全 文 ：DOI∶10． 13192 / j． issn． 1000-1719． 2015． 09． 051
大孔树脂纯化展毛地椒总黄酮工艺研究
豆浩然1，倪健1，葛亮2，3，曹飒丽1，林龙飞1，夏振文1
(1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102;2. 新疆名医名方与特色方剂学重点试验室，新疆 乌鲁木齐 830011;
3. 新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)
摘 要:目的:优选大孔树脂纯化展毛地椒总黄酮的工艺参数。方法:采用紫外分光光度法测定总黄酮含量，以总黄
酮的吸附率和解吸率为指标，考察大孔树脂型号、上样液浓度、上样流速、洗脱剂种类及其用量等影响因素，优选最佳分
离纯化条件。结果:AB － 8 树脂具有较好的吸附率和解吸率，最佳纯化工艺:上样液浓度为 0. 2 g /mL，上样流速为 2 BV /
h，上样体积为 2 BV，洗脱溶剂为 50% 乙醇，洗脱体积为 5 BV，径高比为 1 /6，富集物中展毛地椒总黄酮含量达到
26. 32%。结论:AB － 8 型大孔树脂能较好地用于分离纯化展毛地椒总黄酮。
关键词:展毛地椒;总黄酮;大孔树脂;纯化工艺
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1000-1719(2015)09-1726-04
Purification Technology of Total Flavonoids from Thymus by Macroporous Ｒesin
DOU Haoran1，NI Jian1，GE Liang2，3，CAO Sali1，LIN Longfei1，XIA Zhenwen1
(1． Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;2． Xinjiang Key Laboratory of Famous
Prescriptions and Formulae，Urumqi 830011，Xinjiang，China;3． College of Traditional Chinese Medicine，
Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，Xinjiang，China)
Abstract:Objective:To optimize the purification technology parameters of total flavonoids from Thymus using macroporous
resins． Methods:The content of total flavonoids in Thymus was determined by ultraviolet spectrophotometry spectrophotometer．
With the adsorption and desorption capacity as index，purification technology was optimized by investigating the type of macro-
porous resin，concentration of sample liquid，flow speed for adsorption，type and amount of eluent solvent and other indicators． Ｒe-
sults:AB － 8 macroporous resin showed the good property for the absorption and desorption capacity for total flavonoids in Thy-
mus． The optimized conditions were as follows:the concentration of sample liquid was 0． 2 g /mL;the flow rate was 2 BV /h;the e-
lution solvent was 50% ethanol;the volume of elution solvent was 5 BV and the ratio of diameter to height was 1 /6． Under the op-
