全 文 ：第 34卷 第 5期
2015年 10月
Vol．34 No．5
Oct．2015
天 津 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
·中药研究·
摘要：[目的]研究凹叶厚朴叶总黄酮纯化工艺。[方法]采用大孔树脂纯化方法，考察大孔树脂静态和动态吸附
对凹叶厚朴总黄酮纯度的影响，并比较凹叶厚朴叶总黄酮纯化前后的总黄酮纯度及其 DPPH和 ABTS体外模型的
抗氧化活性。[结果]确定最佳型号大孔树脂为 HPD722大孔树脂，其对凹叶厚朴叶总黄酮具有较好的纯化作用，最
佳纯化工艺为上样液浓度为 0.12 g/mL，以 2 BV/h上样，上样体积为 5.5倍柱体积，用 3.5倍柱体积 10%乙醇除去杂
质，再用 4倍柱体积 50%乙醇洗脱。凹叶厚朴叶总提物经 HPD722大孔树脂纯化后总黄酮纯度由原来的 27.44%提
高到 61.67%，且清除 DPPH自由基能力纯化后[IC50为（19.97±0.85）mg/L]较纯化前[IC50为（44.88±1.31）mg/L]强，清
除 ABTS自由基能力纯化后[IC50为（169.78±0.99）mg/L]较纯化前[IC50为（592.2±13.14）mg/L]也得到提高。[结论]
HPD722大孔树脂可以作为凹叶厚朴叶总黄酮纯化的吸附剂，为凹叶厚朴叶总黄酮资源开发提供依据。
关键词：凹叶厚朴叶；总黄酮；纯化工艺；抗氧化活性
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1673－9043（2015）05－0286-05
凹叶厚朴叶总黄酮纯化工艺研究 *
易 骏 1，吴岩斌 2，吴锦玉 2，王 涛 3
（1．福建教育学院，福州 350025；2．福建中医药大学，福州 350122；3．天津中医药大学，天津 300193）
*基金项目：福建省重点高校服务海西建设项目之五（GX－
HX201201-05）。
作者简介：易 骏（1966-），女，副教授，主要从事药用植物资
源及其化学研究。
通讯作者：王 涛，E-mail: wangt@263.net; 吴岩斌，E-mail:
wxsq1@163.com。
厚朴为木兰科多年生落叶乔木，主要分布在长
江以南，多有栽培，资源丰富。一般需要 12 a树龄以
后的厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹叶
厚 朴 （Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba
Rehd.et Wils.），其入药部位干燥干皮、根皮及枝皮活
性成分稳定 [1]，期间，每年秋季厚朴叶自然凋落腐
烂。厚朴叶为大型叶，长 20~45 cm，宽 10~25 cm，生
物量较大，引起人们对厚朴叶资源利用价值研究的
兴趣。近年来研究表明，厚朴叶主要含有木脂素类、
黄酮类、生物碱类和挥发油等成分[2-6]，具有抗菌、镇
咳、抗氧化和血管舒张等作用[7-10]，其中总黄酮含量
约为 5.01%[11]。因此，有必要研究其总黄酮的纯化工
艺，为进一步开发利用凹叶厚朴叶总黄酮资源提供
依据。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂 凹叶厚朴叶采自福建省南平市
光泽县境内，经福建中医药大学药学院杨成梓副教
授鉴定为凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.
