田中心医院 药剂科 , 辽宁 盘锦 124010;
3.东北制药集团股份有限公司 , 辽宁 沈阳 110026)
摘要:目的 测定蝙蝠葛酚性碱片灌胃后大鼠血浆中蝙蝠葛碱的质量浓度。方法 以原阿片碱为内
标 , 采用 C18柱 , 乙腈-体积分数 4%乙酸-三乙胺 (体积比 80∶240∶2)为流动相 , 流速为
1.0mL·min-1 , 检测波长 282nm, 柱温 30 ℃。结果 蝙蝠葛碱的线性范围为 0.05 ～ 5.0 mg·L-1
(r=0.997 9),定量下限为 50 μg·L-1 , 日内 、日间精密度均小于 15%。结论 本方法专属性强 、灵敏
度高 、回收率高 、重现性好 , 可用于蝙蝠葛碱血药质量浓度测定及药动学研究。
关键词:蝙蝠葛酚性碱片;蝙蝠葛碱;反相-高效液相色谱法;药动学
中图分类号:R972;R917　　　文献标志码:A
　　蝙蝠葛酚性碱片是由蝙蝠葛(Menispermum
dauricumDC.)干燥根茎中提取的以酚性总生物
碱为原料而制成的片剂 。其中 , 蝙蝠葛碱 (dau-
ricine)为主要有效成分。蝙蝠葛碱具有抗血小板
聚集 、抗缺血性脑损伤 、保护神经等广泛的药理作
用 [ 1-2] 。据文献报道 ,蝙蝠葛碱具有良好的抗心
律失常作用 ,而且具有使用依赖性延长心肌细胞
动作电位时程的特征[ 3] ,具有非常好的临床应用
前景。作者建立了准确可靠的 RP-HPLC法 ,研究
大鼠灌胃给予蝙蝠葛酚性碱片后蝙蝠葛碱的药动
学行为 ,为蝙蝠葛酚性碱片的临床合理用药提供
依据。
1　仪器与材料
LC-10A高效液相色谱仪包括LC-10ATvp输
液泵和SPD-10Avp紫外检测器(日本岛津公司),
浙江大学 2010色谱工作站(浙江大学智能信息工
程研究所), BS-124S电子分析天平(北京塞利多
斯仪器系统有限公司), KQ-400KDE高功率数控
超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司), TGL-
16G台式离心机 (上海安亭科学仪器厂), XW-
80A涡旋混合器(上海青浦沪西科学仪器厂)。
蝙蝠葛酚性碱片(伊春药业有限公司),蝙蝠
葛碱对照品(纯度质量分数为 98%,深圳美荷生
物科技有限公司),原阿片碱(中国药品生物制品
检定所 ,批号 110853-200402)。甲醇 、乙腈(色谱
纯 ,天津康科德科技有限公司),其他试剂(分析
纯 ,市售),水为双蒸馏水(自制)。
健康雄性 Wistar大鼠 ,体质量 220 ～ 250 g,沈
阳药科大学实验动物中心提供 ,合格证号 SCXK-
(军)2007-004。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
DiamonsilC18柱 (4.6 mm×200 mm, 5 μm);
流动相:乙腈-体积分数 4%的乙酸-三乙胺(体积
比 80 ∶240 ∶2);检测波长:282 nm;流 速:
1.0mL·min-1;进样量:50μL;柱温:30 ℃。
2.2　溶液的制备
2.2.1　标准溶液的制备
取蝙蝠葛碱对照品约 5.0 mg,精密称定。置
于 10mL量瓶中 ,用体积分数为 50%的甲醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 0.5 g·L-1蝙蝠葛碱对
照储备液。分别精密量取对照储备液适量 ,用体
积分数 50%的甲醇稀释成 50.0、25.0、10.0、5.0、
2.5、1.0、0.5 mg·L-1的系列标准溶液。于 4 ℃冰
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2011.02.007
第 2期 马丹凤等:RP-HPLC法测定蝙蝠葛酚性碱片中蝙蝠葛碱在大鼠体内的血药质量浓度
箱保存 ,备用 。
2.2.2　内标溶液的配制
取原阿片碱对照品约 1.0 mg,精密称定。置
于 10mL量瓶中 ,用体积分数为 50%的甲醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 0.1 g·L-1原阿片碱对
