全 文 ：第４０卷　第４期
２０１２年７月
河南师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
　 Ｖｏｌ．４０　Ｎｏ．４
　 Ｊｕｌｙ．２０１２
　　文章编号：１０００－２３６７（２０１２）０４－０１２４－０３
外界因子对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响
王淑芳１，张仁波２，窦全丽２
（１．嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴３１４００１；２．遵义师范学院 生物系，贵州 遵义５６３００２）
摘　要：目的：研究不同外界因子对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响．方法：研究不同基本培
养基、ｐＨ值、碳源及激素对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响．结果：３０ｇ·Ｌ－１蔗糖、ｐＨ　５．８的
１／２ＭＳ培养基最适合毛状根生长，但黄酮类化合物合成最高时ｐＨ值为６．４．外源激素ＮＡＡ、ＧＡ对毛状根的生长有
促进作用，ＧＡ效果最为明显．结论：初步优化了粘毛黄芩毛状根的培养条件，为实现粘毛黄芩黄酮类化合物大规模
生产奠定了基础．
关键词：粘毛黄芩；毛状根；黄酮类化合物
中图分类号：Ｑ７８９ 文献标志码：Ａ
粘毛黄芩（Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ　ｖｉｓｃｉｄｕｌａ　Ｂｕｎｇｅ）属于唇形科（ｌａｂｉａｔａｅ）黄芩属（ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ）多年生药用草本植物，
作为黄芩药用者约有７种左右，粘毛黄芩就是其中的一种，其药用成分主要分布于根部．毛状根培养系统不
但具有生长迅速、次生代谢物质合成能力强的优点，且生产能力稳定，利于天然药物的开发和利用．本文在已
建立粘毛黄芩毛状根离体培养体系的基础上，进一步研究各种不同外界因子对毛状根生长和黄酮类化合物
合成的影响，以期获得最佳培养条件，为粘毛黄芩毛状根的大规模培养和产业化开发奠定基础．
１　材料和方法
１．１　实验材料及基本培养条件
粘毛黄芩毛状根系用Ｃ５８Ｃ１工程菌，采用叶盘共培养法进行的遗传转化［１］，通过ＰＣＲ方法［２测定ｒｏｌＢ，
ｒｏｌＣ基因．获得的毛状根培养采用１／２ＭＳ液体培养基．将１５条生长旺盛长约５ｃｍ的毛状根根尖接入装有
３０ｍＬ１／２ＭＳ液体培养基的１００ｍＬ三角瓶中，２４ｈ连续黑暗，温度为（２４±１）℃，摇床转速１１０ｒ·ｍｉｎ－１，
每１８ｄ继代１次．经过１５代培养得到稳定的毛状根培养体系．
１．２　方　法
１．２．１　粘毛黄芩毛状根生长曲线的获得　在３６ｄ的生长时期中每隔４ｄ取样，测定冷冻干燥后的干重，由
３瓶的干重的平均值绘制生长曲线．
１．２．２　不同培养基对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响　配制 ＭＳ，１／２ＭＳ，Ｂ５，１／２Ｂ５ 液体
培养基．２８ｄ时测定毛状根干重和总黄酮含量．
１．２．３　碳源对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响　分别采用蔗糖、葡萄糖单独做碳源，使各
自浓度分别为２０ｇ·Ｌ－１，３０ｇ·Ｌ－１和４０ｇ·Ｌ－１．２８ｄ时测定毛状根干重和总黄酮含量．
１．２．４　ｐＨ对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响　用１ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＯＨ和１ｍｏｌ·Ｌ－１　ＨＣｌ
调节基本培养基的初始ｐＨ，使其分别为５．２，５．８，６．４，７．０．２８ｄ时测定毛状根干重和总黄酮含量．
１．２．５　激素对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响　分别在１／２ＭＳ基本培养基中添加外源激
素ＮＡＡ，６－ＢＡ，２，４－Ｄ和ＧＡ使其终浓度均为０．２ｍｇ·Ｌ－１．２８ｄ时测定毛状根干重和总黄酮含量．
１．３　总黄酮测定分析
收稿日期：２０１２－０１－２０
基金项目：遵义市科技局资助项目（２０１０１６）．
作者简介：王淑芳（１９８０－），女，山西临汾人，嘉兴学院讲师，主要从事植物生物技术方面的研究．
DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2012.04.022
收集生长２８ｄ的粘毛黄芩毛状根，蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干，冷冻干燥３０ｈ至恒重，研磨成粉，称
量干重（ＤＷ）．总黄酮含量的测定采用比色法，以黄芩苷的含量进行换算．黄芩苷标准品浓度与其吸光度的
线性方程：Ｙ＝０．００７　３Ｘ－０．０９６　１（其中，Ｘ表示光的吸收变量，Ｙ表示总黄酮浓度，ｒ＝０．９９８　５），测定波长
２８７ｎｍ，仪器型号：ＭＯＤＥＬＵ－３０１０紫外分光光度计．
２　结果与分析
２．１　粘毛黄芩毛状根生长的动态曲线
在基本培养条件下，粘毛黄芩毛状根生长曲线基本符合“Ｓ”型（图１）．经过短时间延迟期后，第１６ｄ开
始进入对数生长期，第２８ｄ时达到生长最高峰．２８ｄ以后进入生长停滞期，干重基本不增加，表现出正常离
体器官的生长模式．
