全 文 ：［收稿日期］ 20130717(002)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81102819) ;江苏省自然科学基金项目(BK2012358) ;中央高校基本科研业务费专项(JKQ2011023)
［第一作者］ 张峻颖，博士，讲师，从事中药新剂型及质量分析研究，Tel:025-86185252，E-mail:ivy366300@ yahoo． com． cn
［通讯作者］ * 吴春勇，博士，副教授，从事药物分析研究，Tel:025-83271269，E-mail:analysis99@ 126． com
HPLC同时测定香蜂花药材中的 3 种有效成分
张峻颖1，冯超2，徐雪2，张雷3，吴春勇2，4*
( 1. 中国药科大学中药制剂教研室，南京 211198; 2. 中国药科大学药物分析教研室，南京 210009;
3. 山东省食品药品检验所，济南 250101;
4. 药物质量与安全预警教育部重点实验( 中国药科大学) ，南京 210009)
［摘要］ 目的:建立一种同时测定香蜂花药材中迷迭香酸、咖啡酸和咖啡酸乙酯含量的 ＲP-HPLC分析法。方法:Hanbon
Megres C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相 A为甲酸-乙腈-水(0. 5∶ 20∶ 80) ，B为甲酸-甲醇-乙腈(0. 5∶ 40∶ 60) ，梯度
洗脱(0% ～25 min，0% ～45%B;25% ～ 30 min，45% ～ 100% B;30% ～ 30. 1 min，100% ～ 0% B) ，流速 1. 0 mL·min －1，柱温 35
℃，检测波长 330 nm。结果:迷迭香酸、咖啡酸和咖啡酸乙酯分别在 6. 0 ～ 300. 0，0. 15 ～ 7. 5 mg·L －1和 0. 15 ～ 7. 5 mg·L －1线性
关系良好，平均加样回收率(n = 6)分别为 99. 48%，99. 56%，101. 7%。结论:该方法准确，简便，适用于香蜂花药材的质量分
析检验。
［关键词］ 香蜂花;迷迭香酸;咖啡酸;咖啡酸乙酯;高效液相色谱
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)24-0078-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013240078
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20131011． 1513． 008． html
［网络出版时间］ 2013-10-11 15:13
Simultaneous Determination of Three Active Components in
Melissa officinalis by HPLC
ZHANG Jun-ying1，FENG Chao2，XU Xue2，ZHANG Lei3，WU Chun-yong2，4*
(1. Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，
Nanjing 211198，China;2. Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，
Nanjing 210009，China;3. Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China;
4. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacorigilance (China Pharmaceutical University) ，
Ministry of Education，Nanjing 210009，China)
［Abstract］ Objective:The purpose of this study is to simultaneously determine the content of rosmarinic
acid，caffeic acid and ethyl caffeate in Melissa officinalis by ＲP-HPLC． Method:Hanbon Megres C18 column (4. 6
mm ×250 mm，5 μm)was adopted． The mobile phase consisted of formic acid-acetonitrile-water (0. 5 ∶ 20 ∶ 80)
and formic acid-methanol-acetonitrile (0. 5∶ 40∶ 60)with gradient elution program (0-25 min，0% -45%B;25-30
min，45% -100% B;30-30. 1 min，100% -0% B)． The flow rate was 1. 0 mL·min －1 ． The column temperature
