全 文 ：中国医药生物技术 2014 年 12 月第 9 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2014, Vol. 9, No. 6 453
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.007 ·论著·
螃蟹甲内生真菌 Chaetosphaeronema sp. 的
化学成分研究

温欣，张大为，郭顺星，王春兰

【摘要】
目的 研究一株来源于藏药螃蟹甲内生真菌 PHY-24 的化
学成分。
方法 采用麦麸培养基，对内生真菌 PHY-24 进行放大培
养，通过硅胶柱色谱、MCI 柱色谱、ODS 柱色谱、Sephadex
LH-20 柱色谱、高效液相色谱等对其发酵液中的化学成分
进行分离纯化，利用 NMR、MS 等波谱方法进行化学成分
的结构鉴定，并测定这些成分抗 HIV-1 整合酶链转移反应
活性。
结果 从内生真菌 PHY-24 发酵液的乙酸乙酯提取部分
分离并鉴定了 4 个化合物，分别是：integrastatin B（1）、
2- 乙酰基 -3,5- 二羟基 - 苯乙酸（ 2 ）、 curvulin （ 3 ）、
O-methylcurvulinic acid（4）。其中化合物（1）和（2）具有
抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性，其 IC50 分别为 6.22 和
75.1 μmol/L。
结论 4 个化合物均为从此属真菌中首次分得，其中化合物
（1）、（2）具有抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性。化合物
（2）的活性为首次报道。
【关键词】 内生真菌； 化学成分； 螃蟹甲
www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2014, 9(6):453-456

内生真菌是指那些在其生活史中某一段时期
生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害
症状的真菌，包括在其生活史中的某一阶段营表生
的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原
真菌和菌根菌[1]。尽管内生真菌广泛存在于自然
界中，但很长时间内没有被重视。直到 1993 年，
美国科学家 St ier le 等 [ 2 ]从红豆杉的内生真菌
Taxomyces andreanae 中分离得到了具有抗癌活性
的紫杉醇，内生真菌代谢产物的重要性才逐渐被发
掘。因存在于宿主植物内，内生真菌可以产生与宿
主植物相同或相近的代谢产物，有时也能产生新
的天然产物，成为天然产物的又一大资源库[2-3]，
而且内生真菌具有易培养、培养条件可控、产量
较高的特点。国内外已有大量文献报道了从植物
内生真菌中分离得到多种活性化合物[4]。本科室
从螃蟹甲中分离并鉴定了内生真菌 PHY-24
（Chaetosphaeronema sp.），并测定其发酵产物具有
良好的抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性[5]。基于上
述背景，本研究对其发酵产物化学成分进行研究。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 螃蟹甲内生真菌 Chaetosphaeronema
sp. 菌株由中国医学科学院药用植物研究所生物中
心分离保藏，由本科室张大为鉴定。
1.1.2 仪器 Varian unity 600 型核磁共振仪为美
国 Varian 公司产品；AGZAB 2F 型质谱仪为英国
VG 公司产品；Waters 600 高效液相色谱仪、
XBridge C18 分析型色谱柱（4.6 mm × 150 mm，
5 μm）、XBridge C18 制备色谱柱（18 mm × 150 mm，
4 μm）为美国 Waters 公司产品；Phenomenex
Synergi Hydro-RP C18 分析型色谱柱（4.6 mm ×
250 mm，5 μm）、Phenemonex Hydro 制备色谱柱
（21.20 mm × 250 mm，4 μm）为美国 Phenomenex
公司产品；Pump Manager C-615 中压色谱柱为瑞士
Buchi 公司产品。
1.1.3 试剂 分析纯石油醚、乙酸乙酯、二氯甲
烷、甲醇、丙酮购自北京化工厂；色谱纯甲醇购自
美国 Burdick & Jackson 公司；薄层色谱硅胶板
GF254、柱色谱硅胶 H、300 ~ 400 目硅胶、200 ~
300 目硅胶均购自青岛海洋化工厂；Sephadex
LH-20 购自美国 Pharmacia 公司；核磁试剂
（CDCl3、CD3OD、氘代试剂作为内标）购自美国
Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 放大发酵 按照每升麦麸培养基含 30 g
麦麸、20 g 葡萄糖、1.5 g MgSO4·7H2O、3 g KH2PO4

