全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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［责任编辑 仝燕］
［收稿日期］ 20130729(009)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81102819) ;江苏省自然科学基金项目(BK2012358) ;中央高校基本科研业务费专项基金
(JKQ2011023)
［第一作者］ 张峻颖，博士，讲师，从事中药新剂型及质量分析研究，Tel:025-86185252，E-mail:ivy366300@ yahoo． com． cn
［通讯作者］ * 吴春勇，博士，副教授，从事药物分析研究，Tel:025-83271269，E-mail:analysis99@ 126. com
香蜂花中迷迭香酸的提取工艺优选
张峻颖1，付瑛2，朱孝云3，吴春勇4*
( 1. 中国药科大学中药制剂教研室，南京 211198; 2. 青岛市市立医院药学部，山东 青岛 266000;
3. 上海医药工业研究院，上海 200040; 4. 中国药科大学药物分析教研室，南京 210009)
［摘要］ 目的:优选香蜂花中迷迭香酸的提取工艺。方法:以迷迭香酸含量为指标，通过单因素试验考察提取溶剂、提取
方式、提取时间及溶剂用量对工艺的影响，采用正交试验考察提取次数、提取时间和加醇量对迷迭香酸含量的影响，优选香蜂
花的提取工艺。采用 HPLC测定迷迭香酸含量，色谱条件为 Hanbon Megres C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相甲酸-
乙腈-水(0. 5∶ 20∶ 80，A)与甲酸-甲醇-乙腈(0. 5∶ 40∶ 60，B)梯度洗脱(0 ～ 25 min，0% ～ 45% B;25 ～ 30 min，45% ～ 100% B) ，检
测波长 330 nm，进样量 20 μL。结果:最佳提取工艺为加 10 倍量 70%乙醇回流提取 3 次，每次 1 h;迷迭香酸平均提取量达
25. 27 mg·g －1。结论:优选的工艺稳定可行，为香蜂花的资源开发提供参考。
［关键词］ 香蜂花;迷迭香酸;提取工艺;单因素试验;正交试验;高效液相色谱
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)23-0007-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013230007
Optimization of Extraction Technology for Ｒosmarinic Acid
in Melissa officinalis L．
ZHANG Jun-ying1，FU Ying2，ZHU Xiao-yun3，WU Chun-yong4*
(1. Department of Pharmacelltics of Traditional Chinese Medicines，
China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China;
2. Department of Pharmacy，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266000，China;
3. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040，China;
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中国实验方剂学杂志
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Vol． 19，No． 23
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4. Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction technology of rosmarinic acid in Melissa officinalis．
Method:With the content of rosmarinic acid as index，based on single factor tests，effects of extraction time，
extraction times and the amount of ethanol on extraction technology were investigated by orthogonal test． HPLC was
employed to determine the content of rosmarinic acid and the chromatographic conditions were as follows:Hanbon
Megres C18 column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，mobile phase of formic acid-acetonitrile-water (0. 5 ∶ 20 ∶ 80，
A)and formic acid-methanol-acetonitrile (0. 5∶ 40∶ 60，B)with gradient elution program (0-25 min，0% -45%
B;25-30 min，45% -100% B) ，detection wavelength 330 nm， injection volume 20 μL． Ｒesult:Optimal