timized purification condition，the content of total flavonoids was up to 26. 32% in the enriched product． Conclusion:AB － 8
macroporous resin can be effectively applied to purify total flavonoids from Thymus．
Key words:Thymus;total flavonoids;macroporous resin;purification technology
收稿日期:2015 － 03 － 30
基金项目:北京市“十病十药”研发项目(Z131100002513011) ;北京中医
药大学复方中药制药创新团队基金项目(2011 － CXTD － 13)
作者简介:豆浩然(1989 －) ，女，河北邢台人，硕士研究生，研究方向:中
药制剂新剂型及新技术研究。
通讯作者:倪健(1964 －) ，教授，博士研究生导师，研究方向:中药制剂
新剂型及新技术研究，E － mail:njtcm@ 263． net。
展 毛 地 椒 Thymus quinquecostantus
Celak. var. przewalskii(Kom. )Ｒonn. 为唇形科百里香
属植物，以地上部分入药，是 1977 版《中华人民共和国
药典》收载的地椒栽培品种之一，功能祛风解表，行气
止痛，用于治疗感冒、头痛、牙痛、周身疼痛、腹胀冷
痛［1 － 2］。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、镇痛、调节
免疫、抗衰老、降血脂、抗肿瘤等药理作用［3］，地椒黄酮
类成分已报道的有芹菜素、木犀草素、紫衫叶素、条叶
蓟素、藤黄菌素、芫花素、圣草酚、柚皮素等［4 － 5］。药理
研究表明，地椒提取物具有抗菌、消炎、止痛、抗氧化、
抗肿瘤等活性，体外试验发现地椒乙酸乙酯萃取物中
含有的黄酮类成分具有很强的抗氧化活性［6］，乙醇提
取物中的地椒黄酮为主要的抗肿瘤活性成分［7 － 8］。近
年来大孔树脂分离技术广泛应用于皂苷［9］、黄酮［10］、
生物碱［11］等成分的分离纯化，适合于工业化生产，具
有较高的应用推广价值。有关大孔树脂分离纯化展毛
地椒总黄酮的研究国内外未见报道。本研究以展毛地
椒为研究对象，考察大孔树脂纯化展毛地椒总黄酮的
最佳工艺参数，为展毛地椒资源的开发利用提供依据。
1 仪器与材料
TU1810 紫外 －可见分光光度计(北京普析通用仪
器有限责任公司) ;BT － 125D 电子分析天平(德国
Sartorius 公司) ;ＲE － 52AA 旋转蒸发仪(上海振捷实
验设备有限公司) ;DZKW － 4 水浴锅(北京中兴伟业
仪器有限公司)。
展毛地椒(北京峰顺康医药有限责任公司，批号:
11313101)经北京中医药大学中药鉴定系刘春生教授
·6271· 辽宁中医杂志 2015 年第 42 卷第 9 期
鉴定为唇形科百里香属植物展毛地椒 Thymus
quinquecostatus Celak. var. przewalskii(Kom. )Ｒonn. 的
干燥地上部分。AB － 8、D101、NKA － 9、HPD300 大孔
树脂(沧州宝恩化工有限公司) ;芹菜素(上海诗丹德
生物技术有限公司，批号:03 /080610) ;其它试剂均为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 展毛地椒总黄酮含量测定
2. 1. 1 上样溶液制备 称取 200 g 药材，加入 10 倍
量水回流提取 3 次，第 1 次 5 h，第 2、3 次均为 1. 5 h，
提取液过滤，合并滤液，浓缩、离心，取上清液转移至
1000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，制成生药浓度为
0. 2 g /mL上样液。
2. 1. 2 对照品溶液制备 称取干燥至恒重的芹菜素
对照品 3. 16 mg，用 70%乙醇溶解并稀释至 50 mL，制
成 63. 2 μg /mL芹菜素对照品溶液。
