全 文 ：第 5 期
第 49 卷第 5期
2010 年 5月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.5
May．，2010
收稿日期：2010－03－08
基金项目：林业公益性行业科研专项（200804001）
作者简介：陈 建（1984－），男，福建福州人，在读硕士研究生，从事生物化学与分子生物学方向研究，（电话）13548685807（电子信箱）
csfucj＠163．com；通讯作者，曹福祥（1962－），男，湖南新化人，教授，博士生导师，主要从事生物化学与分子生物学方向的研究，
（电子信箱）csfucao＠163．com。
观光木（Tsoongiodendron odorum Chun）是木兰
科单种属植物，是我国珍稀孑遗树种，属国家二级
重点保护植物［1］。 由于全球气候变化以及人类活动
等多种原因， 该珍贵树种的自然分布面积不断萎
缩，野生资源受到威胁 ［2］。 黄久香等 ［3，4］利用随机
扩增多态性 DNA（RAPD）标记检测观光木的遗传多
样性特点， 研究观光木的资源保护和发展。 由于
ISSR（inter－simple sequence repeat）和 AFLP（ampli-
fied fragments length polymorphism） 标记的多态性
水平较 RAPD标记高，故采用 ISSR 和 AFLP 标记已
成为研究植物遗传多样性的一个热点 。 ISSR 和
AFLP 标记对基因组 DNA 的质量要求很高，本文利
用改良的 CTAB（Cetyltriethylammonium Bromide，十
六烷基三甲基溴化铵 ） 法提取了观光木基因组
DNA，经检测提取的 DNA 质量较高，能够符合 ISSR
和 AFLP标记的要求， 为研究观光木的遗传多样性
打下了很好的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 观光木 湖南省植物园（样品 1）、江西省九
连山自然保护区（样品 2）、福建省万木林（样品 3）、
海南五指山自然保护区（样品 4）观光木自然居群。
1．1．2 试剂 V（酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）＝25∶24∶1
混合液、Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）、ISSR 随机引物
（上海生工）、MseⅠ（Fermentas）、EcoRⅠ（Fermentas）。
观光木基因组 DNA提取方法的研究
陈 建，曹福祥
（中南林业科技大学，长沙 41004）
摘要：观光木（Tsoongiodendron odorum Chun）植物体内酚类物质和蛋白质含量较高，影响了基因组 DNA
提取的产量。 采用改良 CTAB 法对观光木基因组 DNA 进行提取，经过紫外吸收、琼脂糖凝胶电泳、ISSR
标记和双酶切检测，结果表明，改良 CTAB 法提取的基因组 DNA 吸光值 OD260 ／OD280 为 1．80～1．90，DNA
无降解现象和杂质污染；ISSR－PCR 扩增的条带多而且清晰；基因组 DNA 双酶切彻底。 说明此方法提取
的 DNA 质量较高，符合 ISSR 和 AFLP 标记对基因组 DNA 质量的要求。
关键词：观光木；基因组 DNA；CTAB 法
中图分类号：S687.1；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）05－1035-03
Research on the Isolation of Genomic DNA from Tsoongiodendron odorum Chun
CHEN Jian，CAO Fu－xiang
（Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004， China）
Abstract： Based on the influence of polyphenols in extraction quality of Tsoongiodendron odorum Chun， the routine CTAB
method was improved to extract the genomic DNA of Tsoongiodendron odorum Chun． Its quality was examined by ultraviolet
absorption test， agarose gel eletrophoresis， ISSR marker and double digests． The results showed that the quality of genomic