was set at 35 ℃ and the detection wavelength was 330 nm． Ｒesult:The linear ranges of rosmarinic acid，caffeic
acid and ethyl caffeate were 6. 0-300. 0，0. 15-7. 5 and 0. 15-7. 5 mg·L －1 respectively． The average recoveries
(n = 6) for the sample preparation of the markers were 99. 48%，99. 56%， and 101. 7% respectively．
Conclusion:The quantitative method for rosmarinic acid，caffeic acid and ethyl caffeate by HPLC can provide the
·87·
第 19 卷第 24 期
2013 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 24
Dec．，2013
basis for quality control of M． officinalis．
［Key words］ Melissa officinalis;rosmarinic acid;caffeic acid;ethyl caffeate;HPLC
香蜂花又名香蜂草、柠檬香蜂草、蜜蜂花、马薄
荷、马大拿、美国薄荷、长叶薄荷、野香柠檬、梦娜薄
荷，为唇形科蜜蜂花属多年生草本植物。原产苏联、
伊朗至地中海及大西洋沿岸，目前广泛种植于欧洲、
中亚和北美地区，我国已有引种栽培［1-2］。在国外，
香蜂花作为温和的镇静剂、解痉剂、抗菌剂而被广泛
使用，其药用部位是叶，含酚酸类、挥发油、黄酮类等
多种成分［3-6］。近年来国内外对香蜂花的药理作用
研究非常火热，研究表明其具有镇静、抗肠胃气胀、
解痉、抗菌和抗病毒等多种药理活性［7-9］。
目前，对于我国栽培的香蜂花的质量研究鲜有
报道。2010 年版《中国药典》中尚未收录香蜂花药
材的质量标准，在临床使用中存在安全性和有效性
问题。我们的前期研究发现迷迭香酸、咖啡酸和咖
啡酸乙酯是香蜂花叶中的主要酚类成分。迷迭香酸
具有抗炎抗菌活性和很强的抗氧化性;咖啡酸能抗
菌抗病毒，还具有提高凝血因子的功能，可升高白细
胞和血小板;咖啡酸乙酯在清除和抑制自由基、抗肿
瘤、抗菌以及抗病毒等方面具有显著的作用［7-9］。
为更全面评价香蜂花药材的质量，本文采用高效液
相色谱法建立了同时测定香蜂花叶中迷迭香酸、咖
啡酸和咖啡酸乙酯的含量测定方法，可用于香蜂花
叶的定量分析，为其资源的开发利用及质量控制提
供理论依据。
1 材料
岛津 LC-2010C型液相色谱仪(配四元泵、自动
进样器、柱温箱、紫外检测器和 CLASS-VP色谱工作
站，日本 Shimadzu 公司) ，KH-250DB 型数控超声波
清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司) ，AB135-S 型
电子天平(梅特勒 Mettler Toledo) ，Milli-Q 型超纯水
系统(美国 Millipore公司) ，旗箭 Q-250A3 型高速多
功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)。
香蜂花叶采自云南，经中国药科大学中药学院
黄罗生副教授鉴定为香蜂花 Melissa officinalis L． 的
新鲜叶，采收后自然阴干。迷迭香酸对照品(批号
120809，纯度 ＞ 98%，南京泽郎医药科技有限公
司) ，咖啡酸对照品(批号 110885-200102，中国药品
生物制品检定所) ，咖啡酸乙酯对照品(批号
111678-200401，中国药品生物制品检定所)。甲醇
与乙腈为色谱纯(TEDIA) ，其他试剂均为分析纯，水
为去离子水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件［10］ Hanbon Megres C18色谱柱(4. 6
mm ×250 mm，5 μm) ，流动相 A甲酸-乙腈-水(0. 5∶
20∶ 80) ，B 甲酸-甲醇-乙腈(0. 5 ∶ 40 ∶ 60) ，梯度洗脱
(0% ～ 25 min，0% ～ 45% B;25 ～ 30 min，45% ～
100% B;30 ～ 30. 1 min，100% ～ 0% B) ，流速 1. 0
mL·min －1，检测波长 330 nm，柱温 35 ℃，进样量
20 μL。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 混合对照品溶液 取咖啡酸、迷迭香酸、咖
啡酸乙酯对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解后作
为对照品储备液。精密量取各储备液适量，置同一
10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得咖啡酸、
迷迭香酸、咖啡酸乙酯的质量浓度分别为 0. 15，
