全 文 ：48　 林业科技开发　2008年第 22卷第 2期
无性系 85号基因转化培育抗逆新品种奠定了基础。
在植物组织培养过程中 ,常需要进行激素种类和
浓度的配比试验 ,工作量相当大。正交试验设计 、正
交拉丁方设计在因素 、水平数较多时仍存在试验次数
多 、规模大等问题。在多因素 、多水平的试验中采用
均匀设计 ,具有试验次数少 、可操作性强 、节约时间和
精力 、迅速达到优化因素的效果 ,符合多因素复杂试
验对试验条件一致性的要求 ,试验准确性高。在植物
快繁中应用均匀设计探索培养基配方 ,将极大地提高
工作效率 ,可应用于植物激素种类和浓度的筛选 ,以
及探讨基本培养基的组成等 ,从而使植物组织培养的
条件得到有效的控制 [ 12] 。
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(责任编辑　吴祝华)
加杨叶总黄酮提取工艺的优化
石慧 ,范文 ,陈媛梅
(北京林业大学理学院 ,北京 100083)
摘　要:为优化加杨叶总黄酮的提取工艺 , 通过单因素和正交试验进行优选 , 所得结果采用方差分析 , 并进行精密
度和回收率试验。结果表明:影响加杨叶总黄酮提取工艺的主要因素为提取温度 , 其次是液料比和乙醇浓度 ,而提
取时间的影响不大。确定加杨叶总黄酮最佳提取工艺为:时间 60min,乙醇浓度 50%, 液料比 40∶1, 温度 80℃。此
法重现性好 ,精密度高 , 平均回收率达 98.92%。
关键词:加杨叶;总黄酮;提取工艺;精密度;回收率
OptimalExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromLeavesofPopuluscanadensisMoench.∥SHI
Hui, FANGWen, CHENYuan-mei
Abstract:Thesinglefactortestandtheorthogonalexperimentaldesignwerecarriedouttooptimizetheextractiontechnology
oftotalflavonoidsfromleavesofPopuluscanadensisMoenchinthispaper.Theresultsindicatedthattheextractiontempera-
ture, theratioofsolventtomaterialandtheethanolconcentrationhadaremarkableinfluenceontheextractionoftotalfla-
vonoids, whiletheextractiontimehadhardlyinfluenceonit.Theoptimalextractiontechnologywas50% ethanolandthe
ratioofsolventtomaterial40∶1 atthetemperatureof80℃ for60 min.Theoptimizedtechnologyhadgoodreproducibility
andmoreprecision, andtheaveragerecoverywas98.92%.
Keywords:LeavesofPopuluscanadensisMoench.;Totalflavonoids;Extractiontechnology;Precision;Recovery
Author saddress:CollegeofScience, BeijingForestryUniversity, 100083, Beijing, China
收稿日期:2007-11-02　　　　修回日期:2007-12-03
基金项目:北京林业大学研究生自选课题基金资助项目(06j127)。
第一作者简介:石慧(1981-),女 ,硕士生 , 研究方向为生物大分子结
构与物理化学研究。
　　加杨(PopulusCanadensisMoench.)又称加拿大
杨 ,是美洲黑杨和欧洲黑杨的杂交种 ,属杨柳科杨属
植物 ,主要分布于辽宁 、华北 、西北 、华东等地 ,资源极
为丰富 [ 1] 。杨树叶的药用历史悠久。在民间 ,用杨
树叶水煮液在骨科治疗中配合正骨治疗 ,对控制陈旧
性软组织感染及化脓性骨髓炎疗效较好;用其嫩枝叶
熬水洗涤无名肿疡 ,有消肿去毒之功效 [ 2] 。而目前
