全 文 ：〖实验研究〗
罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE术后肿瘤组织
HIF-1α和MMP及血清 AFP表达的影响
史传文1 , 　刘福利2
1.山东省泰山疗养院外科 ,山东 泰安 271000
2.山东省立医院消化内科 ,山东 济南 250012
Expressions of HIF-1α, MMP and AFP in serum after TACE
of rat hepatoma treated with Basil capsule
S H I Chuan-wen1 , LIU F u-li2
1.Department of S urgery , Taishan S anatorium , Taian 271000 , P.R.China
2.Department of Gastroenterology , Shandong P rovince Hospi tal , J inan 250012 , P.R.China
【摘要】　目的:观察罗勒胶囊对大鼠移植性
肝 癌 TACE 术 后 肿 瘤 组 织中 HIF-1α、
M MP-2 、MMP-9 及血清 AFP 表达的影响。
方法:建立大鼠移植性肝癌模型 , 造模成功后
随机分为非 TACE 对照组 、TACE+NS 对照
组 、TACE+罗勒胶囊大剂量组 、TACE +罗
勒胶囊中剂量组和 TACE+罗勒胶囊小剂量
组 5组 , 除对照组外 , 其余 4 组大鼠均进行
TACE 术 , 术后分别给予不同剂量罗勒胶囊
灌胃治疗。10 d 后处死大鼠 ,取出瘤块 , 免疫
组化 法检 测 瘤块 中 HIF-1α、 MMP-2 和
M MP-9的表达情况 , 应用酶联免疫吸附试验
(ELIS A)法测定大鼠血清中 AFP 表达情况。
结果:与 TACE+生理盐水组比较罗勒胶囊
大剂量组瘤质量明显降低(P <0.05), 与非
TACE 对照组比较 , TACE +NS 组 HIF-1α、
M MP-2 和 MM P-9 的表达均增高;罗勒胶囊
治疗组 HIF-1α、MM P-2 和 MMP-9 表达较
TACE+NS 组表达显著降低 , 并呈现一定的
剂量依赖性。 TACE +NS 组较非 TACE 组
血清中 AFP 表达显著降低。罗勒胶囊大 、中
剂量治疗组较非 TACE 组血清中 AFP 显著
降低 ,而与 TACE+NS 组比较 , 差异无统计
学意义 , P>0.05。肝癌组织中的 HIF-1α与
M MP-2 的表达成正相关 , P<0.01。结论:罗
勒胶囊对大鼠移植性肝癌具有改善 TACE 术
后乏氧的作用 , 并通过降低术后肿瘤乏氧微
环境中 HIF-1α和 MMP-2 及 M MP-9 的表
达 , 而起到 TACE 术对肝移植瘤的抑制作用。
中华肿瘤防治杂志 , 2009 , 16(17):1287-1291
[ ABSTRACT] 　OBJECTIVE:To obse rve the influence on expres-
sions o f H IF-1α, MMP-2 , MM P-9 and AFP o f serum in hypoxia
env ir onment af te r TACE o f rat hepatoma with Basil capsule.
METHODS:The ra ts w ere r andomly assigned into fiv e gr oups af-
ter the models we re build:a gr oup without TACE;TACE+NS
g roup;TACE+mini-do se Basil capsule g roup;TACE+ middle-
do se Basil capsule g roup;TACE + lar ge do se Basil capsule
g roup.Fo r the TACE g roup , the heal of TACE was simulated.
Fo r the TACE+ Basil capsule gr oups the diffe rent doses o f Basil
capsule w ere administered.Ten day s later the rats w ere killed
and the liver tumo rs w ere collected and dyed w ith HE.The ex-
pressions of H IF-1α, M MP-2 and MMP-9 in hepa toma focus
we re detected with immunohisto chemistry.The levels of AFP
we re detected w ith ELISA.RESULTS:The tumor weight of large
dose Basil capsule group deereased obvioushy than that in the
TACE+NS g roup(P<0.05)compared with the g roup without TA-
CE , the TACE +NS group had higher expressions of HIF-1α,
MMP-2 and MMP-9 , while different-dose Basil capsule g oups had
lower expressions than the TACE+NS g roup had.The TACE +NS
group had lower expressions than the g roup without TACE had.The
TACE + middle-dose Basil capsule and TACE + large-dose Basil
capsule g roups had low er the expressions than the g roup without TA-
CE had , but the expressions were no t different from tho se in the TA-
CE +NS group(P>0.05).The expression of HIF-1αw as positively
co rrelated with that of MMP-2 in liver cancer tissues (P <0.01).