照储备液。量取原阿片碱对照储备液 2.5 mL置
于 10mL量瓶中 ,用体积分数 50%的甲醇稀释至
刻度 ,摇匀 ,即得 25 mg·L-1的内标溶液。于 4 ℃
冰箱保存 ,备用。
2.3　血浆样品的处理
取肝素抗凝血浆 200μL,加入内标 20μL、甲
醇 20μL,涡旋混合 30 s,加提取剂乙醚 2 mL,涡
旋混合 3 min, 4 000 r·min-1离心 15 min,分离上
层有机相 ,于 40℃氮气流下吹干 ,以 150μL流动
相溶解 。取 50μL,注入高效液相色谱仪 ,记录色
谱图。
2.4　分析方法的确证
2.4.1　方法专属性考察
在 “2.1”条色谱条件下 ,比较空白血浆的色
谱图(1A)、空白血浆中加入待测物蝙蝠葛碱和内
标物原阿片碱后得到的色谱图 (1B)和给药后大
鼠血浆色谱图(1C)。结果表明血浆中内源性物
质不干扰蝙蝠葛碱和内标物的测定 。
1—Dauricine;2—Internalstandard
Fig.1　Chromatogramsofblankplasma(A), blankplasmaspikedwithstandardsolutionofdauricineandinternal
standard(B), andsampleafteradministrationofphenolicalkaloidsofMenispermumdauricumtablets(C)
2.4.2　标准曲线的制备
取大鼠空白血浆 200μL,加入系列标准溶液
20 μL, 配制相当于蝙蝠葛碱 0.05、 0.1、 0.25、
0.5、1.0、2.5、5.0 mg·L-1的血浆样品 ,除不加入
20 μL甲醇外 ,按 “ 2.3”条方法操作 ,进样 50 μL
测定 ,记录色谱图 。以血浆样品中蝙蝠葛碱的质
量浓度(ρ, mg·L-1)为横坐标 ,蝙蝠葛碱峰面积与
内标物峰面积比值(Y)为纵坐标 ,用加权(1/C2)
最小二乘法进行回归运算 ,求得的直线回归方程
为 Y=0.227 2ρ+6.169×10-3(R=0.998 6)。血
浆样 品 中 蝙 蝠 葛 碱 质 量 浓 度 在 0.05 ～
5.0mg·L-1内线 性关 系良 好 , 定量 下限 为
50 μg·L-1。
2.4.3　精密度和准确度试验
取空白血浆 200 μL,按 “ 2.4.2”条方法分别
制备蝙蝠葛碱低 、中 、高 3个质量浓度(0.1、0.5、
4.0mg·L-1)的质量控制样品(QC样品),每一质
量浓度进行 6样本分析 ,连续测定 3 d,并与标准
曲线同时进行。以当日的标准曲线计算 QC样品
的质量浓度 ,求得方法的精密度 RSD(QC样品测
得值的相对标准偏差)和准确度 RE(QC样品测
量均值对标示值的相对误差),结果见表 1。结果
方法的日间精密度 RSD≤14.3%, 日内精密度
RSD≤6.7%, RE在 ±4.0%之间 ,均符合目前生
物样品分析方法指导原则的有关规定。
Table1　PrecisionandaccuracyofHPLCmethodtodeterminedauricineinratplasma(n=6)
ρ(spiked)/
(mg·L-1)
ρ(mean)/
(mg·L-1)
SD/
(mg·L-1) Accuracy/%
RSD/%
Intra-day Inter-day
0.100 0.103 0.007 103.2 6.7 2.6
0.500 0.493 0.033 98.6 5.6 12.2
4.000 4.007 0.305 100.2 6.2 14.3
2.4.4　提取回收率试验
取空白血浆 200 μL,按 “ 2.4.2”条方法分别
制备蝙蝠葛碱低 、中 、高 3个质量浓度(0.1、0.5、
4.0mg·L-1)的样品 ,每一质量浓度进行 6样本分
析 。同时 ,另取大鼠空白血浆 200 μL,除不加系
列标准溶液和内标溶液外 ,其他按照 “ 2.4.2”条
149
沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 28卷　
方法操作 ,向获得的上清液中加入相应质量浓度
的标准溶液和内标溶液各 20 μL, 40 ℃水浴氮气
流下吹干 ,残渣用 150μL流动相溶解 ,取50μL进
样分析 ,获得相应峰面积(三次测定的平均值)。
以提取后的蝙蝠葛碱峰面积与相应质量浓度的蝙
蝠葛碱标准溶液所得蝙蝠葛碱峰面积之比计算提
取回收率。 3个质量浓度下大鼠血浆样品中的蝙
蝠葛碱提取回收率分别为 81.0%、 81.2%和
79.7%。结果见表 2。
Table2　Extractionrecoveryofdauricineandinternal
standardfromplasma
ρ(spiked)/
(mg·L-1)
Averagerecovery/
% RSD/%
0.1 81.0 4.1
0.5 81.2 2.5
4.0 79.7 4.9
2.4.5　稳定性试验
取空白血浆 200 μL,按 “ 2.4.2”条方法分别
制备低 、高 2个质量浓度(0.1和 4.0 mg·L-1)的
样品各 3份 ,按 “ 2.3”条方法操作 ,血浆样品冷冻
(-20 ℃)保存 15 d,考察长期稳定性;分别考察
冻融 3次 、室温放置 4 h、以及处理后的样品室温
放置 12 h的稳定性。试验结果表明 ,血浆样品室
温放置 4 h、经处理后于室温放置 12 h、血浆样品
冷冻(-20 ℃)保存 15d和血浆样品经 3次冷冻 -
融冻循环 ,蝙蝠葛碱均无明显降解。
2.5　蝙蝠葛碱的药动学研究
2.5.1　血浆样品的采集与预处理
取 Wistar大鼠 6只 ,雄性。试验前禁食 12 h,
自由饮水 ,灌胃给予蝙蝠葛酚性碱片 ,给药剂量按
蝙蝠葛碱计算为 600 mg·kg-1。于给药前和给药
后 0.083、0.166、0.25、0.33、0.5、1.5、4、6、8、10、
12、16 h由大鼠眼眶取血约 0.5 mL,置肝素化离
心管中 , 1×104 r·min-1离心 10 min,分离血浆冷
冻保存 。按 “2.3”条方法操作 ,进样分析。
2.5.2　药动学研究结果
大鼠灌胃给予蝙蝠葛酚性碱片药液后 ,平均
药 -时曲线见图 2。血药质量浓度 -时间数据经非
房室模型拟合 ,其主要药动学参数结果见表 3。
3　讨论与结论
a.作者曾尝试过甲醇 -水 、乙腈-水 、甲醇-磷
酸水 、乙腈-磷酸水为流动相 ,但分离效果均未能
Fig.2　Meanplasmaconcentration-timecurveofdau-
ricineafterigphenolicalkaloidsofMenispermumdauri-
cumtabletstorats
Table3　Pharmacokineticparametersofdauricineinrat
plasmaafteri.gphenolicalkaloidsofMenispermumdau-
ricumtablets(n=6)
Parameter x±s
t1/2 /h 3.562±0.520
Ke/h-1 0.198±0.030
tmax1 /h 0.318±0.097
ρmax1 /(mg·L-1) 0.559±0.139
tmax2 /h 6.667±1.033
ρmax2 /(mg·L-1) 0.339±0.048
Vd/L 1 124±154.0
AUC0※t/(mg·h·L-1) 2.545±0.141
AUC0※∝ /(mg·h·L-1) 2.747±0.191
符合要求。经实验筛选 ,最后选择乙腈-体积分数
4%的乙酸-三乙胺系统作为流动相 ,可有效改善
蝙蝠葛碱及内标峰形和分离度 ,且杂峰干扰少 ,结
果令人满意 。
　　b.作者首次采用乙醚作为提取溶剂 ,提取物
既无杂峰干扰 ,又易于分离 ,且萃取回收率也符合
要求 ,保证了血浆中药物质量浓度的测定。也曾
试用乙酸乙酯 、二氯甲烷等多种有机溶剂进行提
取 [ 4] ,结果发现 ,用乙酸乙脂提取 ,血浆中杂质峰
较多 ,背景复杂 ,影响药物及内标物测定 ,二氯甲