应用研究　
　林业科技开发　2008年第 22卷第 2期 49　
国内外对杨属植物叶研究较少 ,仅对极少量品种的杨
树叶片化学成分有报道 ,如林茂等对毛白杨化学成分
的研究 [ 3] ;王书翰等对欧美杨和美洲黑杨树叶化学
成分的研究 [ 4] 。杨属植物的主要活性成分之一是黄
酮类化合物 ,它是具有重要生理作用的天然产物 ,具
有降血压 、抗炎 、抑菌 、解痉等多种功效[ 5] 。迄今为
止 ,国内外只对加杨的雄花序作过研究[ 6] ,其叶一直
未被充分利用 ,造成资源浪费。为有效利用加杨叶中
的黄酮类物质 ,我们采用正交试验和方差分析法 ,以
加杨叶总黄酮的得率为指标 ,考察了提取时间 、溶剂
浓度 、液料比 、提取温度 4因素对加杨叶总黄酮提取
率的影响 ,研究了加杨叶总黄酮的最佳提取工艺条
件 ,从而为加杨叶的开发利用提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　实验仪器
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);电热恒
温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);电热鼓风干燥箱
(重庆万达仪器有限公司);ItemAR2140电子天平;RE-
52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2　试剂与材料
试剂:芦丁标准品 ,无水乙醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、
氢氧化钠 、石油醚均为分析纯。
材料:加杨叶采自北京林业大学校内 5月生长良
好的加杨。
1.3　实验方法
1.3.1　标准溶液的制备
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品 0.10g,用 30%
乙醇溶液溶解 ,定容至 100mL,摇匀得 1mg/mL的芦丁
贮备液;准确吸取 10.0mL芦丁贮备液于 100mL容量瓶
中 ,加 30%的乙醇溶液定容得 0.1mg/mL芦丁标准溶液
备用。
1.3.2　标准曲线的绘制 [ 7]
准确吸取芦丁标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0
mL,分别置于 10mL容量瓶中 ,各加 30%的乙醇至
5.0mL;加 5%的亚硝酸钠 0.4mL,摇匀 ,放置 5min;
再加 10%硝酸铝溶液 0.4mL,摇匀 , 放置 5min;加
4%氢氧化钠溶液 4.0mL, 摇匀;最后加 30%的乙醇定
容至刻度 ,摇匀 ,放置 10min。在波长 510nm处测定
其吸光度 ,试样空白作参比。试样空白作参比 ,在波长
510nm处测定其吸光度。以浓度 C(mg/mL)为横坐
标 ,吸光度 A为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.3　样品总黄酮含量测定
将样品提取液浓缩 ,然后转入 100mL容量瓶中 ,
用相应浓度的乙醇定容至刻度 ,摇匀 ,每次准确量取
2.0mL。按照 1.3.2节的方法测定吸光度后 ,代入标
准曲线方程计算 ,得出样品总黄酮含量 。
　　总黄酮提取率(%)=C×10×100/2ω×100 ×100,
式中:ω—加杨叶粉末的重量 ,单位 g;C—加杨叶总黄
酮的浓度 ,单位 mg/mL。
1.3.4　提取条件选择
将加杨叶除杂 ,用蒸馏水洗净 , 80℃下烘干 ,粉
碎 ,过 60目筛得加杨叶粉末 。准确称取 1.00g粉末
若干份 ,用石油醚浸泡 1h,倾出石油醚 ,挥发至干 。
分别在不同的提取时间 、乙醇浓度 、液料比 、提取温度
条件下作单因子平行试验 ,按 1.3.3节的方法进行各
样品总黄酮含量测定。
根据单因素试验结果选择提取时间 、乙醇浓度 、
液料比 、提取温度 4因素中有意义的 3水平做正交试
验 ,因素水平见表 1。应用 L9(34)正交表进行优选 ,
采用极差分析和方差分析法 ,确定最佳提取工艺 。
表 1　加杨叶总黄酮提取工艺因素水平表
水平 时间 /min(A)
乙醇浓度 /%
(B)
液料比 mL/g
(C)
温度 /℃
(D)
1 60 30 20∶1 60
2 90 40 30∶1 70