CONCLUSIONS:Basil capsule can obviously improve hypoxia envi-
ronment in rat hepatoma after TACE and down-regulate the expres-
sions of HIF-1α, MMP-2 and MMP-9.Basil capsule has a do se de-
pendent inhibito ry action after TACE of rat hepatoma.
Ch in J Cancer Prev Treat , 2009 , 16(17):1287-1291
【基金项目】　山东省自然科学基金(J07YD07)
【第一作者简介】　史传文 ,男 , 山东泰安人 ,硕士 , 主要从事中西医结合基础专业肿瘤侵袭转移的防治研究工作。
E-mail:chuanwen2002@163.com
【通讯作者简介】　刘福利 ,男 , 山东菏泽人 ,博士 , 教授 , 主要从事消化内科消化系统肿瘤的临床治疗与研究工作。
Tel:86-531-88501732　E-mail:liufuli2002 @hotmail.com
·1287·中华肿瘤防治杂志 2009年 9月第 16卷第 17期　　CH IN J CANCER PREV T REAT , September 2009 , Vol.16　No.17
DOI :10.16073/j.cnki.cjcpt.2009.17.004
【关键词】　肝肿瘤 , 实验性;胶囊;罗勒属;肿瘤移植;大鼠
[ KEYWORDS] 　live r neoplasms , experimenta l;capsules;ocimum;neoplasm transplanta tion;rats
【中图分类号】　R73-3　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1673-5269(2009)17-1287-05
　　导管肝动脉化疗栓塞(tmrlscatheter arterial che-
moembolization , TACE)是原发性肝癌(肝癌)非手术
治疗的主要手段之一 ,但是 TACE 很难使肿瘤细胞完
全坏死 , 在治疗一段时间后往往在残余灶边缘或远处
器官又出现浸润转移灶 ,长期的临床观察和大量动物
试验均表明 , TACE可以造成术后肿瘤微环境的乏氧
状态 ,乏氧诱导因子 1α的产生又通过多种途径促进了
肿瘤的侵袭和转移 ,肿瘤微环境的乏氧使得肿瘤细胞
和间质细胞合成 MMP-2 、MMP-9增加 ,降解细胞外基
质而促进肿瘤浸润与转移 。甲胎蛋白(AFP)对于肝癌
的诊断不仅是一个很有价值的肿瘤标记 ,而且对于术
后预后的估计是一项非常有用的指标[ 1] 。中药罗勒是
从经典的活血化瘀药中发现的抗肿瘤转移新药 ,现正
在进行临床实验 ,罗勒胶囊有效成分为罗勒多糖 ,本研
究对该药的抗肿瘤临床与基础进行了系统的研究 ,证
实了其具有较强的抗血小板及活血化瘀作用 ,对几种
移植瘤转移模型具有抗转移作用。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　动物和细胞株　Wistar大鼠 ,雌性(200±30)g
购于山东中医药大学试验动物中心 。合格证号:
22050015;Walker-256瘤株购于上海医药工业研究院 ,
中国细胞库典藏细胞中心细胞目录编号:QK10956。
1.1.2　实验药品和主要试剂　罗勒胶囊由北京四环
科宝制药有限公司提供 , 批号:20080526 , 规格:
0.16 g/粒;HIF-1α抗体及 MMP-2 、MMP-9 抗体(浓
缩型)购自北京博奥森生物技术有限公司;ZLI-9032
浓缩型 DAB试剂盒及 SP9001 免疫组化染色试剂盒
(美国 Zymed公司)购自北京中杉金桥生物技术有限
公司;大鼠(Rat)血清 AFPELISA 检测试剂盒(96T)
购自上海朗顿生物技术有限公司。
1.2　肿瘤模型制作及分组
从液氮中取出癌株 ,接种于 3只传代用Wistar大
鼠腹腔。14 d后取腹水离心 ,将瘤细胞接种于其他传
代Wistar大鼠右后肢内侧皮下 ,1周后皮下长出肿瘤
结节 ,无菌条件下取出实体瘤 ,用双面刀片或眼科剪取