２．２　不同培养基对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成
的影响
毛状根培养以１／２ＭＳ培养基为最佳（见表１），在这个条件
下毛状根的干重和黄酮类化合物的生产都达到最大值．ＭＳ，
１／２ＭＳ中的毛状根生长迅速，根段较粗壮，分枝发生率高．Ｂ５，
１／２Ｂ５ 中的毛状根和 ＭＳ中的相似，有一定的分枝发生，但根段
不如 ＭＳ，１／２ＭＳ中的粗壮．这与石斛毛状根的培养［３］相似．
２．３　碳源对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响
在１／２ＭＳ培养基中，２０ｇ·Ｌ－１，３０ｇ·Ｌ－１的蔗糖质量浓度适合毛状根的生长及黄酮类化合物的积累
（见表２）．蔗糖质量浓度为４０ｇ·Ｌ－１时，毛状根的生长及黄酮类化合物积累均有所下降．质量浓度为３０ｇ·
Ｌ－１的葡萄糖利于毛状根的生长及黄酮类化合物积累，但效果不如质量浓度为２０ｇ·Ｌ－１，３０ｇ·Ｌ －１的蔗
糖．在培养青蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ　ａｎｎｕａ　Ｌ．）毛状根时发现，在一定范围内提高蔗糖浓度能促进青蒿毛状根的生长，
其中尤以５％的蔗糖最有利于毛状根青蒿素的积累［４］；可见，培养基中的碳源对毛状根生长及其次生代谢物
质的影响可因植物种类的不同而有所差异．
表１　不同培养基对毛状根生长和黄酮类
化合物生物合成的影响
培养基 干重／（ｇ·摇瓶－１） 总黄酮／（ｍｇ·摇瓶－１）
ＭＳ　 ０．８０２　９±０．１７２　０　 ３２．１９１　２±２．００２　８
１／２ＭＳ　 ０．８９２　３±０．１４５　８　 ３５．３４８　７±２．１０４　９
Ｂ５ ０．６９５　８±０．３２４　３　 ２８．０２１　８±１．５３４　９
１／２Ｂ５ ０．５９３　９±０．２０６　９　 ２４．２７４　１±０．９８４　８
表２　碳源对毛状根生长和黄酮类化合物
生物合成的影响
碳源 干重／（ｇ·摇瓶－１） 总黄酮／（ｍｇ·摇瓶－１）
葡萄糖２０ｇ　 ０．７５１　６±０．０７２　１　 ２９．００１　５±１．５９６　０
葡萄糖３０ｇ　 ０．８０５　９±０．１８３　０　 ３０．１５２　６±１．４８２　９
葡萄糖４０ｇ　 ０．６９３　９±０．２３５　９　 ２４．８９９　８±１．２０　３８
蔗糖２０ｇ　 ０．８５４　６±０．３１４　８　 ３３．１２４　８±１．８０２　７
蔗糖３０ｇ　 ０．９０２　７±０．２０７　９　 ３５．４８４　４±２．１３４　９
蔗糖４０ｇ　 ０．７５１　２±０．１６８　２　 ２９．４３５　９±１．３０４　８
２．４　培养基ｐＨ值对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响
实验表明（表３），毛状根的最适生长ｐＨ值为５．８，分别为ｐＨ５．２、ｐＨ７．０时的１．９倍和１．７倍，说明过
高和过低的ｐＨ值都不适合粘毛黄芩毛状根生长．但黄酮类化合物的合成是在ｐＨ值６．４时含量最高，可见
毛状根在培养过程中不仅要注意生长速度，更应注意次生代谢产物的积累．
２．５　激素对毛状根生长和黄酮类化合物生物合成的影响
植物激素是植物组织培养中的关键因子，不仅影响细胞生长，还影响细胞次生代谢产物的合成［５］．实验
表明（表４），在１／２ＭＳ基本培养基中添加外源激素ＮＡＡ，６－ＢＡ，２，４－Ｄ，ＧＡ对粘毛黄芩毛状根生长及黄酮
类化合物生物合成有较大的影响．２，４－Ｄ对粘毛黄芩毛状根生长及黄酮类化合物生物合成有很强的抑制作
用，培养７ｄ后，毛状根愈伤化；１４ｄ后，毛状根出现褐化现象；而ＮＡＡ，ＧＡ则可促进对粘毛黄芩毛状根生
长及黄酮类化合物生物合成，其中ＧＡ对粘毛黄芩毛状根侧根的产生有强烈促进作用．
５２１第４期　　　　　　　　　王淑芳等：外界因子对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响
　　表３　ｐＨ值对毛状根生长和黄酮类化合物
生物合成的影响
ｐＨ值 干重／（ｇ·摇瓶－１） 总黄酮／（ｍｇ·摇瓶－１）
５．２　 ０．４６９　２±０．１３１　７　 １７．１５４　６±１．３０３　４
５．８　 ０．８８２　９±０．１１２　７　 ３２．１５８　９±１．５７５　７
６．４　 ０．７２４　９±０．２０３　７　 ３５．２７４　５±１．８８６　２
７．０　 ０．５３２　８±０．１５６　３　 ２２．３５７　９±１．１８４　９
表４　激素对毛状根生长和黄酮类化合物
生物合成的影响
激素／（ｍｇ·Ｌ－１） 干重／（ｇ·摇瓶－１） 总黄酮／（ｍｇ·摇瓶－１）
０　 ０．８８９　８±０．１４６　８　 ３４．４８９　２±１．４４８　５
ＮＡＡ（０．２） ０．９１１　２±０．２５６　８　 ３５．０２５　８±１．７７４　５
６－ＢＡ（０．２） ０．５９４　７±０．３４２　８　 ２３．１２７　６±１．５７４　２
２，４－Ｄ（０．２） ０．４５１　８±０．１８６　１　 １９．７３６　１±０．７２５　９
ＧＡ（０．２） １．１８８　９±０．１１２　８　 ３７．０４８　６±１．７７６　１
３　讨　论
由于粘毛黄芩野生资源逐年减少和栽培品种品质下降，给临床使用和中成药制造带来一定的影响．利用
毛状根培养技术工业化生产黄酮类化合物将为中药材新资源研究提供一条新途经．粘毛黄芩毛状根培养结
果表明，３０ｇ－Ｌ－１蔗糖、ｐＨ　５．８的１／２ＭＳ培养基最适合毛状根生长，但总黄酮合成最高则在ｐＨ６．４．４种外
源激素均不同程度地影响了粘毛黄芩毛状根的生长，ＮＡＡ、ＧＡ可促进对粘毛黄芩毛状根生长及黄酮类化
合物生物合成，６－ＢＡ，２，４－Ｄ对粘毛黄芩毛状根生长及黄酮类化合物生物合成有不同程度的抑制作用．综