3 120 50 40∶1 80
1.3.5　重复性试验
为验证选定的最佳提取工艺的重复性 ,准确称取
1.00g加杨叶粉末 5份 ,用石油醚处理后 ,以最佳提
取工艺进行 5次平行试验 ,按照 1.3.3节的方法进行
样品总黄酮含量的测定 。
1.3.6　精密度试验[ 8]
为验证分光光度法所用仪器测定加杨叶总黄酮
含量的精密度 ,以最佳提取工艺制备提取液 ,按照
1.3.3节的方法浓缩 、定容后 ,分别准确量取 2.0mL
加入 5个 10mL容量瓶中 ,测定吸光度后进行样品总
黄酮含量的计算。
1.3.7　加样回收试验 [ 8]
准确称取已知总黄酮含量的加杨叶粉末 5份 ,每
份 1.00g,用石油醚处理后 ,分别加入一定量的芦丁
对照品 ,按最佳提取工艺制备 ,再按 1.3.3节的方法
进行总黄酮含量的测定 ,计算回收率。
2　结果与分析
2.1　芦丁标准曲线
标准曲线如图 1所示 ,用最小二乘法作线性回
归 ,结果表明在 0.01 ～ 0.05mg/mL的范围内 ,吸光度
　应用研究
50　 林业科技开发　2008年第 22卷第 2期
与浓度呈良好的线性关系 。
图 1　芦丁标准曲线
2.2　单因素试验
2.2.1　提取时间的选择
在 70℃、液料比 15∶1(mL/g)、30%乙醇条件下 ,
选用不同的提取时间进行回流提取 ,得出加杨叶总黄
酮得率与提取时间的关系如图 2所示 。很明显 ,在本
试验条件下 ,提取时间在 90min时黄酮得率最高。
图 2　提取时间对黄酮得率的影响
2.2.2　乙醇浓度的选择
乙醇的溶解性能比较好 ,对植物细胞的穿透能力
较强。亲水性的成分除蛋白质 、粘液质 、果胶 、淀粉和
部分多糖等外 ,大多能在乙醇中溶解 。无论是以游离
的苷元还是苷存在 ,黄酮类化合物都易溶于乙醇溶液
中 ,因此总黄酮的提取一般用有机溶剂乙醇提取 [ 9] 。
实际操作中可以根据被提取物质的性质 ,采用不同浓
度的乙醇进行提取。
在 70℃、液料比 15∶1(mL/g)条件下 ,用不同浓
度乙醇溶液回流提取 90min。结果如图 3所示 ,随着
乙醇浓度的升高 ,黄酮得率增加 ,但乙醇浓度超过
40%后黄酮得率反而下降。
图 3　乙醇浓度对黄酮得率的影响
由于黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态
(苷和苷元 、单糖苷 、双糖苷或三糖苷)不同而有很大
差异 ,而二氢黄酮及二氢黄酮醇等 ,系非平面性分子 ,
故分子与分子间排列不紧密 ,分子间引力降低 ,有利
于水分子进入 ,溶解度稍大 ,所以加杨叶中可能含二
氢黄酮及二氢黄酮醇等较多 。
2.2.3　液料比的选择
溶剂的用量是工业化生产过程中不可低估的经
济指标。在 70℃、40%乙醇条件下 ,以能浸没原料的
最低乙醇量为基础 ,不同液料比回流提取 90min,结
果见图 4。黄酮得率随着液料比的增加而增加 ,但液
料比大于 30∶1时 ,黄酮得率反而下降。因此 ,当液料
比为 30∶1时黄酮得率最高 。
图 4　液料比对黄酮得率的影响
2.2.4　温度的选择
温度越高 ,分子运动越剧烈 ,渗透 、扩散 、溶解速
度加快 ,同时 ,高温可以引起细胞膜结构的变化 ,使黄
酮类化合物容易转移到溶剂中 ,因此 ,随提取温度的
升高 ,黄酮类化合物的得率也升高 [ 10] 。在 40%乙
醇 、液料比 30∶1(mL/g)的条件下 ,选用不同的提取
温度回流提取 90min,结果如图 5所示。随着温度的
升高 ,黄酮得率随之增加 ,特别是从 60℃上升到 70℃
的过程中 ,黄酮得率增幅较大 ,当温度超过 70℃时 ,黄
酮得率几乎不变。这可能是温度过高引起黄酮类化合
物结构被氧化破坏导致其提取率降低[ 10] 。此外 ,当温
度超过溶剂沸点时 ,容易造成溶剂的损失 ,从而导致浸
出率下降。因此 ,提取温度选择 70℃左右为宜。
图 5　温度对黄酮得率的影响
2.3　最佳提取工艺的考察
2.3.1　正交试验结果分析
采用 L9(34)正交表 ,对结果进行极差分析 ,结果
见表 2,同时对试验因素进行显著性分析。同时 ,由
表 2可知 , A、B、C、D4因素对加杨叶总黄酮得率的
影响程度不同 ,各因素的影响程度依次为 D>C>B
>A。方差分析结果表明 ,提取时间对黄酮得率影响
应用研究　