6. 00，0. 15 g·L －1的混合对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液 取香蜂花叶样品，用粉碎机粉
碎后，取约 0. 1 g，精密称定，置 100 mL圆底烧瓶中，
精密加入 20 mL 70%乙醇，称定质量，加热回流 1 h，
放冷，再称定质量，用 70%乙醇补足减失的质量，摇
匀，经 0. 45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2. 3 系统适用性试验 分别吸取混合对照品溶液
和供试品溶液，按 2. 1 项下色谱条件，分别进样，记
录色谱图。结果表明，在上述色谱条件下，咖啡酸、
迷迭香酸和咖啡酸乙酯的保留时间分别约为 6. 2，
12. 8，20. 9 min，3 种成分的分离良好，对照品和供试
品的典型色谱图见图 1。
A．混合对照品;B．样品;1. 咖啡酸;
2. 迷迭香酸;3. 咖啡酸乙酯
图 1 香蜂花 HPLC
2. 4 线性关系考察 精密量取不同体积的混合对
照品溶液，用流动相 A 定量稀释，制得 6 个不同质
·97·
张峻颖，等:HPLC同时测定香蜂花药材中的 3 种有效成分
量浓度的混合对照品溶液，其中迷迭香酸分别为 6，
24，60，120，240，300 mg·L －1，咖啡酸与咖啡酸乙酯分
别为 0. 15，0. 6，1. 5，3，6，7. 5 mg·L －1。按上述 HPLC
条件进样测定，记录色谱图。以对照品质量浓度
(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲
线，进行线性关系考察，得咖啡酸的回归方程为A =
1. 38 × 105C + 2. 87 × 104(r = 0. 999 9) ，线性范围为
0. 15 ～ 7. 5 mg·L －1。迷迭香酸的回归方程为A =
5. 87 × 104C + 8. 36 × 103(r = 0. 999 7) ，线性范围为
6. 0 ～ 300. 0 mg·L －1。咖啡酸乙酯的回归方程为A =
1. 58 × 105C + 8. 80 × 102(r = 1. 000 0) ，线性范围
为 0. 15 ～ 7. 5 mg·L －1。
2. 5 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液
适量，按上述 HPLC条件连续进样 6 次，测定峰面积，
咖啡酸、迷迭香酸与咖啡酸乙酯峰面积的 ＲSD 分别
为 0. 78%，0. 90%，1. 02%，表明仪器精密度良好。
2. 6 溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，于室温
下密闭避光保存，分别在 0，2，4，8 h 进样分析，记录
峰面积，咖啡酸、迷迭香酸和咖啡酸乙酯峰面积的
ＲSD分别为 1. 63%，1. 68%，1. 41%，表明供试品溶
液在 8 h内稳定性良好。
2. 7 重复性试验 取同一批香蜂花叶粗粉约
0. 1 g，共 6 份，精密称定，按 2. 2. 2 项下的方法制备
供试品溶液，依法测定，计算各成分的含量。结果表
明，咖啡酸、迷迭香酸和咖啡酸乙酯含量的 ＲSD 分
别为 1. 25%，0. 58%，1. 97%，表明本方法重复性
良好。
2. 8 加样回收率试验 取已知含量的同一批香蜂花
叶粗粉(咖啡酸含量为 0. 37 mg·g －1，迷迭香酸含量为
14. 91 mg·g －1，咖啡酸乙酯含量为 0. 09 mg·g －1)约
0. 05 g，共 6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密
加入 0. 1 mL混合对照品溶液(咖啡酸、迷迭香酸和咖
啡酸乙酯的质量浓度分别为 0. 15，6. 00，0. 15 g·
L －1) ，按供试品溶液的制备方法处理，测定，计算加
样回收率，结果见表 1。
2. 9 样品测定 取各批香蜂花叶粗粉，精密称定，
照 2. 2. 2 项下的方法制备供试品溶液，依法测定，记
录峰面积。每份样品重复测定 3 次，按外标法计算
样品中咖啡酸、迷迭香酸和咖啡酸乙酯的含量，结果
见表 2。
3 讨论
曾尝试甲酸-乙腈-水和甲酸-甲醇-乙腈-水系统
进行等度洗脱，发现香蜂花中成分较多，等度条件下
极性较低成分洗脱时间太长，故选用梯度洗脱，可得
表 1 香蜂花药材中 3 种成分加样回收率试验
成分
样品
含量
/mg
加入量
/mg
实测量
/mg
回收率
/%
平均
回收率
/%
ＲSD
/%
咖啡酸 0. 018 6 0. 015 0. 033 4 98. 67 99. 56 1. 32
0. 018 5 0. 015 0. 033 3 98. 67
0. 019 0 0. 015 0. 033 9 99. 33
0. 019 6 0. 015 0. 034 9 102. 00
0. 018 1 0. 015 0. 032 9 98. 67
0. 018 6 0. 015 0. 033 6 100. 01
迷迭香酸 0. 714 5 0. 6 1. 320 1 100. 93 99. 48 1. 59
0. 707 7 0. 6 1. 313 9 101. 03
