全 文 ：第 35 卷第 5 期
2016 年 10 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Ｒesources
Vol． 35 No． 5
Oct． 2016
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2016． 05． 003
收 稿 时 间:2016 － 03 － 28
基 金 项 目:江苏省中医药局科技项目(LB 13037);江苏省江苏大学第 13 批大学生科研立项资助项目(13A167)。
作 者 简 介:朱媛媛(1992—)，女，在读硕士研究生，主要从事中药活性成分研究及新药开发。E － mail:1462936884@ qq． com
* 通讯作者:赵明(1962—)，男，主任中药师，硕士研究生导师，主要从事中药活性成分研究及新药开发工作。
E － mail:anchorage8@ 126． com
响应面法优化合萌总黄酮提取工艺
朱媛媛1，赵 明1，2* ，欧阳臻1，蔡建明1，张 成1，周文菊1，刘江弟1，杨 倩1，王琳玮1
(1． 江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013;2． 江苏大学附属医院，江苏 镇江 212013)
摘 要 目的:利用响应面法优化合萌中总黄酮的提取工艺条件。方法:通过单因素试验分别考察提取时间、乙醇
体积分数、液固比、提取温度及提取次数对合萌总黄酮得率的影响，并选取提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取
温度为影响因子，应用响应面法优化提取工艺。结果:合萌总黄酮的最佳提取条件为:提取时间 60 min，乙醇浓度
65%，液固比(g∶ mL)25∶ 1，提取温度 90 ℃，在此条件下，合萌总黄酮得率为 4． 08 mg /g，接近模型预测值 4． 11 mg /g。
结论:响应面法在一定程度上可以提高合萌总黄酮得率，表明响应面法用于合萌总黄酮提取工艺的优化具有可
行性。
关键词 合萌;总黄酮;响应面法
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2016)－ 05 － 0009 － 05
Optimization of Extraction for Flavonoids from Aeschynomene indica L．
by Ｒesponse Surface Methodology
Zhu Yuanyuan1，Zhao Ming1，2* ，Ouyang Zhen1，Cai Jianming1，Zhang Cheng1，
Zhou Wenju1，Liu Jiangdi1，Yang Qian1，Wang Linwei1
(1． School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;
2． Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)
Abstract Objective:Ｒesponse Surface Methodology (ＲSM)was used to optimize the extraction tech-
nology of total flavonoids from Aeschynomene indica L． ． Methods:In single － factor tests，extraction
time，ethanol concentration，liquid － solid ratio，extraction temperature and extraction times on yield of
total flavonoids were explored． Among them，extraction time，ethanol concentration，liquid － solid ratio
and extraction temperature were selected as influencing factors during extraction． The extraction technolo-
gy was optimized by ＲSM． Ｒesults:The optimal extraction conditions of total flavonoids were extraction
time of 60 min，ethanol concentration of 65%，liquid － solid ratio (g∶ mL)of 25∶ 1，extraction tempera-
ture of 90 ℃ ． Under the optimal conditions，the yield of total flavonoids was 4． 08 mg /g，which was