var.biloba Rehd.et Wils．） 的干燥叶。D101、AB-8、
HPD - 100、HPD - 722、HPD - 400、HPD - 400A、
DM130、DM301型大孔吸附树脂：沧州宝恩吸附材
料科技有限公司。槲皮苷对照品（自制），ABTS试剂
（美国 Sigma 公司），DPPH（日本和光纯药株式会
社），BHT（海华蓝生物科技有限公司，批号 26973），
甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等皆为分
析纯。
1.2 仪器与设备 UV-1800紫外可见分光光度计
（日本岛津公司），SHB-Ш循环水式多用真空泵（郑
州长城科技工贸有限公司），RZ01C旋转蒸发器（郑
州长城科技工贸有限公司），HH-S恒温水浴锅（郑
州长城科技工贸有限公司），KQ-500E超声波清洗
器（昆山市超声仪器有限公司），AR2130千分之一
天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]，CP225D十万分
之一天平（德国赛多利斯），ELIX5 纯水制备系统
（厦门精艺兴业科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备 凹叶厚朴叶粗粉经乙醇
浓度为 75%回流提取 3次，过滤，合并滤液，回收小
体积，3 600 r/min的速度离心 10 min，得凹叶厚朴叶
样品液，浓度为 0.12 g/mL，备用。
2.2 大孔树脂的预处理 根据购于沧州宝恩吸附
材料科技有限公司的树脂预处理方法：在树脂柱内
加入高于树脂层 10 cm的乙醇浸泡 4 h，放出浸液，
至洗涤液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用
DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.05.08
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紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止。再用水洗涤至
乙醇含量小于 1%，即可使用。
2.3 大孔树脂的静态吸附
2.3.1 最佳大孔树脂考察 于 100 mL三角瓶中装
入已处理好的干树脂各 1 g，加入凹叶厚朴叶样品液
20 mL，置于摇床中振荡 24 h，测定滤液中总黄酮的
浓度。过滤上述树脂，加入 100 mL 95%乙醇，置于摇
床中振荡 24 h，测定滤液中总黄酮的浓度。通过计
算树脂的吸附率和解吸附率确定最佳树脂。由表 1
可知，弱极性的 HPD722、非极性的 HPD100、极性的
HPD600、中极性的 HPD400A和非极性的 HP20对
凹叶厚朴叶总黄酮吸附能力较强；而弱极性的
DM130、弱极性的 HPD722、中极性的 HPD400、中极
性的 DM301 和中极性的 HPD400A 解吸性能效果
较好。综合比较，选用效果较好的 HPD722 和
HPD400A两种树脂进行静态动力吸附过程研究，以
筛选出最佳的大孔树脂。见表 1。
2.3.2 大孔树脂静态吸附考察 于 100 mL三角瓶
中装入已处理好的干树脂各 1 g，加入凹叶厚朴叶
样品液 20 mL，置于摇床中振荡，每隔 1 h测定厚朴
叶中总黄酮浓度，然后计算吸附率，得到静态等温
吸附曲线。见图 1。
综合以上因素考虑，HPD722大孔树脂具有较
高的吸附率和解吸附率，故选 HPD722大孔树脂纯
化凹叶厚朴叶总黄酮工艺。
2.4 大孔树脂的动态吸附
2.4.1 上样浓度考察 取已处理好的 6份干树脂,
每份 7 g，分别湿法装柱（20 mm×28 cm，填装柱体积
为 36 mL，柱高 18 cm），加凹叶厚朴叶总黄酮样品
液稀释为含生药 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、
0.14 g/mL的溶液各 20 mL上样，以 1 BV/h的流速进
行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至洗脱液