肿瘤边缘生长活跃的鱼肉样组织 ,切成 1 mm 3 大小的
碎块备用[ 2] 。200 g 左右Wistar雌性大鼠 80只 , 2%
戊巴比妥钠腹腔麻醉后 ,取仰卧位 ,固定四肢于实验板
上 ,自剑突下沿腹正中剪去体毛 ,安尔碘消毒后 ,沿腹
白线逐层开腹 ,最后暴露大鼠腹腔 ,选取最近体表的肝
叶(体积最大),用眼科镊刺破肝包膜 ,深 3 ～ 5 mm 于
肝表面成角 30°刺入 ,形成一隧道 ,然后将取出的瘤块
植入 ,然后用小块明胶海绵封堵创口 ,压迫止血待无持
续岀血后逐层关腹 ,消毒手术切口[ 3] 。术后取侧卧位 ,
放置于安静 、光线柔和的饲养间内 , 保持室温25 ～
30 ℃,结果造模成功 60 只。随机分为非 TACE 对照
组(只进行开腹操作)、TACE +NS 组 、TACE +罗勒
胶囊小剂量组 、TACE+罗勒胶囊中剂量组和 TACE
+罗勒胶囊大剂量组 5组 。将罗勒胶囊水溶后对大鼠
进行灌胃给药 ,根据大鼠与人的体表面积比例制定大
鼠给 药 剂 量为 大 剂 量 30 mg/100 g 、中 剂 量
15 mg/100 g和小剂量 7.5 mg/100 g ,1次/d。
1.3　TACE治疗方法
瘤块种植后第 10 天肿瘤模型成功建立后对非
TACE 组以外 4组大鼠做 TACE。于手术显微镜下经
胃十二指肠动脉将自制的微导管(小儿静脉留置针改
造)插至肝固有动脉内。经导管分别注入 5-FU
20 mg/kg ,加超液态碘油 0.5 mL/kg ,术后拔管 ,结扎
胃十二指肠动脉近端 , 逐层缝合 , 消毒 , 分笼饲养 。
1.4　血样及标本收集
于术后第 10 天处死动物 , 大鼠腹主动脉取血
4 mL , 血样 收集在试管中 , 室温静 置 30 min ,
3 000 r/min(离心半径 3.5 cm), 10 min ,分离血清保
存在-70 ℃冰箱。动物肝脏标本经 10%的甲醛固定 ,
石蜡包埋 , 5 μm 连续切片 。
1.5　免疫组化染色及结果判定
HIF-1α、MMP-2和 MMP-9免疫组化染色 。一抗
分别为兔抗大鼠 HIF-1α(工作浓度 1∶200)、兔抗大
鼠 MMP-2 、MMP-9(工作浓度 1∶200)用已知阳性切
片同时在同一条件下染色作为阳性对照 , 用 PBS
(pH=7.4)代替一抗作为阴性对照 ,染色步骤严格按
照试剂说明书进行 。每组 30 个视野计数表达
HIF-1α、MMP-2和 MMP-9的瘤细胞数 ,计算阳性细
胞表达百分率。
1.6　ELISA检测血清 AFP
运用酶联免疫吸附试验法检测血清 AFP 的表达 ,
操作过程按照说明书进行 ,以吸光度 OD值为纵坐标 ,
相应的 AFP 标准品浓度为横坐标 ,采用 ELISA Calc
V0.5软件绘制标准曲线(图 1),并根据样品 OD值读
取样品 AFP 浓度。
1.7　统计学方法
用 SPSS 13.0统计学软件进行显著性检验 ,计量
·1288· 史传文 ,等　罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE术后肿瘤组织 HIF-1α和 MM P及血清 AFP 表达的影响
资料数据用(x)表示 ,组间比较采用方差分析(One-
WayANOVA),以 x-±s表示 ,检验水准α=0.05。
2　结果
2.1　大鼠移植性肝癌瘤质量和术后血清 AFP的表达
TACE +生理盐水组大鼠瘤质量较非 TACE 对照
组显著降低 ,差异有统计学意义 , P<0.05;与 TACE +
生理盐水组比较罗勒胶囊大剂量组瘤质量明显降低
(P<0.05)。中 、小剂量作用不明显 ,不同剂量组之间大
鼠瘤质量差异无统计学意义 ,P>0.05(表 1)。
TACE+NS组较非 TACE 组血清中 AFP 表达显著
降低(P<0.01)。罗勒胶囊大 、中剂量治疗组较非 TACE
组血清中 AFP显著降低(P<0.01),而与 TACE +NS组
比较 ,差异无统计学意义 ,P>0.05(见图1 ,表1)。
2.2 　各组术后肿瘤组织中 HIF-1α和 MMP-2 及
MMP-9的表达
2.2.1　HIF-1α的表达　与非 TACE 对照组比较 TA-
CE+生理盐水组肿瘤及周边组织中 HIF-1α表达显著