close to the predicted value (4． 11 mg /g)． Conclusion:ＲSM can improve the yield of total flavonoids in
a certain extent，which indicated that ＲSM is feasible to optimizing the extraction technology of total fla-
vonoids from Aeschynomene indica L． ．
Key words Aeschynomene indica L．;flavonoids;Ｒesponse Surface Methodology (ＲSM)
合萌为豆科蝶形花亚科合萌属植物合萌(Ae-
schynomene indica L．)的干燥全草，又名田皂角，俗
称水槐。味甘、苦，性微寒，归肺、胃经。全草入药，
具有清热利湿，祛风明目，通乳等功效。能治水肿腹
胀、肿毒、湿疹、胆囊炎、尿道感染或结石、肾炎水肿
等［1］。分析研究表明，黄酮类化合物具有抗菌、抗
氧化自由基活性、保肝作用、抗骨质疏松作用、抗肿
瘤等多种药理作用［2 － 6］，但合萌中黄酮类化合物的
—9—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 35 卷
研究尚未有文献报道。本实验首先采用单因素试验
分析提取时间、乙醇体积分数、液固比、提取温度及
提取次数对合萌总黄酮得率的影响，并选取提取时
间、乙醇体积分数、液固比、提取温度 4 个因素为影
响因子，采用 Box － Behnken 设计建立数学模型，以
合萌总黄酮得率为响应值，采用 Design Expert 软件
进行数值分析，得出最优提取工艺条件，为合萌总黄
酮的进一步开发和研究提供参考。
1 实验仪器和材料
1． 1 仪器与设备
SHB － 111 循环水式多用真空泵，郑州长城科
工贸有限公司;HHS － 1 恒温水浴锅，上海浦东跃新
科学仪器厂;AE240 分析天平，上海梅特勒 －托利多
仪器有限司;1810 － B型自动双重纯水蒸馏器，上海
申立玻璃仪器公司;DHG － 9240A 型电热恒温鼓风
干燥箱，上海恒科学仪器有限公司;UV － 2102PCS
型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)分析仪器有
限公司;旋转蒸发仪，瑞士 BUCHI 公司;H66 MC 超
声清洗机，无锡超声仪器厂。
1． 2 药品与试剂
合萌(采收于江苏省丹阳市导墅镇，经欧阳臻
教授鉴定为合萌 Aeschynomene indica L．);芦丁对照
品，中国食品药品检定研究院，批号:100080 －
200707;三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇等试剂
均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司;蒸馏
水为实验室自制。
2 方法与结果
2． 1 溶液制备
2． 1． 1 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的芦丁对照品 15． 2 mg，
置 25 mL 容量瓶中，加 70%乙醇使之溶解，并稀释
至刻度，摇匀，作为对照品母液，备用。
2． 1． 2 供试品溶液的制备
干燥的合萌全草经粉碎，过 20 目筛，备用。精
密称取合萌干燥粉末 2． 0 g，置于 100 mL 圆底烧瓶
中，按照一定的提取温度、提取时间、乙醇体积分数、
液固比、提取次数进行回流提取，趁热抽滤，合并提
取液，将滤液浓缩后，转移至 50 mL的容量瓶，定容，
摇匀，作为供试品溶液，备用。
2． 2 标准曲线的绘制
精密量取芦丁对照品溶液 6 份(0． 0、0． 5、1． 0、
1． 5、2． 0、2． 5 mL)，分别加入 25 mL 容量瓶中，加
70%乙醇至 6 mL，加入 5% 亚硝酸钠 1 mL，摇匀，放
置 6 min，再加 10% 硝酸铝 1 mL，摇匀，放置 6 min，
再加 1 mol /L 氢氧化钠 10 mL，70%乙醇定容至刻
度，摇匀，放置 15 min，于 510 nm 波长下测吸光度。
以对照品溶液浓度为横坐标 x，吸光度测定值为纵
坐标 y，绘制标准曲线，如图 1 所示。用最小二乘
法计算得到回归方程为 y = 0． 0129x － 0． 0373，r =
0． 9996。在 12． 16 ～ 60． 80 μg /mL 范围内芦丁对照
品浓度与吸光度呈良好的线性关系。
图 1 芦丁标准曲线
2． 3 合萌总黄酮含量测定
精密量取供试品溶液 5． 0 mL，根据亚硝酸钠 －
硝酸铝法，即“2． 2”项下的方法测定吸光度，计算合