无色，再用 100 mL 95%乙醇洗脱，测定总黄酮回收
率，选择最佳上样浓度。结果如图 2所示，随着上样
液浓度的增加，总黄酮回收率明显增加，且达到一
定浓度，总黄酮回收率增加不明显，当上样液浓度
为 0.1 g/mL时，总黄酮回收率最高。考虑到，上样量
小，不利于大规模生产，且上样液浓度为 0.12 g/mL
的总黄酮回收率与 0.1 g/mL 相当，综合考虑，应选
取 0.12 g/mL为最佳上样浓度。见图 2。
2.4.2 上样流速考察 取已处理好的 4份干树脂,
每份 7 g，分别湿法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品
液含生药 0.12 g/mL，各 20 mL，分别以 1、2、3、4 BV/h
流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至
洗脱液无色，再用 100 mL 95%乙醇洗脱，测定总黄
酮回收率，选择最佳上样流速。结果如图 3所示，随
着上样流速的增加，总黄酮回收率明显下降；考虑
到大规模生产，且上样流速为 1 BV/h的总黄酮回收
率与 2 BV/h相当，综合考虑，应选取 2 BV/h为最佳
上样流速。
表 1 不同型号大孔树脂的吸附率及解吸附率（x±s）
树脂型号 极性 吸附率（%） 解吸附率（%）
DM130 弱极性 81.50±4.56 94.75±6.23
HPD722 弱极性 88.79±4.32 91.29±4.32
HPD600 极性 87.94±6.75 86.03±7.28
HPD400 中极性 85.34±8.54 94.07±5.98
D101 非极性 85.93±7.65 88.58±6.45
HPD100 非极性 88.99±4.58 90.73±7.51
HPD400A 中极性 86.19±6.58 93.52±6.12
HP20 非极性 87.10±6.23 89.71±3.75
DM301 中极性 82.67±3.24 93.33±5.68
AB-8 弱极性 83.71±4.32 89.44±7.58
图 1 两种树脂的静态等温吸附曲线
图 2 上样浓度对回收率的影响
上样液浓度（g/mL）
图 3 上样流速对回收率的影响
上样流速（BV/h）
总
黄
酮
回
收
率
（
%）
88
86
84
82
80
1 2 3 4
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2.4.3 大孔树脂动态吸附曲线考察 取已处理好
的干树脂 7 g，湿法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品
液含生药 0.12 g/mL 20 mL，以 2 BV/h的流速进行动
态吸附，每 0.5 BV收集 1个流份，测定总黄酮的浓
度，得到动态吸附曲线。结果如图 4所示，随着总黄
酮上样量的增加，流出液中总黄酮的量也随之增
加；当上样量为 1 BV时有少量总黄酮流出，上样量
达到 5.5 BV时出现明显泄漏点（泄漏点为初始浓度
的 1/10），由此确定凹叶厚朴叶总黄酮上样液的最
大体积为 5.5 BV。
2.4.4 洗脱溶剂考察 取已处理好的干树脂 7 g,湿
法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品液含生药0.12 g/mL，
以 2 BV/h的流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸
馏水洗脱至洗脱液无色，合并洗脱液；再分别用
10%、30%、50%、75%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱
液，测定洗脱液中总黄酮的回收率。结果如图 5所
示，厚朴叶总黄酮主要集中在 10%～50%，10%乙醇
洗脱液较少总黄酮，且颜色深，表明含有许多的杂
质。因此，洗脱时，先用蒸馏水洗至无色后，用 10%乙
醇洗去杂质，再用 50%乙醇洗脱得到总黄酮。
2.4.5 洗脱剂用量考察 取已处理好的干树脂 7 g，
湿法装柱，加厚朴叶总黄酮样品液含生药 0.12 g/mL，
