全 文 ：两种火炭母基因组 DNA提取方法的对比研究
刘静华
（韶关学院 英东生命科学学院， 广东 韶关 512005）
收稿日期：2014-01-18
作者简介：刘静华（1980-），女，广东龙川人，韶关学院英东生命科学学院实验师，主要从事分子生物学、基因工程方面的研究.
韶关学院学报·自然科学
Journal of Shaoguan University·Natural Science
2014年 4月
第 35卷 第 4期
Apr.2014
Vol.35 No.4
摘要：火炭母富含有多酚、多糖等次生代谢产物.这些次生代谢产物对火炭母基因组 DNA 提取的质量与产量有较大
影响.以火炭母的成熟叶片，幼嫩叶片、幼嫩茎尖为实验材料，采用改良 SDS法和 CTAB法，对火炭母进行基因组 DNA
提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计法测定其浓度和纯度，对提取效果进行比较，以期得到
提取火炭母基因组 DNA的最佳方法.
关键词：火炭母；基因组 DNA；提取
中图分类号：Q93-33 文献标识码：A 文章编号：1007-5348（2014）04-0056-04
火炭母为蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）植物火炭母草（Polygonum chinense Linn.）.别名火炭藤、
火炭毛等.性味寒、微酸、涩.具有清热祛湿、凉血解毒、明目、止痒等功效.用于痢疾、咽喉肿痛、流行性腮腺
炎、扁桃腺炎、肝炎等疾病的治疗.火炭母对于金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠埃氏菌、痢疾杆菌、枯草杆菌等
具有一定的抑菌活性，有较好的药用价值.而要对火炭母进行分子生物学的研究，首要条件是提取到质量
好、产量高的基因组 DNA.虽然目前植物 DNA 的提取纯化方法比较成熟，但对不同的植物而言，提取效果
相差很大.火炭母全草含多种多酚类物质［1］，如蒽醌、黄酮苷、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、鞣花酸、3-O-甲基
鞣花酸、逆没食子酸、没食子酸、山奈酚-7-葡萄糖苷等；多糖类物质如 L-肌醇、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、
麦芽糖、L-鼠李糖、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等；非皂化部分含 β-谷甾醇等；根和根茎含多种氨基酸.这些多
酚类与多糖类物质加大了提取火炭母基因组 DNA 的难度.本文选择了改良 SDS 法［2］和 CTAB 法［3］，以火炭
母的成熟叶片、幼嫩叶片、幼嫩茎尖为实验材料，进行基因组 DNA 提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完
整性，紫外分光光度计法测定其浓度和纯度，对提取效果进行比较，以期得到提取火炭母基因组 DNA 的最
佳方法.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野外采集到生长良好、无表观病变的火炭母全株，保留根部土壤，移至室内培养数天.选取其成熟叶片、
幼嫩叶片、幼嫩茎尖作为实验原材料.
CTAB、SDS、PVP、β－巯基乙醇、Tris·HCl 、EDTA、核酸染料购自北京鼎国公司，氯仿、异戊醇、无水乙
醇、氯化钠、醋酸钠、醋酸钾均为市售分析纯.配制用水为去离子水并经高压灭菌.
1.2 仪器设备
高速冷冻离心机（上海安亭 TGL-16G），电泳仪（北京六一仪器厂 DYY-11型），电泳槽（北京六一 DYC-
33A型），紫外可见分光光度计（光谱仪器公司 752型），紫外分析仪（北京六一仪器厂 WD-9403 型），高压灭
菌锅（上海申安医疗器械厂 ZDX-35BI 型），恒温干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司 200AB-2 型），电子分
第 4期
析天平（上海恒平 JA5003型）等.
1.3 基因组 DNA提取方法
实验采用改良 SDS法、CTAB法提取火炭母基因组 DNA.每种方法每种样品进行 3次重复.