萌总黄酮含量，按以下公式计算合萌总黄酮得率。
P =
C × V1 ×
V2
V3
M × 1000
式中:P 为合萌总黄酮的得率(mg /g)，C 为从
回归方程计算求得样品溶液的浓度(μg /mL)，V1 为
样品溶液定容体积(mL)，V2 为提取液定容体积(mL)，
V3 为取样溶液体积(mL)，M为合萌粉末质量(g)。
2． 4 单因素试验设计
2． 4． 1 提取温度对合萌总黄酮得率的影响
以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取时间 60
min，乙醇体积分数 70%，液固比 20 ∶ 1，提取次数 2
次的条件下，考察不同提取温度(60、70、80、90、100
℃)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提取
温度变化结果如图 2 所示。
结果表明，当温度低于 80 ℃时，随温度的上
升，总黄酮得率变化不大，当温度高于 80℃时，随温
度的上升总黄酮得率显著升高，并在 90 ℃时达到最
高值，但当温度高于 90 ℃时，总黄酮得率反而下降，
这可能是由于温度过高导致可溶性蛋白变性，影响
细胞的破裂，导致总黄酮溶出减少，从而降低了合萌
总黄酮得率［7］。因而确定最佳提取温度为 90 ℃。
—01—
第 5 期 朱媛媛，等:响应面法优化合萌总黄酮提取工艺
图 2 提取温度对合萌总黄酮得率的影响
2． 4． 2 提取时间对合萌总黄酮得率的影响
以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度 90
℃，乙醇体积分数 70%，液固比 20∶ 1，提取次数 2 次
的条件下，考察不同提取时间(30、45、60、75、90
min)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提
取时间变化结果如图 3 所示。
结果表明:随时间增加，合萌总黄酮提取率先上
升后下降，60 min时达到最高点，提取时间过长或过
短时，合萌总黄酮得率均较低。这可能是由于提取
时间过短时，合萌总黄酮提取不充分，而时间过长
时，合萌总黄酮受热时间过长，其中主要成分部分发
生分解。因而确定最佳提取时间为 60 min。
图 3 提取时间对合萌总黄酮得率的影响
2． 4． 3 乙醇体积分数对合萌总黄酮得率的影响
以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度 90
℃，提取时间 60 min，液固比 20∶ 1，提取次数 2 次的
条件下，考察不同的乙醇体积分数(50%、60%、
70%、80%、90%)对合萌总黄酮得率的影响。总黄
酮得率随乙醇体积分数变化结果如图 4 所示。
结果表明:当乙醇体积分数较小时，合萌总黄酮
得率随乙醇体积分数的增加而上升，且当乙醇体积
分数为 70%时达到最高;当乙醇体积分数大于 70%
时，合萌总黄酮得率随乙醇体积分数的增加反而下
降，且下降幅度很大。造成这种现象可能是由于乙
醇体积分数过大时，醇溶性杂质或色素等成分溶出
增加，从而使合萌总黄酮得率下降。因而确定最佳
乙醇体积分数为 70%。
图 4 乙醇体积分数对合萌总黄酮得率的影响
2． 4． 4 液固比对合萌总黄酮得率的影响
以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度 90
℃，提取时间 60 min，乙醇体积分数 70%，提取次数
2 次的条件下，考察不同液固比(10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、
25∶ 1、30∶ 1)对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得
率随液固比变化结果如图 5 所示。
结果表明，合萌总黄酮得率随液固比的增加而
增加，但当液固比大于 25 时，总黄酮得率趋于稳定。
在实际操作中，既要考虑总黄酮得率，又要避免溶剂
浪费，因而确定最佳液固比为 25∶ 1。
图 5 液固比对合萌总黄酮得率的影响
2． 4． 5 提取次数对合萌总黄酮得率的影响
以合萌总黄酮得率为指标，在固定提取温度 90
℃，提取时间 60 min，乙醇体积分数 70%，液固比
25:1 的条件下，考察不同的提取次数(1、2、3、4 次)
对合萌总黄酮得率的影响。总黄酮得率随提取次数
变化结果如图 6 所示。
结果表明:合萌总黄酮得率随提取次数增加而
增加，但增幅逐渐减小。从图中可以看出提取 3 次
后，曲线基本趋于稳定，即总黄酮得率趋于稳定，因
而视作提取 4 次后已提取完全。经计算得知提取一
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 35 卷
次后转移率为 73 ． 98%，提取 2 次后转移率达到