作者单位：100193 北京，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研
究所分析中心
通讯作者：王春兰，Email：wangchunlan2006@163.com
收稿日期：2014-04-17
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的配方制备培养基。从平板 PDA 培养基上挑取
PHY-24 菌块接种到装有 150 ml 麦麸培养基的
250 ml 三角瓶中，采用摇床振荡培养 2 ~ 3 d，摇
床转速控制在 120 r/min，培养温度设定为 25 ℃。
将培养好的 PHY-24 菌种液每瓶转接至装有 2.5 L
麦麸培养基的 5 L 三角瓶中，采用摇床振荡培养
17 ~ 18 d，摇床转速控制在 120 r/min，培养温度设
定为 25 ℃。每一批次的 PHY-24 放大发酵物为
10 L，共得发酵物 30 L。
1.2.2 提取分离 用尼龙布分离 PHY-24 发酵液
和菌丝体。发酵液加入 1 倍体积乙酸乙酯，萃取
浓缩得乙酸乙酯提取物 20 g。取 10 g 提取物采用
硅胶柱色谱纯化，以石油醚:乙酸乙酯（5:1），二
氯甲烷:甲醇（10:1），甲醇进行梯度洗脱，共得
14 流分。Fr8（0.8 g）经 Sephadex LH-20（甲醇）
及制备 HPLC（90% 甲醇-水，流速 8 ml/min）得
化合物 1（31 mg）。另取 10 g 提取物采用 MCI 柱
色谱纯化，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，共得 9 流
分。Fr3（0.21 g）析出晶体，经重结晶得化合物 2
（27 mg）。Fr4（0.35 g）经 HPLC 制备（55% 甲
醇-水，流速 10 ml/min）得化合物 3（22 mg）和
化合物 4（34 mg）。
1.2.3 抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性测定 参
照 He 等[6]建立的 HIV-1 整合酶链转移反应活性
检测方法。反应在 96 孔透明微孔板中进行。用
1 × 反应缓冲液（25 mmol/L 哌嗪-1,4-二乙磺酸、
10 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 g/L BSA、5% 无菌甘油、
20 mmol/L MnCl2）100 μl 洗板一次。加入 5 μl 用
DMSO 配制的待测样品（阳性对照组为 50 mmol/L
的黄芩素，阴性对照组为溶剂 DMSO）至微孔
板中，与整合酶在 2 × 反应缓冲液中 37 ℃ 温育
20 min。加入 1.5 pmol/L 供体 DNA 和 15 pmol/L
靶 DNA 底物，混匀后 37 ℃ 反应 2 h。加入 1.5 μl
链霉亲和素磁珠和 51.5 μl 结合缓冲液[10 mmol/L
Tris-HCl，pH 7.6，2 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，

0.1%（w/v）吐温 20]彻底振荡混匀，20 ℃ 孵育
15 min，每隔 5 分钟振荡混匀一次。将微孔板置于
板式磁珠收集器静置 90 s，弃上清液。用 100 μl
TBST（含 0.1% Tween 20 的 Tris-HCl 缓冲盐溶
液）洗磁珠 3 次。加入 100 μl 用 TBST 按照
1:5000 稀释的碱性磷酸酶标记的地高辛抗体，振
荡混匀后于 37 ℃ 孵育 30 min。100 μl TBST 洗磁
珠 3 次，将磁珠转移到新的微孔板中。加入 100 μl
显色底物缓冲液（6.7 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠、
0.1 mol/L Na2CO3、2 mmol/L MgCl2，pH 9.5），避光
显色 30 min。用酶标仪测定 405 nm 处的吸光值
（A405）。用以下公式计算药物对肿瘤细胞的抑制
率，并通过非线性拟合计算 IC50。
A阴性对照 － A样品 抑制率 =
A阴性对照 － A阳性对照
× 100%

2 结果
2.1 结构鉴定
化合物 1：棕色粉末（TCM），ESI-MS m/z:403
[M+H]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）δ：1.94（3H，
s，H-19），2.20（3H，s，H-18），3.81（3H，s，
H-21），3.82（3H，s，H-22），7.11（1H，s，H-7），
7.21（1H，s，H-13），10.29（1H，s，H-20）。13C-NMR
（CDCl3，600 MHz）δ：25.58（C-19），26.07（C-18），
56.26（C-21），56.48（C-22），77.40（C-10），97.04
（C-2），101.57（C-7），105.41（C-13），120.00（C-8），
120.01（C-3），120.99（C-11），125.62（C-12），139.31
（C-4），139.34（C-16），139.87（C-15），140.59
（C-5），146.97（C-14），147.51（C-6），190.41（C-20），
193.18（C-9）。与文献[7]数据基本一致，故鉴定为
integrastatin B（图 1A）。
化合物 2：白色粉末（MeOH），ESI-MS m/z:211
[M+H]+。1H-NMR（MeOH，600MHz）δ：6.27（1H，
d，J = 2.4，H-8），6.21（1H，d，J = 2.4，H-6），
3.65（2H，s，H-2），2.52（3H，s，H-2）。13C-NMR