预处理：将新鲜的火炭母幼嫩叶片、成熟叶片、幼嫩茎尖分别用液氮加 PVP 干粉研磨成粉末，每种样品
均采用改良 SDS法、CTAB法提取其基因组 DNA.
CTAB 法：准确称取 100 mg 植物组织干粉于 1.5 ml 离心管中，加入 500 μL 65℃的 CTAB 提取液（2%
CTAB，3%可溶性 PVP，2%β-巯基乙醇，100 mmol·L-1 Tris·HCl pH8.0，25 mmol·L-1 EDTA pH8.0） 充分混匀，
65 ℃保温 30 min，降至室温后加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），温和颠倒混匀，4 ℃，12 000 rpm 离心 15 min，
取上清于另一离心管，加入两倍体积的无水乙醇，轻混匀，静置 10 min,有白色絮状沉淀出现，4 ℃，10 000
rpm离心 5 min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀 2次，乙醇彻底干燥后沉淀溶于 50 μLTE缓冲液中，4 ℃保存.
改良 SDS法：准确称取 100 mg植物组织干粉于 1.5 mL离心管中，加入 500 μL预冷的提取液（3%可溶
性 PVP，2%β-巯基乙醇，50 mmol·L-1 Tris·HCl pH8.0，50 mmol·L-1 EDTA pH8.0）充分混匀，冰上放置 10 min
后，4 ℃，6 000 rpm 离心 5 min，弃上清.再次加入 500 μL 上述提取液重悬沉底，离心后弃上清，沉淀中加入
500 μl 65 ℃预热的裂解缓冲液 （15%SDS，100 mmol·L-1 Tris·HCl pH8.0，20 mmol·L-1 EDTA pH8.0，500
mmol·L-1 NaCl）颠倒混匀，65 ℃保温 45 min，期间不时颠倒混匀，降至室温后加入等体积氯仿/异戊醇（24:
1），颠倒混匀. 4 ℃，10 000 rpm 离心 10 min，取上清，加入 0.1（v/v）5 mol·L-1KAc（pH4.8）,加入等体积-20 ℃
预冷的异丙醇.-20 ℃静置 30 min 后,4 ℃，12 000 rpm 离心 20 min，70%乙醇洗涤 2 次， 乙醇彻底干燥后沉
淀溶于 50 μlTE缓冲液中，4 ℃保存.
1.4 DNA完整性检测
取 5 μL DNA样品按 6×loadingbuffer的比例混合，点入含 0.5 μg·mL-1核酸染料的 1.0%琼脂糖凝胶中，
1×TBE 中 5 v/cm稳压电泳 50 min后，在紫外检测仪上观察.
1.5 DNA纯度和浓度检测［4］
吸取 5 μL DNA 样品，加 TE 缓冲液至 1 mL 混匀，测定 OD260 nm 和 OD280 nm，取得紫外线吸收值的
比值（OD260/OD280）；DNA浓度的计算公式：双链 DNA浓度（μg·μL-1）=OD260×样品稀释倍数×50/1 000.
2 结果与分析
2.1 电泳实验
用 2种方法提取幼嫩叶片、成熟叶片、幼嫩茎尖的 DNA琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图 1.
图 1 2 种提取方法的 DNA 电泳图
注：1，2，3 为改良 SDS 法、4，5，6 为 CTAB 法；1，4 为幼嫩叶片、2，5 为成熟叶片、3，6 为幼嫩茎尖；M 为分子量标记.