91． 02%，这表明提取两次后，合萌中总黄酮已基本
转移完全。因而确定最佳提取次数为 2 次。
图 6 提取次数对合萌总黄酮得率的影响
2． 5 响应面试验设计优化合萌总黄酮提取工艺
2． 5． 1 响应面试验设计因素水平
依据单因素试验结果确定因素水平范围，利用
Design － Expert Software 8． 0． 6 为辅助手段设计响应
面试验。根据中心组合设计原理，以提取温度、提取
时间、乙醇体积分数、液固比 4 个因素为自变量，合
萌总黄酮的得率为响应值，设计了 4 因素 3 水平共
29 个试验点的响应面分析试验，其中 24 个为析因
试验，5 个为中心试验，其因素水平分析选取见表 1。
表 1 响应面因素水平编码
因素 代码 编码水平－ 1 0 1
提取温度 /℃ A 80 90 100
提取时间 /min B 45 60 75
乙醇体积分数 /% C 60 70 80
液固比 D 20∶ 1 25∶ 1 30∶ 1
2． 5． 2 模型方程的建立与方差分析
按照“2． 5． 1”项下进行响应面分析试验，方法
与结果见表 2，方差分析结果见表 3。采用 Design －
Expert(8． 0． 6 版本)软件对实验结果进行分析，以
总黄酮得率为响应值，对实验数据进行二元多项式
回归拟合，得出回归方程为:
Y =3． 96 + 0． 12A + 0． 066B － 0． 50C + 0． 058D
－ 0． 027AB － 0． 077AC － 0． 070AD + 0． 030BC +
0． 040BD －0． 075CD －0． 65A2 － 0． 21B2 － 0． 53C2 －
0． 20D2
式中:Y为总黄酮得率，A 为提取温度，B 为提
取时间，C为乙醇体积分数，D为液固比。
表 2 响应面分析试验结果
试验序号
编码水平
A B C D
黄酮得率 /
(mg·g － 1)
1 － 1 － 1 0 0 2． 83
2 1 － 1 0 0 3． 18
3 － 1 1 0 0 3． 08
4 1 1 0 0 3． 32
5 0 0 － 1 － 1 3． 71
6 0 0 1 － 1 2． 82
7 0 0 － 1 1 3． 84
8 0 0 1 1 2． 61
9 － 1 0 0 － 1 2． 86
10 1 0 0 － 1 3． 16
11 － 1 0 0 1 3． 24
12 1 0 0 1 3． 26
13 0 － 1 － 1 0 3． 72
14 0 1 － 1 0 3． 74
15 0 － 1 1 0 2． 68
16 0 1 1 0 2． 82
17 － 1 0 － 1 0 3． 04
18 1 0 － 1 0 3． 45
19 － 1 0 1 0 2． 25
20 1 0 1 0 2． 35
21 0 － 1 0 － 1 3． 45
22 0 1 0 － 1 3． 49
23 0 － 1 0 1 3． 50
24 0 1 0 1 3． 70
25 0 0 0 0 3． 97
26 0 0 0 0 3． 99
27 0 0 0 0 3． 91
28 0 0 0 0 4． 02
29 0 0 0 0 3． 93
表 3 方差分析结果
来源 平方和(SS) 自由度(df) 均方(MS) F P(Pr ＞ F)
Model 7． 186 338 14 0． 513 31 99． 609 64 ＜ 0． 000 1＊＊＊
A 0． 168 033 1 0． 168 033 32． 607 48 ＜ 0． 000 1＊＊＊
B 0． 052 008 1 0． 052 008 10． 092 41 0． 006 7＊＊
C 3． 010 008 1 3． 010 008 584． 103 1 ＜ 0． 000 1＊＊＊
D 0． 040 833 1 0． 040 833 7． 923 857 0． 013 8*
AB 0． 003 025 1 0． 003 025 0． 587 012 0． 456 3
AC 0． 024 025 1 0． 024 025 4． 662 139 0． 048 7*
AD 0． 019 6 1 0． 019 6 3． 803 451 0． 071 5
BC 0． 003 6 1 0． 003 6 0． 698 593 0． 417 3
BD 0． 006 4 1 0． 006 4 1． 241 943 0． 283 9
CD 0． 022 5 1 0． 022 5 4． 366 207 0． 055 4
A2 2． 729 309 1 2． 729 309 529． 632 3 ＜ 0． 000 1＊＊＊
B2 0． 292 676 1 0． 292 676 56． 794 79 ＜ 0． 000 1＊＊＊
C2 1． 804 335 1 1． 804 335 350． 137 8 ＜ 0． 000 1＊＊＊
D2 0． 262 495 1 0． 262 495 50． 938 17 ＜ 0． 000 1＊＊＊