以 2 BV/h的流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸
馏水洗脱至洗脱液无色，再用 50%乙醇洗脱，每0.5 BV
收集 1份，测定收集液总黄酮的浓度。结果如图 6
所示，当洗脱剂用量达到 4 BV时，厚朴叶总黄酮基
本洗脱完全，所以洗脱剂用量为 4 BV。
2.5 纯化前后凹叶厚朴叶总黄酮纯度的测定 取
2.1项制备供试品溶液 3份，浓度为 0.12 g/mL，以
2 BV/h上样，上样体积为 5.5倍柱体积，用 3.5倍柱
体积 10%乙醇除去杂质，再用 4倍柱体积 50%乙醇
洗脱，最终得到纯化后的总黄酮，经减压浓缩，得到
总黄酮浸膏，备用。测定纯化前后总黄酮纯度，结果
见表 2。
2.6 纯化前后凹叶厚朴叶总黄酮抗氧化活性评价
2.6.1 供试品制备 纯化前后纯度分别为 27.44%
和 61.67%的总黄酮浸膏，备用。
2.6.2 抗氧化活性的测定 清除 DPPH自由基分别
取 2mL不同浓度供试品的甲醇溶液（20~100 mg/L），加
入 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液 2 mL，避光反应
30 min，以 2 mL不同浓度的 BHT为阳性对照，空白
对照用 80%甲醇代替样品溶液，80%甲醇调 0，在
517 nm波长处测吸光度。以样品浓度和清除率计算
IC50值。清除 DPPH自由基的能力用半数抑制率 IC50
表示，IC50越小，清除自由基的能力越强。
DPPH自由基清除活力（％）＝（1-A1/A0）×100
式中：A0为空白对照的吸光度，A1为供试品的
吸光度。
通过对纯化前后总黄酮清除 DPPH 自由基测
定，结果如表 3、图 7，凹叶厚朴叶总黄酮具有清除
DPPH自由基的活性，并在实验浓度范围内均呈明
显量效关系。纯化后总黄酮清除 DPPH自由基活性
较强，其 IC50 为（19.97±0.85）mg/L，纯化前总提物
IC50为（44.88±1.31）mg/L。可见纯化后总黄酮清除
DPPH自由基活性大大提高。
总
黄
酮
浓
度
（
g/
L）
图 4 HPD722动态吸附曲线
柱体积（BV）
图 5 洗脱溶剂对回收率的影响
总
黄
酮
回
收
率
（
%）
乙醇浓度（%）
总
黄
酮
浓
度
（
g/
L）
图 6 洗脱剂用量对回收率的影响
柱体积（BV）
表 2 纯化前后凹叶厚朴总黄酮的纯度（x±s）
浸膏质量
（mg）
浸膏中总黄酮质量
（mg）
总黄酮纯度
（%）
1 872.61±57.33 513.95±23.05 27.44±0.42
856.04± 6.99 529.74±10.35 61.88±0.74
纯化前后
纯化前
纯化后
n
3
3
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表 3 凹叶厚朴叶总黄酮对 DPPH和 ABTS自由基的
清除作用（x±s）
自由基 纯化前的 IC50 纯化后的 IC50 BHT的 IC50
DPPH 44.88± 1.31 19.97±0.85 11.13±0.10
ABTS 592.2±13.14 169.78±0.99 90.70±0.98
图 7 凹叶厚朴总黄酮纯化前后对 DPPH自由基的清除作用
浓度（mg/L）
浓度（mg/L）
图 8 凹叶厚朴叶总黄酮纯化前后对 ABTS自由基的
清除作用
清除 ABTS 自由基 取 7 mmol/L 的 ABTS 与
2.45 mmol/L 过硫酸钾等体积混合 23 ℃暗处反应
12~16 h，得到 ABTS+。用蒸馏水稀释 ABTS+溶液使
其在 734 nm下的吸光值在 0.7±0.02之间。取 ABTS+
溶液（吸光度在 0.7±0.02内）3.9 mL加入 0.1 mL 80%
甲醇溶解的不同浓度的供试品溶液（100~900 mg/L），
摇匀，23 ℃放置 6 min，在 734 nm波长处测吸光度。
用 80%甲醇代替样品作为空白对照。清除 ABTS自
由基的能力用半数抑制率 IC50表示，IC50越小，清除
自由基的能力越强。
ABTS自由基清除率（%）=（A0－A1）×100/A0
式中：A0为空白吸光值；A1为样品吸光值。
通过对纯化后总黄酮清除 ABTS自由基测定，
结果如表 3、图 8，凹叶厚朴叶总黄酮具有清除
