全 文 ：2010年 9月 Vol.28 No.9September2010 ChineseJournalofChromatography 902 ～ 904
技术与应用 DOI:10.3724/SP.J.1123.2010.00902
＊通讯联系人:肖红斌 ,博士 ,研究员.E-mail:hbxiao@dicp.ac.cn.
基金项目:国家 “重大新药创制 ”科技重大专项(No.2009ZX09502-023)和中国科学院重要方向项目(No.KSCX2-YW-R-209).
收稿日期:2010-04-07
制备型高效液相色谱法分离纯化川西
獐牙菜提取物中的龙胆苦苷
雷宇佳 , 　高明哲 , 　王　莉 , 　肖红斌＊
(中国科学院大连化学物理研究所 , 辽宁 大连 116023)
摘要:龙胆苦苷(GPS)是龙胆类药材及其相关制品质量控制的指标成分。本研究利用制备型高效液相色谱从川西
獐牙菜提取物中分离纯化龙胆苦苷对照品。对制备色谱的流动相组成 、流速 、进样量和检测波长等制备参数进行
了优化。采用的色谱柱为 C18柱(200mm×50 mm, 5μm), 流动相为甲醇和 0.1%乙酸水溶液(体积比为 30∶70),
流速为 75mL/min,检测波长为 254 nm, 进样体积为 500 μL。在 30 min的运行时间内 , 龙胆苦苷与其他干扰成分
得到了很好的分离 , 产品纯度达到了 99%以上。此方法具有快速高效 、产品纯度高的特点 ,可用于制备龙胆苦苷对
照品和对龙胆苦苷制品的质量控制。
关键词:制备型高效液相色谱法;龙胆苦苷;川西獐牙菜
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2010)09-0902-03
Preparationofgentiopicrosidefromtheextract
ofSwertiamussotiiFranchbypreparative
highperformanceliquidchromatography
LEIYujia, GAOMingzhe, WANGLi, XIAOHongbin＊
(DalianInstituteofChemicalPhysics, ChineseAcademyofSciences, Dalian116023 , China)
Abstract:Anewmethodforisolationofgentiopicroside(GPS)fromSwertiamussotiiFranch
withreversedphasepreparativehighperformanceliquidchromatography(Pre-HPLC)isde-
scribed.After95%ethanolextractwasobtainedwithsolventextractionandmacroporousresin
separation, afractioncontainingGPSwasacquiredandsubjectedtoPre-HPLCforisolationof
targetcomponent.Theoptimumoperationparameterswereselectedasfolows:aC18 column
(200mm×50 mm, 5 μm), methanol-0.1%aceticwater(30∶70 , v/v)asthemobilephaseat
flowrateof75 mL/min, thedetectionwavelengthat254 nm, andtheinjectionvolumeof500
μLatthemassconcentrationof225 g/L.ThepurityoftheproductwasdetectedbyHPLC
method.Theresultshowedthatthepurityofproductwasabove99%.Theefectiveandrapid
methodhasbeensuccessfulyappliedtothepreparationofGPSfromSwertiamussotiiFranch.