2. 1. 3 标准曲线绘制 吸取芹菜素对照品溶液 0. 2、
0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 5 mL 分别置于 10 mL 容量
瓶中，各加 0. 1 mol /L AlCl3 70% 乙醇溶液 0. 5 mL，用
70% 乙醇定容至刻度，摇匀，放置显色 15 min。以空
白溶液作为参比，置 1 cm石英比色皿中，于 340 nm处
测定吸收值［12］。以浓度(C)对吸收值(A)作线性回
归，得回归方程:A = 72. 968C + 0. 0099 (r = 0. 9998) ，
表明芹菜素浓度在 1. 65 ～ 12. 4 μg /mL 范围内线性关
系良好。
2. 1. 4 精密度试验 吸取同一供试品溶液 1. 0 mL，
按“2. 1. 3”项的方法重复操作 6 次，计算展毛地椒总
黄酮含量，ＲSD为 0. 23%，表明该方法精密度良好。
2. 1. 5 稳定性试验 吸取同一供试品溶液 1. 0 mL，
按“2. 1. 3”项的方法显色后，每 10 min测定 1 次，共测
定 80 min，计算展毛地椒总黄酮含量，结果供试品显色
后 80 min内保持稳定，ＲSD为 0. 47%，表明该方法稳
定性良好。
2. 1. 6 重复性试验 取样品按“2. 1. 1”项的方法平
行制备 6 份供试品溶液，按“2. 1. 3”项的方法重复操
作，计算展毛地椒总黄酮含量，ＲSD 为 2. 28%，表明该
方法重复性较好。
2. 1. 7 加样回收率试验 吸取已知含量的供试品溶
液 6 份，分别加入一定量芹菜素对照品溶液，按
“2. 1. 3”项的方法平行操作 6 次，计算展毛地椒总黄
酮含量，结果平均回收率为 100. 87%，ＲSD 值为
0. 67%，结果见表 1。
表 1 加样回收率试验结果
序号
样品含量
(μg)
加入量
(μg)
测得量
(μg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
ＲSD
(%)
1 34. 98 40. 93 75. 86 99. 87
2 34. 68 40. 93 76. 41 101. 94
3 34. 61 40. 93 75. 86 100. 77
100. 87 0. 67
4 33. 89 40. 93 75. 17 100. 86
5 35. 36 40. 93 76. 54 100. 62
6 35. 15 40. 93 76. 54 101. 13
2. 2 大孔树脂纯化工艺考察
2. 2. 1 大孔树脂预处理 取 AB － 8、D101、NKA － 9、
HPD －300 大孔树脂适量，用 95%乙醇浸泡 24 h，湿法
装柱，临用前用 95%乙醇洗脱柱子除去交联剂、致孔
剂等残留溶剂及杂质，至流出液与 5 倍体积水混合无
混浊，继续用水洗脱树脂柱，直至流出液无醇味，备用。
2. 2. 2 大孔树脂类型筛选 选择 AB － 8、D101、NKA
－9、HPD300 四种大孔树脂，以总黄酮吸附率和解吸
率为指标，采用动态吸附试验筛选最优树脂类型。取
预处理后的树脂 10 g，加入浓度 0. 1 g /mL 的提取液
50 mL上样，以 4 BV /h 流速进行动态吸附，收集流出
液，水洗 25 mL，合并流出液和水洗液，测定滤液 1 中
总黄酮含量，计算吸附率(见表 2)。将吸附平衡后的
树脂用 70%乙醇 80 mL 洗脱，收集乙醇洗脱液，测定
醇洗液中总黄酮含量，计算解析率和固形物纯度(见
表 2)。四种树脂的动态饱和吸附率及解析率各有差
异，NKA －9 吸附率最高，AB － 8 次之，D101 解析率最
高，AB －8 次之，总黄酮纯度 AB － 8 最高。综合考虑，
采用具有较好吸附和解析附能力的 AB － 8 型大孔树
脂纯化展毛地椒总黄酮。
吸附率 =(C0V0 － C1V1)/C0V0 × 100%
解吸率 = C2V2 /(C0 V0 － C1V1)× 100%
转移率 = C2V2 / C0V0 × 100%
式中，C0 为起始质量浓度(g /L) ，C1 为滤液 1 质
量浓度(g /L) ，C2 为滤液 2 质量浓度(g /L) ，V0 为上样
溶液体积(mL) ，V1 为滤液 1 体积(mL) ，V2 为滤液 2
体积(mL)。
表 2 大孔树脂型号筛选