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韶关学院学报·自然科学 2014年
如图 1 所示，6 个 DNA 条带均较明亮、整齐，无明显拖尾现象，说明 6 个样品液中的 DNA 片段比较完
整，多酚类次生代谢产物去除得比较干净，并且无 RNA 残留.但样品 1、2、3 的点样孔附近有微弱的亮带，说
明此 3 种样品液中残留少量蛋白质；样品 4、5、6 点样孔附近无明显亮带出现，说明此 3 种样品液中蛋白质
去除干净.另外，CTAB 法的 DNA 条带更粗更亮，说明样品液中 DNA 含量更高.SDS 法的 DNA 泳道有隐约
的拖尾现象，可能是由于 SDS十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）作为离子型表面活性剂，在 55 ℃～65 ℃
条件下，能够溶解细胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使染色体 DNA 离析.但此过程反应比较剧烈，可
能会使大分子 DNA 发生断裂，因此提取物中含少量小片段 DNA；或者可能是由于操作过程中核酸酶未彻
底清除.而 CTAB 作为一种阳离子去污剂，能与核酸形成复合物，在低盐溶液（NaCl 浓度＜0.3 mol·L-1）中，此
复合物会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐浓度（NaCl 浓度＜0.7 mol·L-1）中会解离，从而使 DNA 分子与蛋
白质和多糖分开.在经酚、氯仿、异戊醇抽提去除蛋白质，最后用乙醇沉淀 DNA.由于 CTAB-核酸复合物的
形成能较好地保护大分子 DNA，所以 CTAB法的 DNA泳道没有拖尾现象.
电泳结果反映 CTAB法提取的火炭母叶片基因组 DNA的纯度和含量都高于改良 SDS法.
2.2 紫外分光光度计检测
紫外分光光度计检测吸光度及相应处理结果如表 1所示.
表 1 2 种提取方法的 DNA 吸光度检测结果
由于核酸分子含有的嘌呤环及嘧啶环的共价双键，在 260 nm 波长有特异的吸收峰，其吸光度与核酸
的浓度成正比.OD260相当于 dsDNA 50 μg·mL-1，ssDNA 33 μg·mL-1和 ssRNA 40 μg·mL-1.可以此来计算核
酸样品的浓度.紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260 nm 和 280 nm 的紫外线吸收值
的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，纯的 DNA 制品的比值为 1.8，RNA 的比值为 2.0，若 DNA 高于 1.8，则
可能有 RNA污染，低于 1.8则有蛋白质和酚污染.
如表 1 所示， 改良 SDS 法提取火炭母幼嫩叶片 DNA 的平均 OD260/OD280 比值为 1.739， 成熟叶片为
1.720 均低于 1.8，说明有酚类和蛋白质的污染，可能由于火炭母叶片的成熟程度影响了 DNA 提取的质量.
实验材料 提取方法 OD260 平均 OD260 OD280 平均 OD280
平均 OD260/
OD280
DNA 浓度/
μg·μL-1
平均 DNA
浓度/μg·μL-1
幼嫩叶片
改良 SDS 法
0.615
0.612
0.355
0.352 1.739
1.230
1.2240.610 0.350 1.220
0.611 0.351 1.222
CTAB 法
0.785
0.785
0.425
0.4256 1.843
1.570
1.5690.783 0.422 1.566
0.786 0.430 1.572
成熟叶片
改良 SDS 法
0.567
0.565
0.326
0.328 1.720
1.134
1.1300.562 0.330 1.124
0.566 0.327 1.132
CTAB 法
0.739
0.737
0.405
0.403 1.827
1.478
1.4730.737 0.401 1.474
0.734 0.404 1.468
幼嫩茎尖
改良 SDS 法
0.693
0.690
0.377
0.375 1.841
1.386
1.3810.690 0.373 1.380
0.688 0.376 1.376
CTAB 法
0.790
0.794
0.433
0.437 1.817
1.580
1.5880.794 0.438 1.588
0.798 0.440 1.596
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第 4期
新生组织的次生代谢产物比较少， 成熟叶片的酚类、 多糖等次生产物含量较高. 但幼嫩茎尖 DNA 比值为
1.841 接近 1.8，说明纯度较好，可能是由于茎尖的次生代谢产物含量较少，正处于细胞分裂旺盛的幼嫩茎
尖 DNA 含量更高. 而 CTAB 法提取火炭母幼嫩叶片 DNA 的平均 OD260/OD280比值为 1.843， 成熟叶片的为
1.827，幼嫩茎尖的为 1.817，接近 1.8，表示 DNA 污染少，纯度高，说明 CTAB 法提取火炭母 DNA 时去除蛋
白质、次生代谢产物的效果优于改良 SDS法.