残差 0． 072 145 14 0． 005 153
失拟项 0． 064 225 10 0． 006 422 3． 243 687 0． 134 0
纯误差 0． 007 92 4 0． 001 98
总离差 7． 258 483 28
注:＊＊＊P ＜ 0． 001 为极显著，＊＊P ＜ 0． 01 为高度显著，* P ＜ 0． 05 为显著。
—21—
第 5 期 朱媛媛，等:响应面法优化合萌总黄酮提取工艺
由表 3 方差分析结果可知，回归模型是极显著
的(P ＜ 0． 001)，同时该模型的相关系数 r = 0． 990
1，CV值为 2． 17%。说明该模型能够反映响应值的
变化，而且方程的失拟项(P = 0． 134 0)不显著，表明
该方程对实验拟合情况好、误差小，因此可用该回归
方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。
2． 5． 3 响应曲面的分析
根据回归方程，作出响应面和等高线，考察拟合
响应面的形状，分析提取温度、提取时间、乙醇体积
分数、液固比对合萌总黄酮提取得率的影响。各因
素及其相互作用对相应值的影响可以通过各图直观
反应出来。Design － Expert Software 8． 0． 6 软件处理
后三维响应面和等高线图见图 7 ～ 12。
根据图 7 ～ 12 及表 3 可知，一次项中，乙醇体积
分数(C)、提取温度(A)对总黄酮得率的线性效率
极显著(P ＜ 0． 001)，提取时间(B)对总黄酮得率的
线性效率高度显著(P ＜ 0． 01)，液固比(D)对总黄
酮得率的线性效率显著(P ＜ 0． 05)，二次项中，A2、
B2、C2 和 D2 影响均极显著(P ＜ 0． 001)，交互项按
影响大小排列依次为 AC、CD、AD、BD、BC、AB，其中
提取温度和乙醇体积分数交互项即 AC 对合萌总黄
酮的提取率有显著影响，其他交互项均不显著，表明
各因素对黄酮得率不是简单的线性关系。同时，由
F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，4 个
因素对总黄酮提取得率影响的排序为乙醇体积分数
(C)＞提取温度(A)＞提取时间(B)＞液固比(D)。
2． 6 验证实验
由 Design － Expert 8． 0． 6 软件分析得出合萌总
黄酮的最优提取工艺为:提取温度 91． 06 ℃，提取时
间 62． 02 min，乙醇体积分数 65． 05%，液固比 26． 16
∶ 1，其总黄酮得率为 4． 11 mg /g。根据实际情况可
将条件优化为提取温度 90 ℃，提取时间 60 min，乙
醇体积分数 65%，液固比 25∶ 1。在此优化条件下，
进行 3 次平行实验进行验证，结果表明合萌平均总
黄酮得率为 4． 08 mg /g，与模型预测值的误差为 0．
73% ，说明该方程与实际情况拟合较好。
3 结论与讨论
响应面分析克服了正交设计在考虑因素间交互
作用时，如果任意安排正交表中各列因素将会导致
交互效应与其它效应混杂的缺陷。响应面分析法是
(下转第 19 页)
—31—
第 5 期 田雪冰，等:设施栽培下 3 个品种番木瓜的营养成分分析
指标均具有显著性差别。
3． 3 3 种引进的番木瓜品种的果实和海南“大青”
相比，除了“红日”品种的粗多糖含量比海南“大青”
高之外(差异不显著，P = 0． 111)，其余测定指标海
南“大青”品种均比引进栽培品种高。
综上所述，番木瓜在南果北种后，其品质比海南
栽培的要差些，这可能是由于番木瓜还未完全适应
宁波气候、土壤等环境因素，导致品种的变异，也可
能是由于本地番木瓜的栽培技术还不是很成熟及番
木瓜的习性等原因导致的番木瓜品质下降。在今后
的设施栽培中须加强水肥管理、授粉、病虫害防治及
采收等一系列实用设施栽培技术的研究，进一步提高
其品质，真正实现热带水果之王在宁波的扎根落户。
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2011．
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研究几种因素间交互作用的回归分析方法［8］。本实验采用单因素试验和响应面分析法对合萌总黄酮的提
取工艺进行优化，并结合实际情况得出最优条件:提取温度 90 ℃，提取时间 60 min，乙醇体积分数 65%，液
固比 25∶ 1，在此优化条件下，总黄酮得率为 4． 08 mg /g。回归分析和验证试验结果表明，模型拟合情况好、实
验误差小，可用于实际预测，从而也说明了采用响应面分析法中 Box － Behnken 对合萌总黄酮提取条件进行
优化合理可行，具有一定的实际应用价值。
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