合本文研究结果，如何将有利因素组合起来，使得黄酮类化合物大大提高，有待进一步研究．
参　考　文　献
［１］　刘肖飞，梁卫红．根癌农杆菌介导的ＧＦＰ在洋葱表皮细胞定位研究［Ｊ］．河南师范大学学报：自然科学版，２００９，３７（１）：１２３－１２５．
［２］　邢智峰，张安世，徐存栓，等．毛白杨４ＣＬ基因启动子的克隆及初步功能分析［Ｊ］．河南师范大学学报：自然科学版，２００７，３５（２）：１４２－１４５．
［３］　李凤华，汤绍虎，孙　敏．石斛毛状根的诱导及培养条件的优化［Ｊ］．中药材，２００４，２７（１０）：７１２－７１３．
［４］　Ｌｉｕ　Ｃ　Ｚ，Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｃ，Ｏｕｙａｎｇ　Ｆ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ａｒｔｅｍｉｓｉａ　ａｎ－
ｎｕａ　Ｌ［Ｊ］．Ａｃｔａ　ＢｏｔＢｏｒｅａｌ　Ｏｃｃｉｄｅｎｔ　Ｓｉｎ，１９９９，１９（４）：５７１－５７７．
［５］　Ｍｅｙｅｒ　Ｈ　Ｊ，Ｖａｎ　Ｓｔａｎｄｅｎ　Ｊ．Ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｈｏｅ　ｖａｎｉｎｆｒｏｎｌ　ｃｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｏｘａｌｉｓ　ｌｉｎｅａｒｉｓ［Ｊ］．Ｐｈｍｔ　Ｃｅｌ　ＴＬ－ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒ－
ｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，１９９５，４０：５５－５８．
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｈａｉｒｙ　Ｒｏｏｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ　Ｖｉｓｃｉｄｕｌａ　ＢｇｅＨａｉｒｙ　Ｒｏｏｔ
ＷＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｒｅｎ－ｂｏ２，ＤＯＵ　Ｑｕａｎ－ｌｉ　２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃｅｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｊｉａｘｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｊｉａｘｉｎｇ　３１４００１，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｚｕｎｙｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ　５６３００２，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ　ｖｉｓｃｉｄｕｌａ　Ｂｇｅ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉａ　ｕｓｅｄ，ｐＨ　ｖａｌｕｅｓ，ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｒｅ　１／２ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ｓｕｃｒｏｓｅ（３％）ａｓ　ｃａｒｂｏｎ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｐＨ　５．８，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　ｆｏｒ　ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　６．４；ＮＡＡ　ａｎｄ　ＧＡ　ｃｏｕｌｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｐｅｅｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｓ
ＧＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｅｍｉｎｅｎｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｇｉｖｅ　ａ　ｎｅｗ　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｏ　ｒｅｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔａｇｅ　ｏｆ　ｂａｉｃａｌｉｎ　ｏｆ　Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ
ｖｉｓｃｉｄｕｌａ　Ｂｕｎｇｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｃｕｔｅｌａｒｉａ　ｖｉｓｃｉｄｕｌａ　Ｂｇｅ；ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
６２１ 河南师范大学学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　２０１２年