ABTS自由基的活性，并在实验浓度范围内呈明显
量效关系。纯化后总黄酮清除 ABTS自由基活性较
强，其 IC50为（169.78±0.99）mg/L、纯化前总提取物
IC50为（592.2±13.14）mg/L。可见纯化后总黄酮清除
ABTS自由基活性大大提高。
3 讨论
目前分离纯化总黄酮方法主要有柱层析法、大
孔树脂吸附法、高速及高效逆流色谱、薄层层析、双
水相萃取法等方法[12]，其中大孔树脂吸附法具有快
速、高效、方便、灵敏、选择性好等，而且再生处理比
较方便，成本较低，因此被广泛用于分离纯化中药
活性成分，但不同型号的大孔树脂，其纯化活性成
分的条件差异较大[13]，因此，在应用大孔树脂进行分
离纯化时要对树脂的型号进行选择[14]。不同型号大
孔树脂主要是由于大孔树脂比表面积、表面电性、
能否与化合物形成氢键吸附等[13]，因此需要考察大
孔树脂对被纯化产生动态吸附和静态吸附的影响，
进而提高对中药活性成分的纯化率[15]。在实验室考
察指标设置上充分考虑工业化生产的需求，同时要
注意大孔树脂重复使用对工业生产中降低生产成
本、节约工时和提高生产效率的意义[16]。按照吸附
率、解吸附率方法确定最佳型号大孔树脂为
HPD722大孔树脂，其对凹叶厚朴叶总黄酮具有较
好的纯化作用，凹叶厚朴叶总提物经 HPD722大孔
树脂纯化后总黄酮纯度由原来的 27.44%提高到
61.67%，而且抗氧化活性得到提高，主要是基于黄
酮类化合物因具有酚羟基等结构，表现良好的抗氧
化活性[17-18]。
自由基与许多疾病的产生有关，如肿瘤、心脑
血管疾病、白内障、慢性炎症等疾病[19]。近年来，很多
来自自然植物中的提取物已经被证明具有较好的
抗氧化活性[1]，其中黄酮类化合物在心血管系统作
用和抗肝脏毒作用等方面有着广泛的生理活性[20]。
凹叶厚朴叶含有较高的黄酮，并可获得纯度达到
61.67%的黄酮纯度，因此有必要深入开展凹叶厚朴
叶高纯度黄酮的生理活性研究。
参考文献：
[1] 曾燕如,童再康,朱玉球,等. 树龄与厚朴质量关系的研
究[J].中药材,1999,22(8):379-381.
[2] 杨红兵,石 磊,李明明,等.湖北恩施产厚朴叶中厚朴酚
与和厚朴酚定量分析[J].湖北中医药大学学报, 2012,14
(1):43.
[3] 龙 飞,卫莹芳,刘 永,等.厚朴叶化学成分的初步研究[J].
华西药学杂志,2010,25(4): 387-388.
[4] Pyo MK,Yun-Choi HS,Hong YJ.Antiplatelet activities of a－
porphine alkaloids isolated from leaves of Magnolia obovata [J].
Planta Med,2003,69 (3) :267-269.
[5] 卢永书,方小平,胡光平.凹叶厚朴各部位挥发油成分比
较研究[J].光谱实验室, 2011,28(6): 3139-3142.
mg/L
抑
制
率
（
%）
100
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
纯化前
纯化后
BHT
抑
制
率
（
%）
纯化前
纯化后
BHT
120
100
80
60
40
20
0
0 200 400 600 800 1000
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天 津 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
[6] 吴锦玉,吴岩斌,易 骏,等. 凹叶厚朴叶的化学成分研
究[J].中草药,2013,44(21):2965-2968.
[7] 姜 宁,刘晓鹏,滕建勋,等.紫油厚朴叶提取物对马铃薯
青枯病菌的抑制作用及防病效果[J].植物保护, 2008,34
(2):58-60.
[8] 卫莹芳,龙 飞,谢达温,等.厚朴叶和皮不同提取部位的
药理作用比较研究[J].天然产物研究与开发,2007,19(5):
772-775.
[9] 邓 芬,张芳芹,张家蓉,等.不同月份厚朴叶多糖体外清
除羟自由基作用[J].安徽农业科学,2011,39(26): 22303-
22304.