extraction technology was as following:extracted 3 times with 10 times the amount of 70% ethanol，1 h each time;
Yield of rosmarinic acid was up to 25. 27 mg·g －1 ． Conclusion:Optimized technology was stable and feasible to
provide a reference for resource development of M． officinalis．
［Key words］ Melissa officinalis;rosmarinic acid;extraction technology;single factor test;orthogonal
test;HPLC
香蜂花又名香蜂草、蜜蜂花，其茎叶具有独特的
柠檬芳香，含有较高的营养价值，并具有药用功效。
香蜂花原产于地中海沿岸，在欧洲、中亚、北美、亚洲
均可找到，我国已有引种栽培［1-2］。香蜂花在国外
常作为温和的镇静剂、解痉剂、抗菌剂被广泛使用，
并收载于《欧洲药典》。其叶中含酚酸类、挥发油、
黄酮类等多种成分［3-6］，具有镇静、抗肠胃气胀、解
痉、抗菌和抗病毒等多种药理活性［7-9］。
2010 年版《中国药典》尚未收录香蜂花药材，其
主要活性成分迷迭香酸的提取工艺研究尚未见报
道。迷迭香酸具有很强的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病
毒、免疫抑制等作用［10］，被广泛用于食品、化妆品、
医药等产业，《欧洲药典》将迷迭香酸含量作为香蜂
花药材的质量评价指标。本实验采用热回流技术从
香蜂花中提取迷迭香酸，通过单因素试验和正交试
验优化迷迭香酸的提取工艺，为香蜂花药材的综合
开发利用提供实验依据。
1 材料
LC-2010C型高效液相色谱仪(CLASS-VP 型色
谱工作站，日本岛津公司) ，AB135-S 型电子分析天
平(梅特勒-托利多公司) ，Milli-Q 型超纯水系统(美
国 Millipore公司) ，旗箭 Q-250A3 型高速多功能粉
碎机(上海冰都电器有限公司)。
香蜂花叶(购自云南，经中国药科大学中药学
院黄罗生副教授鉴定为香蜂花 Melissa officinalis L．
的新鲜叶，采收后自然阴干) ，迷迭香酸对照品(批
号 120809，纯度 ＞ 98%，南京泽郎医药科技有限公
司) ，咖啡酸对照品(批号 110885-200102，中国食品
药品检定研究院) ，甲醇、乙腈为色谱纯，水为去离
子水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 迷迭香酸的含量测定
2. 1. 1 色谱条件［11-12］ Hanbon Megres C18色谱柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相甲酸-乙腈-水
(0. 5∶ 20∶ 80，A)与甲酸-甲醇-乙腈(0. 5 ∶ 40 ∶ 60，B)
梯度洗脱(0 ～ 25 min，0% ～ 45% B;25 ～ 30 min，
45% ～ 100% B) ，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长
330 nm，柱温 35 ℃，进样量 20 μL，见图 1。
A．对照品;B．供试品;1. 咖啡酸;2. 迷迭香酸
图 1 香蜂花 HPLC
2. 1. 2 溶液的制备
2. 1. 2. 1 对照品溶液 取迷迭香酸对照品适量，精
密称定，加甲醇溶解并稀释，得迷迭香酸质量浓度
6. 0 g·L －1的对照品溶液。
2. 1. 2. 2 供试品溶液 取香蜂花叶样品，粉碎成粗
粉，取约 0. 5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加一定量
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Vol． 19，No． 23
Dec．，2013
70%乙醇浸泡 30 min，加热回流提取，过滤，取续滤
液并定容至 100 mL，即得。
2. 1. 3 线性关系考察 精密量取不同体积的对照
品溶液，用流动相 A 定量稀释，制得 6 个不同质量
浓度的对照品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条件进样，记
录色谱图，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵
坐标，得回归方程 Y = 5. 87 × 104X + 8. 36 × 103(r =
0. 999 7) ，线性范围 6. 0 ～ 300. 0 mg·L －1。
2. 1. 4 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液适
量，按 2. 1. 1 项下色谱条件连续进样 6 次，测定峰面
积，计算 ＲSD 0. 90%，表明仪器精密度良好。
2. 1. 5 稳定性试验 取同一供试品溶液，于室温下
密闭避光保存，分别在 0，2，4，8 h 进样分析，记录峰
面积，计算 ＲSD 0. 87%，表明供试品溶液在 8 h内稳
定性良好。
2. 1. 6 重复性试验 取同一批香蜂花叶粗粉约
0. 5 g，共 6 份，精密称定，按 2. 1. 2. 2 项下方法制备
供试品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条件进样，结果表明
迷迭香酸含量的 ＲSD 1. 28%，表明该方法重复性
良好。