DNA isolated from the improved CTAB method was higher than the routine’s． The OD260nm ／OD280nm value was 1．80～1．90． Us-
ing it as the template for ISSR－PCR and double digests analysis， many amplified framents was obtained． The author suggests
that it is suitable for subsequent molecular marker experiments．
Key words： Tsoongiodendron odorum Chun； genomic DNA； CTAB method
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.05.034
湖 北 农 业 科 学 2010 年
1．2 方法
1．2．1 观光木基因组 DNA 的提取 参照 Doyle
等 ［5］提取基因组 CTAB方法并作适当改进。 ①在研
磨 时 加 入 少 量 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 （Polyvingl
pyrrolidone，PVP）， 迅速将粉末装入含有 800 μL 已
预热的 CTAB提取液中，充分混匀，65℃水浴中保温
30～60 min，离心；②取上清液于另一只离心管中，加
入 1/10 体积的 5 mol ／ L NaCl 和等体积的 V（酚） ∶
V（氯仿）∶V（异戊醇）＝25∶24∶1混合液抽提，再用等体
积的 V（氯仿）∶V（异戊醇）＝24∶1混合液抽提；③加2 ／
3体积预冷的异丙醇沉淀 DNA，并在－20℃冰箱中放
置 20～30 min 后离心；④分别用 70％和 95％的乙醇
溶液清洗沉淀，倒出溶液，使沉淀干燥至离心管壁
无水珠后， 加入 1 mol ／ L 的 NaCl 溶液 200 μL 和
RNaseA 2 μL在 37℃水浴中消化 12～15h；⑤加 2倍
体积的冷冻无水乙醇沉淀 DNA； 离心后用 70％和
95％的乙醇溶液清洗，干燥后加适量 TE 缓冲液于
－20℃保存。
1．2．2 DNA 的质量检测 用 0．8％的琼脂糖凝胶电
泳及溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）染色，检测提
取基因组 DNA 的质量， 然后在紫外凝胶成像系统
下观察、成像。
1．2．3 观光木基因组 DNA 的浓度检测 取少量
DNA样品溶液用 TE缓冲液稀释， 在紫外分光光度
计上，测定在 260nm和 280nm处的吸光值，根据 R＝
OD260 ／OD280确定 DNA 的纯度，一般认为 R 小于 1．6
则含有较多蛋白质杂质 ，R 大于 2．0 则含有较多
RNA 杂质或基因组 DNA 已断裂成小片段。 根据公
式：DNA浓度（g ／ mL）＝OD260×N（稀释倍数）×50，计算
所提取的 DNA浓度。
1．2．4 ISSR－PCR 检测 以提取的观光木基因组
DNA 为模板，设计 ISSR 总反应体系为 20 μL［6］，包
括 10×PCR Buffer 2 μL、Template DNA（50 ng ／μL）
1 μL、0．2 mmol ／ L dNTPs 0．8 μL、1U Taq DNA聚合
酶 、2μmol ／ L Primer 2．0μL ［（引物 855：5′ －（AC）
8YT－3′）］、1．5 mmol ／ L Mg2＋ 2．0 μL，加 ddH2O 至 20
μL。
PCR 扩增程序 ：94℃预变性 2 min；94℃ 变性
30 s，53℃ 退火 45 s，72℃延伸 3 min，35 个循环 ；
72℃延伸 7 min；4℃保存。
1．2．5 双酶切反应检测 以提取的观光木基因组
DNA 为模板，设计酶切反应体系 25μL［7］，包括 10×
Tango Buffer 2．5 μL、MseⅠ 1 U、EcoRⅠ 5U、Tem-
plate DNA 1μL， 加 ddH2O至 25μL。 反应条件：在
37℃水浴 16 h 后，以 6×Loading Buffer 终止反应，通
过 1．5％琼脂糖电泳检测酶切效果。
2 结果与分析
2．1 改良 CTAB法提取总基因组 DNA的凝胶电泳
改良 CTAB 法提取的基因组 DNA 沉淀为乳白
色胶状，风干后呈透明状。 用 0．8％琼脂糖电泳检测
结果如图 1，DNA 条带清晰，没有 RNA 和蛋白质的
污染， 说明该方法适合于观光木基因组 DNA 的提
取，它可以有效的去除样品中所含的蛋白质、多糖、
酚类等物质，从而获得较高质量的 DNA。