烷萃取有机相在下层 ,提取不方便。
c.作者首次研究了大鼠经口给予蝙蝠葛酚
性碱片后蝙蝠葛碱在大鼠体内的药动学过程。实
验所得药动学数据采用非房室模型拟合 [ 5] , t1 /2约
为 3.56h,表明药物消除较快;Vd约为 1 124L,表
观分布容积较大 ,这可能是由于蝙蝠葛碱为脂溶
性化合物且极性较小 ,易进入细胞内或脂肪组织
中所致 。
150
第 2期 马丹凤等:RP-HPLC法测定蝙蝠葛酚性碱片中蝙蝠葛碱在大鼠体内的血药质量浓度
d.大鼠灌胃蝙蝠葛酚性碱片后 ,药物吸收很
快 , 5 min即可检测到 ,在 15 ～ 30 min血药质量浓
度即达峰值 ,而后迅速下降 ,在 6 ～ 8 h达到第二
峰 。药时曲线呈双峰现象 ,主要可能是胃肠循环
的影响 [ 6] 。本实验第一峰达峰时间与文献 [ 6]相
符 ,第二达峰时间略有不同 ,文献中第二峰达峰时
间为 4 h,这可能由于其他脂溶性成分或是片剂辅
料的干扰 ,其相互作用机制有待于进一步研究 。
参考文献:
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Determinationofdauricinefromphenolicalkaloidsof
MenispermumdauricumtabletsinratplasmabyRP-
HPLC
MADan-feng1 , WANGYun-jun2 , ZHAOHuai-qing1 , JINYu-kun3
(1.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;2.Departmentof
Pharmacy, LiaoheYoutianCentralHospital, Panjin124010, China;3.NortheastPharmacenticalGroup
Co., Ltd., Shenyang110026, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatethemethodfordeterminationofdauricineinratplasmaafterig.adminis-
trationofphenolicalkaloidsofMenispermumdauricumtablets.MethodsProtopinewasusedastheinternal
standard.ThesampleswereseparatedonaDiamonsilC18 column(4.6 mm×200 mm, 5 μm)at30 ℃.The
mobilephaseconsistedofacetonitrile-4% aceticacidandtriethylamine(V∶V∶V=80∶240∶2).Theflowrate
was1.0 mL·min-1 andtheUVabsorbancedetectionwassetat282 nm.ResultsThecalibrationcurveof
dauricinewaslinearintheconcentrationrangeof0.05-5.0mg·L-1(r=0.997 9).Thelowerlimitofquan-
tificationwas50μg·L-1.TheRSDsofinter-andintra-daywerelessthan15%.ConclusionsAsensitive,
preciseandaccuratemethodforthedeterminationofdauricineinplasmaisdescribed, whichcanbeusedin
itspharmacokineticstudies.
Keywords:Menispermumdauricumphenolicalkaloidstablet;dauricine;RP-HPLC;pharmacokinetics
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