Keywords:preparativehighperformanceliquidchromatography(Pre-HPLC);gentiopicro-
side;SwertiamussotiiFranch
　　川西獐牙菜 (SwertiamussotiiFranch)系龙
胆科獐牙菜属一年生草本植物 ,主要分布在四川省
西北部和青海省玉树地区[ 1] 。其全草可用于治疗
肝胆疾病 [ 2] 。研究表明川西獐牙菜中主要含有龙
胆苦苷(GPS)、獐牙菜苦苷 、芒果苷 、当药黄素和齐
墩果酸等成分 [ 3] 。 GPS作为川西獐牙菜的主要有
效成分之一 [ 4] , 具有保肝 、健胃利胆和降压等作
用[ 5] 。研究也表明 GPS有较强的致 DNA损伤和致
突变作用 [ 6] ,从而引起人们对含 GPS药品的安全性
的关注。由于 GPS纯品的需求量较大 ,因此分离制
备 GPS是控制龙胆科中草药及其相关制品的质量
和安全性评价的重要环节 。目前 GPS的分离制备
方法主要是采用大孔树脂吸附分离法从濒危植物秦
艽中提取 [ 7-9] ,例如:张雅惠等[ 8]发现 HPD-100型
　第 9期 雷宇佳 ,等:制备型高效液相色谱法分离纯化川西獐牙菜提取物中的龙胆苦苷
大孔树脂对 GPS的吸附能力优于其他树脂 ,并通过
此方法分离得到 GPS,其纯度达到 73.25%;陈国
锋 [ 9]等通过星点设计-效应面优化法优化分离条件 ,
使 HPD-300 树脂分离纯化 GPS的纯度达到
78.5%。这些方法均需要进一步纯化才能制备高纯
度的 GPS。皇甫泽坤等 [ 10]用高速逆流色谱从秦艽
中分离制备得到纯度为 94%的 GPS,许有威等 [ 11]
用高速逆流色谱从龙胆中分离得到纯度为 99%的
GPS,但也存在分离时间过长等不足之处 [ 12] 。
　　制备型高效液相色谱(Pre-HPLC)作为一种高
效的分离纯化技术有着溶剂系统简单 、单次分离时
间短 、分离效率高等优点[ 12] 。为了深层次利用开发
川西獐牙菜等药用植物 ,控制相关药品的质量 ,我们
采用 Pre-HPLC法 ,运用本实验室装填的动态轴向
压缩制备色谱柱 ,从川西獐牙菜中分离制备了高纯
度的 GPS。
1　实验部分
1.1　仪器 、试剂与材料
　　WatersDelta4000制备型高效液相色谱仪 ,
Waters2690型高效液相色谱仪 ,配 996型二极管阵
列检测器(美国 Waters公司);FiniganTSQ三重
四极杆质谱仪(美国 ThermoFisher公司);旋转蒸
发仪(日本 Eyela公司)。
　　甲醇(色谱纯 , 中国禹王试剂公司);分析型
HPLC用乙酸(色谱纯 ,美国 Tedia公司), 制备型
HPLC用乙酸(分析纯 ,沈阳化学试剂厂);实验用水
由 Milipore纯水系统制备。
　　川西獐牙菜由中国科学院西北高原生物研究所
鉴定并提供 。
1.2　原料处理
　　川西獐牙菜全草切段 ,用 95%乙醇回流提取 ,
减压蒸馏得川西獐牙菜浸膏 ,加水悬混 ,依次用 3倍
体积的乙酸乙酯 、正丁醇萃取 。将正丁醇萃取部分
浓缩蒸干 ,溶于 5%乙醇 ,过 HP-20大孔树脂 ,收集
30%乙醇洗脱产物 ,减压蒸馏得膏状物。
1.3　色谱条件
1.3.1　制备型 HPLC条件
　　本实验室装填 50 mm内径的美国 Varian公司
动态轴向加压柱 ,装填填料为 5 μmMicrosorbC18
硅胶 ,柱装填高度为 200 mm;流动相为甲醇-0.1%
乙酸水溶液(体积比为 30∶70),流速为 75 mL/min;
进样量为 500 μL;检测波长为 254 nm。
1.3.2　分析型 HPLC条件
　　NovapakC18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 4
μm);流动相 A为甲醇 , B为 0.1%乙酸水溶液(体
积比为 25∶75),流速为 0.6 mL/min;进样量为 10
μL;检测波长为 274 nm。
1.4　对照品的制备
　　将膏状产物用水溶解 ,制成 225 g/L的供试品
溶液 , 经 0.45 μm微孔滤膜过滤。采用制备型
HPLC柱分离 ,多次进样 ,收集 18 ～ 20 min洗脱的
色谱峰(见图 1),浓缩干燥得到对照品样品 。
图 1　GPS的制备 HPLC谱图
Fig.1　Pre-HPLCchromatogramofGPS　
2　结果与讨论
2.1　产品纯度的测定
　　产物经分析型 HPLC检测 ,归一化定量 ,其纯度
(以质量分数计)在 99%以上(如图 2所示)。
图 2　GPS产品的HPLC纯度分析谱图
Fig.2　HPLCchromatogramofGPSproduct
2.2　结构确证
　　在制备产物的电喷雾质谱(ESI-MS)谱图(如图