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不大 ,乙醇浓度 、液料比对黄酮得率有显著影响 ,而温
度对黄酮得率则有非常显著的影响 ,这与上面极差分
析的结果相符。理论结果表明:加杨叶总黄酮最佳提
取工艺为:A2B3C3D3 ,即时间 90min,乙醇浓度 50%,
液料比 40∶1,温度 80℃。由于提取时间对黄酮得率
影响程度非常小 ,可将优化方案中的 A2换为 A1 ,以
节省时间 ,提高效率 ,这正好是正交表中的第 3号试
验 ,它是已做过的 9个试验中黄酮得率最高的试验方
案 [ 11] 。最终确定加杨叶总黄酮最佳提取工艺为:
A1B3C3D3 ,即时间 60min,乙醇浓度 50%,液料比 40∶
1,温度 80℃。
表 2　正交试验结果与分析
实验号 时间(A)/min
乙醇浓度
(B)/%
液料比(C)
/mL·g-1
温度
(D)/℃
吸光
度 /A
得率
/%
1 60 30 20∶1 60 0.248 1.03
2 60 40 30∶1 70 0.283 1.17
3 60 50 40∶1 80 0.295 1.27
4 90 30 30∶1 80 0.288 1.19
5 90 40 40∶1 60 0.278 1.15
6 90 50 20∶1 70 0.283 1.17
7 120 30 40∶1 70 0.282 1.17
8 120 40 20∶1 80 0.291 1.20
9 120 50 30∶1 60 0.273 1.13
K1 3.47 3.39 3.40 3.31
K2 3.51 3.52 3.49 3.51
K3 3.50 3.57 3.59 3.66
k1 1.16 1.13 1.13 1.10
k2 1.17 1.17 1.16 1.17
k3 1.17 1.19 1.20 1.22
R 0.01 0.06 0.07 0.12
优化方案 A1 B3 C3 D3
2.3.2　重复性试验
按选定的 A1B3C3D3条件进行 5次平行试验 ,结
果见表 3。由此可知 , 用此工艺提取加杨叶中总黄
酮 ,相对标准偏差较小 , 结果重现性好 ,该工艺稳定
可行。
表 3　重复性试验结果 /%
指标 1 2 3 4 5
得率 1.26 1.28 1.27 1.28 1.25
RSD 1.03
2.3.3　精密度试验
精密度试验结果见表 4。从表 4可以看出 ,用分
光光度法测定加杨叶中总黄酮含量 ,相对标准偏差较
小 ,精密度较高 ,所得数据精确 。
表 4　精密度试验结果(n=5)
指标 1 2 3 4 5
总黄酮含量 /mg·g-1 12.71 12.65 12.73 12.63 12.65
RSD/% 0.34
2.3.4　加样回收试验
加样回收试验结果见表 5。由此可以看出 ,平均
回收率为 98.92%, RSD=1.54%(n=5),说明此工
艺提取加杨叶总黄酮是可行的。
表 5　加样回收率测定结果
样品
号
样品中总黄
酮含量 /mg
芦丁加
入量 /mg
测定
量 /mg
回收
率 /%
平均回收
率 /%
RSD
/%
1 12.68 1.00 13.65 97.00
2 12.68 3.00 15.61 97.67
3 12.68 5.00 17.69 100.20 98.92 1.54
4 12.68 7.00 19.63 99.29
5 12.68 9.00 21.72 100.44
3　结　论
本研究通过单因素及正交试验 ,得出 4个因素对
黄酮得率的影响从大到小依次是:温度 >液料比 >乙
醇浓度 >提取时间。方差分析也表明:液料比 、乙醇
浓度对黄酮得率有显著影响 ,温度对黄酮得率有非常
显著的影响。为节省时间 ,提高效率 ,我们缩短了提取
时间 ,确定加杨叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取
时间 60min, 乙醇浓度 50%, 液料比为 40∶1, 温度
80℃。其重复性试验 RSD为 1.03%,表明重现性良
好;精密度试验 RSD为 0.34%,表明所用仪器精密度
良好;加样平均回收率为 98.92%, RSD为 1.54%,表
明此方法基本稳定 、准确。因此 ,本试验设定的技术参
数和方法 ,适用于加杨叶总黄酮提取工艺的优化。
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(责任编辑　葛华忠)
　应用研究