2．2 改良 CTAB法提取总基因组 DNA的紫外检测
将提取的基因组 DNA 稀释后， 在紫外分光光
度计上检测其在 260nm 和 280nm 的吸光值， 计算
OD260 ／OD280值，结果如表 1所示。样品的 OD260 ／OD280
值均为 1．80～1．90， 说明采用改良 CTAB 法提取的
DNA纯度较高，没有蛋白质和 RNA的污染。经计算
所提取的 DNA 浓度均在 200 μg/mL 以上， 均符合
ISSR和 AFLP标记对 DNA质量的要求。
2．3 改良 CTAB 法提取的观光木基因组 DNA 的
ISSR－PCR 检测
观光木基因组 DNA 的 ISSR 扩增结果如图 2
所示，扩增的条带清晰，说明经过改良的 CTAB 法
所提取的 DNA 质量较高，适合于 ISSR 分子标记对
模板 DNA浓度的要求。
2．4 改良 CTAB 法提取的观光木基因组 DNA 的
双酶切
改良 CTAB 法提取的观光木基因组 DNA 经过
MseⅠ和 EcoRⅠ限制性内切酶双酶切结果如图 3
表 1 观光木基因组 DNA 的紫外检测结果
样品来源
样品 1
样品 2
样品 3
样品 4
OD260nm
0.146
0.091
0.093
0.113
OD280nm
0.078
0.050
0.049
0.059
OD260nm/OD280nm
1.87
1.82
1.90
1.92
DNA 浓度//μg/mL
365
228
233
283
M．1kb DNA Ladder Marker；1．样品 1；2．样品 2；3．样品 3；4．样品 4
图 1 观光木基因组 DNA 的电泳图谱
M 1 2 3 4
10 000 bp
5 000 bp
1 000 bp
1036
第 5 期
所示，条带呈一片弥散状，说明基因组 DNA 酶切完
全 ， 该法所提取的 DNA 浓度达到 AFLP 标记对
DNA 质量的要求，为今后利用 AFLP 标记技术奠定
了基础。
3 讨论
酚类、 糖类等物质能与 DNA 发生不可逆转的
结合， 使 DNA 埋在这些粘稠的胶状物质中难以溶
解或产生不同程度的褐变，影响 DNA 的质量，对反
应体系中的酶活产生抑制作用，严重影响分子生物
学研究的下游工作［7］。 本实验结合常规 CTAB 法并
加以改进，在提取观光木基因组 DNA 过程中，加入
1％～2％PVP 作为酚类物质结合剂，可吸附多酚分子
上的氢键，形成水不溶性复合物［8］，从而有效防止样
品在提取过程中多酚类物质氧化成醌［9］。 同时加大
提取缓冲液中 β－巯基乙醇的浓度，也可以对酚类物
质的氧化起到很好的抑制作用［10］。
除此之外， 本实验采用 3×CTAB 提取缓冲液，
使材料与缓冲液充分反应，DNA 的提取量明显增
加；加入 5 mol ／ L NaCl 溶液，提供一个高盐环境，使
DNP（deoxy－ribonucleorpotein，脱氧核糖核蛋白）充
分溶解于液相中，能有效去除多糖类物质。 在抽提
过程中，先使用 V（酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）＝25∶24∶1
混合液抽提，再用 V（氯仿）∶V（异戊醇）＝24∶1 混合液
抽提，可有效去除酚类、蛋白质等杂质，纯化后的
DNA样品条带清晰，无杂蛋白等物质。 效果要明显
优于只用 V（氯仿）∶V（异戊醇）＝24∶1 混合液进行抽
提的效果；将 RNaseA 的消化时间延长为 12h 以上，
使样品中的 RNA能够完全消化。
采用改良的 CTAB 法提取观光木叶片 DNA，操
作过程简便，提取的 DNA 质量非常理想，尤其对于
大量样本 DNA 提取时，该方法优点显得尤为突出。
高质量的观光木基因组 DNA 的提取不但为今后观
光木种质资源研究及分子生物学等方面的研究奠
定了基础，同时对于含色素、酚类、糖类等次生代谢
物质多的植物 DNA 的提取提供了一定的参考价
值。
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M．100bp DNA Ladder Marker；1．样品 1；2．样品2；3．样品 3；4．样品 4
图 2 观光木基因组 DNA 的 ISSR－PCR 扩增
M．100bp DNA Ladder Marker； 1．样品 1；2．样品 2；3．样品 3；4．样品 4
图 3 观光木基因组 DNA 双酶切
M 1 2 3 4
1 000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
M 1 2 3 4
1 000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
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