树脂型号 吸附率(%) 解吸率(%) 纯度(%)
AB －8 84. 65 94. 41 28. 96
D101 80. 35 96. 49 26. 47
HPD300 83. 43 92. 40 24. 48
NKA －9 88. 31 92. 78 28. 38
2. 2. 3 上样液浓度考察 取生药浓度分别为 0. 1、
0. 2、0. 5、1. 0 g /mL上样液 50、25、10、5 mL，以 4 BV /h
流速进行动态吸附，上样后分别用 25 mL水洗脱，合并
流出液和水洗液，测定其中总黄酮含量，计算树脂吸附
率。由图 1 可知，随着上样液浓度增加，总黄酮吸附率
先升后降，上样液浓度为 0. 2 g /mL时，吸附率最高，故
上样液浓度为 0. 2 g /mL。
图 1 上样液浓度对吸附率的影响
·7271·辽宁中医杂志 2015 年第 42 卷第 9 期
2. 2. 4 上样流速考察 吸取浓度为 0. 2 g /mL的上样
液 20 mL，在相同试验条件下，1 BV =16 mL，将上样液
分别以 2、3、4、5 BV /h 的流速通过树脂柱进行动态吸
附，上样后分别用 25 mL高纯水洗脱，合并流出液和水
洗液，测定其中总黄酮含量，计算不同上样流速下树脂
对总黄酮的吸附率。由图 2 可知，吸附率随上样流速
增大逐渐下降，吸附流速越慢，吸附越完全，故采用吸
附率最高的上样流速 2 BV /h。
图 2 上样流速对吸附率的影响
2. 2. 5 最大上样量考察 ①药材树脂比例考察 预处
理好 4 根 AB －8 大孔树脂柱(1 BV = 16 mL) ，加入浓
度为 0. 2 g /mL 的上样液，使药材与树脂比例分别为
1 /1、1 /2、1 /3、1 /4，以 2 BV /h上样流速进行动态吸附，
上样后加水洗至流出液无色，合并流出液和水洗液，测
定其中总黄酮含量，计算吸附率［13］。由图 3 可知，药
材与树脂比例为 1∶ 1 时，总黄酮吸附率为 75. 12%，比
例为 1 /2、1 /3、1 /4，转移率均为 90%左右，说明药材与
树脂比例在 1 /2 ～ 1 /4 之间均可达到较高吸附率。
图 3 药材树脂比
②绘制泄露曲线 选择预处理好 AB － 8 大孔树脂
柱(1 BV = 16 mL) ，取浓度为 0. 2 g /mL 的上样液过
柱，上样流速控制在 2 BV /h 进行动态吸附，分段接收
流出液，测定流出液中总黄酮含量，绘制泄露曲线［14］。
由图 4 可知，随上样量增加，流出液中总黄酮量也随之
增加，当上样量 2 BV(32 mL)时，总黄酮泄漏量极少，
上样量达到 3 BV(48 mL)时，总黄酮泄露量开始明显
增加，即大孔树脂达到动态吸附饱和，考虑工业生产时
树脂需反复使用，为避免泄露、提高总黄酮转移率，选
取最大上样体积为 2 BV。上样液 2 BV时药材与树脂
比例为 1 /2. 5，符合药材与树脂比例在 1 /2 ～ 1 /4 的范
围，与药材树脂比例试验结果吻合，故确定浓度为 0. 2
g /mL的上样液体积为 2 BV。
2. 2. 6 水洗体积考察 选择预处理好 AB － 8 型大孔
树脂柱(1 BV =16 mL) ，吸取浓度为 0. 2 g /mL上样液
2 BV，以 2 BV /h 流速进行动态吸附，加入高纯水以 4
BV /h流速洗除糖类、色素等杂质，用硫酸 －苯酚法反
应检测洗脱液，观察颜色变化，结果发现水洗至 4 BV
时，洗脱液接近无色，硫酸 －苯酚法反应呈阴性，说明
多糖基本洗脱完全，故确定水洗体积是 4 BV。
2. 2. 7 洗脱溶剂考察 选择预处理好 AB － 8 型大孔
树脂柱 4 根(1 BV =16 mL) ，分别量取上样液 2 BV，以
2 BV /h流速上柱，加 4 BV水洗脱树脂柱，合并流出液
和水洗液，测定流出液中总黄酮含量。分别用 5
BV40%、50%、60%、70%的乙醇进行洗脱，洗脱速度 4
BV /h，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮含量，计算解
析率。由图 5 可知，随着乙醇体积分数增大，总黄酮解
析率先升后降，体积分数为 50%的乙醇解析率最高，
故最佳洗脱溶剂为 50%乙醇。
图 4 AB － 8 树脂动态吸附曲线
图 5 乙醇浓度对解析率的影响
2. 2. 8 洗脱体积考察 采用浓度为 0. 2 g /mL的提取