3所示)中 ,主要显示 m/z356.9和 194.7的碎片
峰 ,分别对应于 GPS的准分子离子峰 [ M+H] +和
失去 1个葡萄糖的苷元峰 [ M+H-162] +。同时 ,
该制备产物的核磁共振谱(NMR)、紫外吸收(UV)
等数据与文献 [ 3]相符 ,据此判断该化合物为 GPS。
2.3　样品溶解条件的选择
　　样品溶解条件的选择对样品的制备影响很大 ,
用于溶解样品的溶剂应与流动相尽可能一致 ,同时
·903·
色 谱 第 28卷
图 3　制备产物的ESI-MS谱图
Fig.3　ESI-MSspectrumofGPSproductinpositivemode
不干扰样品分离 。本实验用水做溶剂 ,制得质量浓
度为 225 g/L的样品溶液。
2.4　流动相的选择
　　甲醇作为流动相组分具有价格低廉 、易分离的
特点 ,但由于流动相中甲醇 -水的比例和速度都难以
达到需要的分离效果 ,因此考察了添加 0.1%乙酸
情况下的分离情况。结果显示在甲醇-0.1%乙酸水
溶液的体积比为 30∶70的情况下分离度最好。
2.5　流速和进样量的选择
　　制备型 HPLC流动相的流速 、进样量分别按照
文献 [ 13]进行优化 。在综合考虑分离时间 、分离效
果 、样品浓缩等因素后 , 流动相流速选择为 75
mL/min,进样量选择为 500 μL。
3　结论
　　本实验建立了制备 GPS对照品的方法 ,操作方
便 ,重现性好 ,产品纯度高 ,可用于 GPS对照品的制
备和对 GPS制品的质量控制 。并且可同时收集到
较高浓度的川西獐牙菜活性成分獐牙菜苦苷和芒果
苷 ,供进一步纯化研究 。
参考文献:
[ 1] 　ZouHY.DevelopmentandApplicationofHerbalMedicine
inQinghaiProvince.Beijing:EastPublishingHouse(邹寒
雁.青海省中药资源开发及利用研究.北京:东方出版社),
1990:40
[ 2] 　NorthwestPlateauInstituteofBiology, ChineseAcademyof
Sciences.RecordofPlantsinQinghai:Vol. 3.Xining:
QinghaiPeople sPress(中国科学院西北高原生物研究所.
青海植物志:第 3卷.西宁:青海人民出版社), 1996:8
[ 3] 　BorosCA, StermitzFR.JNatProd, 1990, 53:1055
[ 4] 　WangCH, ChengXM, AnnieBlighSW, etal.JPharm
BiomedAnal, 2007, 44:1113
[ 5] 　WangCJ, WangZM, WangWH, etal.ChinaJournalof
ChineseMateriaMedica(王彩君 , 王智民 , 王维皓 , 等.中国
中药杂志), 2009, 34(23):2987
[ 6] 　MustafayevaK, GiorgioCD, EliasR, etal.JNatProd,
2010, 73(2):99
[ 7] 　WangLG.LishizhenMedicineandMateriaMedicaResearch
(王良贵.时珍国医国药), 2007, 18(11):2723
[ 8] 　ZhangYH, SunW J.ChineseJournalofPharmaceutical
Analysis(张雅惠 , 孙文基.药物分析杂志), 2007, 27(11):
1752
[ 9] 　ChenGF, HanLM, ShiW, etal.ChinesePharmaceutical
Journal(陈国锋 , 韩丽妹 , 施雯 , 等.中国药学杂志), 2009,
44(15):1163
[ 10] 　HuangfuZK, NiSF, SunWJ, etal.ChineseJournalof
AnalyticalChemistry(皇甫泽坤 , 倪士峰 , 孙文基 , 等.分
析化学), 2007, 35(6):883
[ 11] 　XuYW, QiY, HanX, etal.ChinaJournalofChinese
MateriaMedica(许有威 , 齐艳 , 韩旭 , 等.中国中药杂志),
2007, 32(24):2595
[ 12] 　HouZG, LuoJG, KongLY.ChineseJournalofNatural
Medicine(侯志国 , 罗建光 , 孔令义.中国天然药物),
2010, 8(1):62
[ 13] 　GaoMZ, YuanXY, XiaoHB, etal.ChineseJournalof
Chromatography(高明哲 , 袁晓艳 , 肖红斌 , 等.色谱),
2008, 26(3):362
·904·