0. 729 8 0. 6 1. 321 2 98. 57
0. 750 3 0. 6 1. 336 5 97. 70
0. 695 2 0. 6 1. 282 7 97. 92
0. 714 9 0. 6 1. 319 1 100. 70
咖啡酸乙酯 0. 004 5 0. 015 0. 019 8 102. 00 101. 7 1. 42
0. 004 5 0. 015 0. 019 9 102. 67
0. 004 6 0. 015 0. 019 9 102. 00
0. 004 8 0. 015 0. 019 7 99. 33
0. 004 8 0. 015 0. 019 9 100. 67
0. 004 5 0. 015 0. 020 0 103. 33
表 2 香蜂花药材含量测定 mg·g － 1
批号 咖啡酸 迷迭香酸 咖啡酸乙酯
120711 0. 37 14. 91 0. 09
120811 0. 54 28. 18 0. 12
120817 0. 72 26. 54 0. 11
到分离度好、出峰时间适宜的各组分色谱峰。在流
动相中加入 0. 05% ～ 1%的甲酸，考察对峰形和分
离度的影响，结果表明流动相中含有 0. 5%的甲酸
时可有效抑制酚酸解离，色谱峰的峰形尖锐，并能有
效地减少拖尾现象的产生。
试验中曾对比了回流提取 1 h 和超声波辅助提
取 1 h 2 种提取条件，结果表明，回流提取所得迷迭
香酸、咖啡酸和咖啡酸乙酯含量最高，故选择回流
提取为提取方法。同时考察了 30%，50%，70%的
乙醇作为提取溶剂的情况，结果表明迷迭香酸和咖
啡酸乙酯在 70%乙醇中提取率最高，而咖啡酸在
50%乙醇中提取率最高。香蜂花中咖啡酸的含量非
常低，不足迷迭香酸的 10%，综合考虑用 70%乙醇
为提取溶剂。迷迭香酸属多酚类化合物，结构不稳
定，对光照、金属离子等都比较敏感，所以提取时应
避免其降解。
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 24
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檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
欧洲药典 7. 0 版已收载香蜂花叶，但含量测定
中仅规定迷迭香酸一种成分。我们的前期研究发现
迷迭香酸，咖啡酸及咖啡酸乙酯为香蜂花的主要酚
类成分。本实验建立了 ＲP-HPLC 法同时测定香蜂
花中迷迭香酸、咖啡酸和咖啡酸乙酯的含量，实验结
果表明，方法简便快速，结果准确，重复性好，可为
香蜂花的质量控制提供依据。
［参考文献］
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［责任编辑 顾雪竹］
［收稿日期］ 20130812012
［基金项目］ 四川省教育厅课题(P09304)
［通讯作者］ * 段渠，副研究员，硕士生导师，从事中医美容的临床实验研究及皮外科特色制剂研究，E-mail:duanqu@ 126． com
黄白甘草洗剂的 HPLC指纹图谱研究
段渠1* ，林俊芝1，张定堃2
( 1. 成都中医药大学附属医院，成都 610072; 2. 成都中医药大学药学院，成都 611137)
［摘要］ 目的:建立黄白甘草洗剂的 HPLC 指纹图谱的检测方法。方法:采用 Kromasil C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，
5 μm) ，流动相乙腈-0. 05%磷酸水梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 237 nm，对 10 批黄白甘草洗剂进行 HPLC 指纹图
谱检测，采用“中药色谱指纹图谱评价系统 2004 年 A 版”进行评价。结果:黄白甘草洗剂采用该方法分离效果好，确定了 20
个共有峰，10 批洗剂的相似度均 ＞ 0. 9。结论:该方法重复性、稳定性好，建立的指纹图谱可为黄白甘草洗剂的质量评价提供
依据。
［关键词］ 黄白甘草洗剂;高效液相色谱;指纹图谱;相似度评价
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)24-0081-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013240081
Study on the HPLC Fingerprint of Huangbai Gancao Lotion
DUAN Qu1* ，LIN Jun-zhi1，ZHANG Ding-kun2
(1. Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China;
2. Chengdu University of TCM，College of Pharmacy，Chengdu 611137，China)
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 24
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