液 2 BV，以 2 BV /h流速通过树脂柱，先用 4 BV水洗，
洗脱液弃去，再用体积分数为 50%的乙醇进行洗脱，
洗脱流速 4 BV /h，每 1 BV收集一次洗脱液，测定洗脱
液中总黄酮含量，绘制洗脱曲线。由图 6 可知，随着洗
脱剂用量增加，总黄酮解析率先增后降，洗脱剂为 2
BV时，总黄酮含量最高，洗脱剂用量为 5 BV 时，总黄
酮累积洗脱率达到 97. 70 %，洗脱剂用量为 6 BV 时，
总黄酮累积洗脱率为 98. 43%，总黄酮含量仅增加
0. 73%，综合考虑，确定洗脱体积为 5 BV。
2. 2. 9 径高比考察 将已处理好的 AB － 8 型树脂分
别装于 4 根相同规格的层析柱上，树脂径高比分别为
1 /4，1 /6，1 /8，1 /10。分别吸取 2 BV 质量浓度为 0. 2
g /mL样液以 2 BV /h的流速上样，按优化的纯化参数
·8271· 辽宁中医杂志 2015 年第 42 卷第 9 期
进行洗脱，收集 50%乙醇洗脱液，测定总黄酮转移率
和固形物中纯度。由表 3 可知，径高比变化对总黄酮
转移率和纯度无明显影响，径高比 1 /4 ～ 1 /10 范围内
总黄酮转移率均可达到 80%以上，纯度 25%左右。故
小试仍采用径高比 1 /6，工业生产中可根据实际需要
做相应径高比的调整。
图 6 洗脱体积对解析率的考察
表 3 树脂径高比
径高比 转移率(%) 纯度(%)
1 /4 82. 29 25. 99
1 /6 81. 34 24. 28
1 /8 80. 78 24. 01
1 /10 81. 38 24. 02
2. 3 最佳工艺条件验证
将已处理好的 AB － 8 型树脂分别装于 3 根相同
规格的层析柱上，使径高比为 1 /6，柱体积约为 16 mL，
分别加入 2 BV浓度为 0. 2 g /mL的上样液，以 2 BV /h
的流速进行动态吸附，先以 4 BV /h 的洗脱流速水洗 4
BV，再用 5 BV的 50% 乙醇洗脱，收集 50%醇洗脱液，
于 340 nm处测定吸光度，减压回收溶剂，真空干燥后
称重，得到富集物，计算总黄酮转移率和纯度。由表 4
可知，最优纯化工艺条件下，富集物中展毛地椒总黄酮
含量达到 26. 32%，总黄酮转移率为 80. 68%。
表 4 验证试验结果
序号
固形物纯度(%)
纯化前 纯化后
转移率(%)
1 8. 55 25. 68 80. 01
2 8. 59 26. 84 82. 50
3 8. 95 26. 45 79. 54
平均值 8. 70 26. 32 80. 68
ＲSD(%) 2. 54 2. 24 1. 97
3 讨论
在考察最大上样量时，通常有绘制泄露曲线和考
察药材树脂比例两种方法，尚未有文献报道哪种方法
更优。绘制泄露曲线是以流出液黄酮质量浓度达到其
上样液 10%时认为黄酮已穿透，即达到树脂最大吸附
能力［15］。但此时树脂柱中残留少量药液未流出，仍有
部分黄酮未被大孔树脂吸附，导致测定值比实际值偏
低。为确保上样体积选取的准确性，同时考察了药材
与树脂比因素，上样液 2 BV 时药材与树脂比例为 1 /
2. 5，上样 3 BV时药材与树脂比为 1 /1. 7，低于 1 /2，转
移率会有所降低。通过对以上两种方法的比较，发现
若选取泄露曲线上的穿透点为上样体积，因泄露曲线
有一定的延滞性，可能会影响目标产物的收率，相比而
言，药材与树脂比例试验得到的数据更加准确、直接。
考察纯化工艺参数时，吸附阶段和解吸阶段分别
以吸附率、解吸率为考察指标，避免解吸阶段误差对吸
附阶段产生影响，同时也排除了吸附阶段误差对解吸
阶段产生的影响。相比以转移率和纯度两个指标考察
所有纯化因素，数据更加准确、可靠、简便。屠鹏飞
等［16］根据长期试验结果发现，吸附流速和洗脱流速对
目标成分的收率和含量没有明显的影响，为使目标成
分能够充分吸附，本试验中吸附流速采用低流速 2
BV /h，洗脱流速采用较高流速 4 BV /h。展毛地椒纯
化前固形物中总黄酮纯度为 8. 70%，纯化后总黄酮纯
度达到 26. 32%，转移率达到 80%以上，纯化后固形物
纯度为纯化前的 3. 03 倍，说明 AB － 8 树脂分离纯化
展毛地椒总黄酮的工艺稳定可行，具有应用推广价值。
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