2. 1. 7 加样回收率试验 取已知含量的同一批香
蜂花叶粗粉约 0. 25 g，共 6 份，精密称定，置圆底烧
瓶中，分别精密加入对照品溶液(迷迭香酸质量浓
度 6. 0 g·L －1)0. 5 mL，按 2. 1. 2. 2 项下方法制备供
试品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条件测定，结果迷迭香
酸的平均加样回收率 102. 0%，ＲSD 1. 87%。
2. 2 单因素试验考察
2. 2. 1 提取溶剂 精密称定香蜂花叶粗粉适量，共
4 份，分别加入 10 倍量水和体积分数为 30%，50%，
70%的乙醇溶液浸泡 30 min，回流提取 2 次，每次 1
h，经 0. 45 μm微孔滤膜滤过，按 2. 1. 1 项下色谱条
件测定，结果表明以 70%乙醇作为提取溶剂时所得
迷迭香酸含量最高。
2. 2. 2 提取方式 精密称定香蜂花叶粗粉适量，共
2 份，各加入 10 倍量 70%乙醇浸泡 30 min，分别进
行回流提取 1 h和超声波辅助提取 1 h，经 0. 45 μm
微孔滤膜滤过，按 2. 1. 1 项下色谱条件测定，结果表
明回流提取所得迷迭香酸含量较高。
2. 2. 3 提取时间 精密称定香蜂花叶粗粉适量，共
4 份，各加入 10 倍量 70%乙醇浸泡 30 min，分别回
流提取 1，1. 5，2，2. 5 h，按 2. 1. 2. 2 项下方法制备供
试品溶液，经 0. 45 μm微孔滤膜滤过，按 2. 1. 1 项下
色谱条件测定，结果显示提取 1 h 所得迷迭香酸的
含量最高，而提取 2 h 后，迷迭香酸含量稍有下降，
故提取时间选择 0. 5，1，1. 5 h共 3 个水平。
2. 2. 4 溶剂用量 精密称定香蜂花叶粗粉适量，共
5 份，分别加入 6，8，10，12，15 倍量 70%乙醇浸泡
30 min，回流提取 2 次，每次 1 h，按 2. 1. 2. 2 项下方
法制备供试品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条件测定，结
果表明迷迭香酸含量随乙醇用量的增加而增加，以
12 倍量 70%乙醇为提取溶剂时迷迭香酸含量最高，
故溶剂用量选取 8，10，12 倍量进行考察。
2. 3 正交试验优选 在单因素试验基础上，以迷迭
香酸含量为考察指标，选取提取次数、提取时间、加
醇量为考察因素，每个因素设 3 个水平，按 L9(3
4)
正交表进行试验筛选最优处方，因素水平见表 1，试
验安排及结果见表 2，方差分析见表 3。
表 1 香蜂花中迷迭香酸的提取工艺正交试验因素水平
水平 A提取数 /次 B提取时间 /h C加醇量 /倍
1 1 0. 5 8
2 2 1. 0 10
3 3 1. 5 12
表 2 香蜂花中迷迭香酸的提取工艺正交试验安排
No． A B C 迷迭香酸 /mg·g － 1
1 1 1 1 9. 99
2 1 2 2 13. 04
3 1 3 3 11. 17
4 2 1 2 20. 07
5 2 2 3 21. 73
6 2 3 1 14. 82
7 3 1 3 21. 85
8 3 2 1 19. 80
9 3 3 2 23. 19
K1 11. 400 17. 303 14. 870
K2 18. 873 18. 190 18. 767
K3 21. 613 16. 393 18. 250
Ｒ 10. 213 1. 797 3. 897
表 3 提取工艺方差分析
方差来源 SS f MS F P
A 167. 670 2 83. 835 34. 465 ＜ 0. 05
B 4. 842 2 2. 421 0. 995 ＞ 0. 05
C 26. 875 2 13. 438 5. 524 ＞ 0. 05
D(误差) 4. 87 2 2. 435
从直观分析可知，各因素对迷迭香酸含量的影
响顺序为 A ＞ C ＞ B。方差分析结果表明提取次数
对迷迭香酸含量的影响具有显著性差异，而提取时
·9·
张峻颖，等:香蜂花中迷迭香酸的提取工艺优选
间和加醇量则对迷迭香酸含量的影响无显著性差
异，确定最佳水平为 A3B2C2，即加 10 倍量 70%乙醇
回流提取 3 次，每次 1 h。
2. 4 验证试验 称取香蜂花叶粗粉 3 份，每份 0. 5
g，按优选的提取工艺进行 3 次验证试验，结果迷迭
香酸平均提取量 25. 27 mg·g －1，ＲSD 0. 6%，说明优
选的工艺稳定可行。
3 讨论
目前，各版《中国药典》和各地方药材标准中均
未见香蜂花药材的质量标准，而前期研究发现迷迭
香酸和咖啡酸是香蜂花叶中主要酚类成分，但咖啡
酸含量较低，不足迷迭香酸的 10%，故仅选取迷迭
香酸含量为考察指标优选香蜂花的提取工艺。
香蜂花中成分较多，等度条件下极性较弱成分
的洗脱时间太长，故选用梯度洗脱，可得到分离度
好、出峰时间适宜的各组分色谱峰;在流动相中加入
0. 5%甲酸时可有效抑制酚酸解离，使色谱峰的峰形
尖锐，并能有效减少拖尾现象的产生。
迷迭香酸属多酚类化合物，结构不稳定，对光
照、金属离子等均比较敏感［13］，故在提取过程中，宜
采取避光条件、使用去离子水等措施。在单因素试
验考察中，发现提取 1 h所得迷迭香酸含量最高，而
提取 2 h后迷迭香酸含量反而稍有下降，这可能与
长时间回流提取导致小部分迷迭香酸发生降解有
关，与文献报道的温度对迷迭香酸稳定性略有影响
的观点一致［13］，因此在回流提取过程中提取时间不
宜过长;曾尝试使用超声波提取法，但该法所得迷迭
香酸的含量较低，故不适合作为香蜂花中迷迭香酸
的提取方法。
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［责任编辑 仝燕］
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