A B
图 1 化合物 1（A）和 2（B）结构式
Figure 1 The molecular structures of compound 1 (A) and 2 (B)
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（MeOH，600MHz）δ：206.15（C-1），175.27（C-1），
161.91（C-7），161.03（C-5），137.94（C-3），120.58
（C-4），l12.03（C-8），102.71（C-6），40.79（C-2），
32.38（C-2）。与文献[8-9]数据基本一致，故鉴定
为 curvulin acid，即 2-乙酰基-3,5-二羟基苯乙酸
（图 1B）。
化合物 3：无色片状结晶（MeOH），ESI-MS
m/z:239[M+H]+。参考文献[9]鉴定为 curvulin。
化合物 4：白色粉末（MeOH 或 DMSO），
ESI-MS m/z:225[M+H]+。与文献[9]数据基本一致，
故鉴定为 O-methylcurvulinic acid。
2.2 HIV-1 整合酶链转移反应抑制剂筛选
采用高通量 ELISA 方法测定了化合物的抗
HIV-1 整合酶链转移反应活性。结果表明，化合物
1、2 具有抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性，IC50
分别为 6.22 和 75.1 μmol/L。其余 2 个化合物均
无此活性。

3 讨论
从藏药螃蟹甲内生真菌 PHY-24 发酵产物
乙酸乙酯提取物中分离得到 4 个化合物，均为
Chaetosphaeronema sp. 中首次分得。这 4 个化合
物文献报道仅从微生物中得到[7-12]。到目前为止，
integrastatin B 报道具有抗 HIV-1 整合酶活性，其
IC50 为 2.5 μmol/L[7]；curvulin acid 未见任何活性
报道；curvulin、O-methylcurvulinic acid 仅被报道
为植物毒素，可致马齿苋和多刺苋菜黑斑病[10]。
对上述化合物进行抗 HIV-1 整合酶链转移
反应活性筛选，结果显示化合物 1 具有明显的
抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性，其 IC50 为
6.22 μmol/L，与文献[7]报道基本一致；化合物 2
的抗 HIV-1 整合酶链转移反应活性较微弱，其
IC50 为 75.1 μmol/L，为本文首次报道。
目前，针对 PHY-24 菌株活性代谢产物的研
究仍在继续，以期发现其他的活性成分。

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Chemical constituents of an endophytic fungus Chaetosphaeronema sp. from Phlomis
younghusbandii Mukerjee
WEN Xin, ZHANG Da-wei, GUO Shun-xing, WANG Chun-lan

【Abstract】
Objective To study the chemical constituents of an endophytic fungus PHY-24 (Chaetosphaeronema sp.) from Tibetan medicinal
plants Phlomis younghusbandii Mukerjee.
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Methods PHY-24 culture was scaled-up using wheat bran medium. The chemical constituents from the fermentation broth of the
strain PHY-24 were isolated and purified by silica gel, MCI, ODS and Sephadex LH-20 column chromatography, and their chemical
structures were identified by analysis of MS and NMR. Bioactivities of the constituents were tested with anti-HIV-1 integrase strand
transfer reaction.
Results Four compounds were separated and identified from the fermentation broth, including integrastatin B, curvulin acid,
curvulin, O-methylcurvulinic acid. Integrastatin B and curvulin acid have anti-HIV-1 activity with IC50 being 6.22 μmol/L and
75.1 μmol/L, respectively.
Conclusion The four compounds were firstly obtained from the Chaetosphaeronema genus, with integrastatin B and curvulin acid
having anti-HIV-1 integrase strand transfer reaction activity. The activity of curvulin acid was firstly reported.
【Key words】 Endophytic fungus; Chemical constituents; Phlomis younghusbandii Mukerjee
Author Affiliation: Analysis Center, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking
Union Medical College, Beijing 100193, China
Corresponding Author: WANG Chun-lan, Email: wangchunlan2006@163.com
www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2014, 9(6):453-456





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杨晓明当选疫苗专业委员会主任委员

10 月 29 日，疫苗专业委员会换届工作会议在南京召开，会议由协会吴朝晖秘书长主持，彭玉理事长出席会议并致辞。
会议首先听取了第一届委员会主任委员赵铠院士的工作报告，随后经过两轮民主选举，产生了新一届委员会，共 37 位委员。
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常务委员。与会委员均表示今后将积极参加分会各项活动，利用这个平台，为我国疫苗事业的发展作出贡献。




我会筹备迎接民政部第二次对社会组织评估工作

民政部民间组织管理局今年重新修订了社会组织的评估标准，并于近日发出通知，对第一批通过评估的社会组织进行第
二次评估工作。社会组织评估是加强社会组织规范化管理的重要举措，也是落实各项培育扶持政策的基础，对于推动社会组
织的组织建设、制度建设和能力建设，增强社会组织服务社会的功能十分必要。我会于 2008 年参加了首次评估，获得 AAA
等级。目前我会正在根据有关通知的要求，认真准备材料，做好自评和参评的准备工作。民政部在评估过程中还将随机抽取
会员单位，听取会员和理事单位对协会的评价。