[10] 杨竹雅,卫莹芳,周志宏,等.厚朴叶中具血管舒张作用的
化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2012,24(3): 298-
302.
[11] 吴锦玉,吴岩斌,吴建国,等.厚朴叶总黄酮的超声提取工
艺研究[J].福建中医药,2013,44(4):51-52.
[12] 郭雪峰,岳永德.黄酮类化合物的提取分离、纯化和含量
测定方法的研究进展[J].安徽农业科学, 2007, 35(26):
8083-8086.
[13] 刘 虹,杨 虹,王 萌,等.大孔树脂纯化香加皮提取物
的工艺考察[J].天津中医药大学学报 , 2006,25(3):188-
190.
[14] 国家食品药品监督管理局.应用大孔吸附树脂分离纯化
工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）[J].中国食
品卫生杂志,2005, 17(4):373-374.
[15] 李雪茹,刘 虹,姜 佳,等.不同厂家 D101大孔树脂对
赤芍提取物纯化工艺考察[J].天津中医药大学学报,2014,
33(1):49-51.
[16] 刘 虹,王 萌,郝 彧,等.大孔树脂纯化赤芍提取物的
工艺考察[J].天津中医药大学学报,2009,28(3):142-145.
[17] Foroogh B, Abbas FM, AlKarkhi, et al. Antioxidant activity
and phenolic content of various date palm (Phoenix dactylif－
era) fruits from Iran[J]. Food Chemistry, 2008,107:1636-
1641.
[18] 王春鹏,朱子微,李 晋,等.金银花抗氧化活性整合指纹
图谱的建立及其在质量评价中应用[J].天津中医药大学
学报，2014,33(5):291-295.
[19] 袁 蓉,郭丽丽,郜凤香.痰瘀与自由基的关系探讨[J].天
津中医药大学学报,2014,33(4):242-245.
[20] 董小萍.天然药物化学[M].北京:中国中医药出版社,2010:
25.
（收稿日期：2015-05-25）
Study on purification of the total flavonoids from leaves of Magnolia officinalis var. biloba
YI Jun1，WU Yan-bin2，WU Jin-yu2，WANG Tao3
（1. Department of Chemistry and Life Science, Fujian Institute of Education, Fuzhou 350025, China;
2. Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine,
Fuzhou 350122, China; 3.Research Institute of Chinese Medicine, Tianjin University of
Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China）
Abstract: [Objective] To purify total flavonoids from leaves of Magnolia officinalis var. biloba. [Methods] The
effect of macroporous resin static and dynamic adsorption on the purity of total flavonoids from leaves of Magnolia
officinalis var. biloba. was carried out. Before and after purification of total flavonoids, their purities and antioxidant
activities using DPPH and ABTS models in vitro were compared. [Results] The best macroporous resin was HPD722
resin that had good effect on purification of total flavonoids. The best purification was 0.12 g/mL sample concentration
and 2 BV/h. The sample volume was 5.5 times the column volume. 10% EtOH of 3.5 times the column volume was
used to remove the impurity, and then, 50% EtOH of 4 times the column volume was used to elute. The purity of total
flavonoids of 75% EtOH extracts from leaves of Magnolia officinalis var. biloba.was purified from 27.44% to 61.67%.
The scavenging ability (IC50) of DPPH free radical and ABTS free radical were from 44.88±1.31 μg/mL to 19.97±
0.85 μg/mL and from 592.2±13.14 μg/mL to 169.78±0.99 μg/mL, respectively. [Conclusion] HPD722 macroporous
resin can be used as the adsorbent to purify the total flavonoids from leaves of Magnolia officinalis var. biloba. This
result provides the basis for the development of resources of the total flavonoids from leaves of Magnolia officinalis
var. biloba.
Key words: leaves of Magnolia officinalis var. biloba.; total flavonoids; purification; antioxidant activity
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