根据 OD260nm 计算 DNA浓度，改良 SDS 法提取火炭母幼嫩叶片 DNA 平均浓度为 1.224 μg·μL-1，成熟
叶片的为 1.130 μg·μL-1， 幼嫩茎尖的为 1.381 μg·μL-1.CTAB 法提取火炭母幼嫩叶片 DNA 平均浓度为
1.569 μg·μL-1，成熟叶片的为 1.473 μg·μL-1，幼嫩茎尖的为 1.588 μg·μL-1.说明 CTAB 法提取火炭母 DNA
的效率高于改良 SDS法.
3 结论
植物 DNA 提取方法很多，不同植物，甚至是同一类植物，但组织材料的来源、部位、形态等外在性质的
不同以及化学成分、次生产物，组织结构等内在特点的差异，在提取基因组 DNA 时选用的方法都有不同.本
文的实验表明火炭母基因组 DNA提取用 CTAB法优于改良 SDS法.
火炭母叶片富含酚类及多糖等次生代谢产物.幼嫩茎尖不仅细胞分裂旺盛、DNA 含量高，而且酚类和
多糖含量较少，提取 DNA 效果较好，但由于茎尖数量少取材较难.幼嫩叶片数量较多，次生产物也较少，是
提取火炭母 DNA的理想材料. DNA提取过程操作的关键：使用的研钵、枪头、药勺、离心管要经过严格的灭
菌.操作要在低温环境中进行，尽量防止内源 Dnase和外界杂质的干扰.操作要温和，研磨时要快速且用力适
当，避免破坏 DNA分子.
两种提取 DNA 的方法在液氮研磨及提取缓冲液中都加入了 PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP 能与多酚类
结合成复合物，防止多酚氧化褐变，并能去除多糖；而 β-巯基乙醇作为强还原剂能打断多酚氧化酶的二硫
键而使之失活，以防止多酚的氧化.二者同用，有效地抑制多酚类物质对 DNA 的影响，提高提取 DNA 的纯
度.对于如火炭母一类次生产物中酚类与多糖含量较高的植物，提取 DNA 时，可加入 1%～6%的 PVP，同时
抽提液中使用巯基乙醇来抑制氧化作用.
参考文献：
［1］谢贤强，吴萍.火炭母化学成分的研究［J］.热带亚热带植物学报，2007,15（5）：450-454.
［2］丁芳林，彭书练.黄芩高质量 DNA 提取方法研究［J］.湖南农业科学，2010（13）：23-25.
［3］杨松杰.药用绞股蓝属植物基因组 DNA 提取方法比较［J］.陕西农业科学，2013（1）：87-89.
［4］高洪晓，杨凯.3 种植物 DNA 提取法中多糖类物质去除效果的研究［J］.北京农学院学报，2011，26(1)：70-72.
Study on two DNA extraction methods of Polygonum chinense Linn
LIU Jing-hua
（Yingdong College of Bioscience，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）
Abstract: Polygonum chinense Linn contains rich polyphenols polysaccharide secondary metabolites, which
influences greatly the quality and quantity of its DNA extraction. Taking the mature leaves, the young leaves
and young stem tip as the raw materials of the experiment, and adopting the method of improved SDS and
CTAB, a better way is made to extract the DNA of Polygonum chinense Linn, whose complicity has been
detected by agarose gel electrophoresis and density and purity by ultraviolet spectrophotometer method.
Key words: Polygonum chinense Linn; genome DNA; extraction
（责任编辑：邵晓军）
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