增高 ,而 TACE +罗勒大剂量组则有显著降低;与 TA-
CE+生理盐水组比较 ,罗勒 3个剂量组均有显著降低 ,
罗勒大剂量组作用优于中 、小剂量组;罗勒中 、小剂量组
作用相似且与非 TACE 对照组差异无统计学意义 ,P>
0.05(表 2)。
图 1　大鼠血清 AFP浓度标准曲线
表 1　罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌瘤质量和术后
血清 AFP表达的影响
组别 样本数 瘤质量(g)　 AFP(μg/ L)　　
非 TACE 对照组 10 3.241±0.861 301.7±18.59
TACE+生理盐水组 10 2.343±0.819■ 249.8±33.15☆
TACE+罗勒大剂量组 10 2.191±0.599▲◎ 252.6±26.93☆◆
TACE+罗勒中剂量组 10 2.671±0.995◎ 254.4±19.90☆◆
TACE+罗勒小剂量组 10 2.626±0.827◎ 287.37±24.33★
　　与非 TACE对照组比较, ■P<0.05;◎P<0.01;与 TACE+生理
盐水组比较 , ▲◎P<0.05;◎P>0.05;☆P<0.01;与 T ACE+生理盐水
组比较 , ★ P<0.01;◆P>0.05
表 2　各组术后肿瘤组织 HIF-1α和 MMP-2及 MMP-9免疫组化表达情况(x-±s , %)
组别 样本数 视野数 HIF-1α阳性表达率 MMP-2阳性表达率 MM P-9阳性表达率
非 TACE对照组 10 30 32.36±1.86 33.23±2.27 36.43±0.57◎▲
TACE+生理盐水组 10 30 59.41±3.18◎ 55.32±2.74◎ 38.45±2.00◎△
TACE+罗勒大剂量组 10 30 41.23±2.44▲■ 41.71±1.21▲■ 26.30±2.14▲△
TACE+罗勒中剂量组 10 30 47.72±3.08△☆ 47.72±3.08△☆ 26.20±0.86▲△☆
TACE+罗勒小剂量组 10 30 49.21±3.72△☆ 49.27±4.23△☆ 25.53±1.74▲△☆
　　与非 TACE对照组比较 , ◎P<0.01;▲P<0.01;△P<0.01;与 T ACE+生理盐水组比较 , ■P<0.01;△P<0.01 ,与 TACE+罗勒大剂量组比
较☆P<0.01 , T ACE+罗勒中剂量与 TACE+罗勒小剂量组比较差异无统计学意义 , △☆P>0.05 , #P>0.05
　　HIF-1α在肿瘤组织中普遍表达 , 主要位于肿瘤细
胞核中 , 胞质中也有表达 , 而在正常肝组织中表达相对
较低。在肿瘤组织中 HIF-1α的表达不均匀 , 中心坏死
组织不表达 , 瘤旁组织的表达均强于肿瘤中心组织 ,肿
瘤坏死组织周围及有纤维结缔组织包绕的瘤细胞条索
中 HIF-1α表达最强。TACE +NS阳性表达细胞深染 ,
明显强于非 TACE 组 , TACE +罗勒大 、中 、小三个剂量
组表达较弱 ,明显低于 TACE+NS组(图 2)。
2.2.2　MMP-2的表达　与非 TACE 对照组比较 TA-
CE+生理盐水组肿瘤及周边组织中 MMP-2表达显著
增高 ,而 TACE +罗勒大剂量组与 TACE +罗勒小剂量
组则有显著降低;与 TACE +生理盐水组比较 ,罗勒 3
个剂量组均有显著降低 ,其中罗勒小剂量组降低最为显
著 ,见表 2。
　　TACE+罗勒大剂量组 MMP-2阳性表达细胞较
TACE+生理盐水组显著减少 ,在有炎细胞浸润的周
围肿瘤细胞中及有纤维结缔组织包绕的瘤细胞条索
内 ,黄褐色颗粒染色较均匀 。正常肝组织无染色或染
色淡(图 3)。
2.2.3 　MMP-9 的表达 　与非 TACE 对照组比较
TACE+生理盐水组肿瘤及周边组织中 MMP-9表达
显著增高 ,而 TACE+罗勒不同剂量的 3 个组则有显
著降低;与 TACE+生理盐水组比较 ,罗勒 3个剂量组
均有显著降低;罗勒 3个剂量组作用相似 ,差异无统计
学意义 ,见表 2。
肿瘤及其坏死组织和肿瘤周边肝组织中可见
MMP-9阳性表达可见 ,阳性表达的淡黄色颗粒较多见
于肿瘤边缘细胞的胞质中和细胞膜周围 ,细胞核几乎
·1289·中华肿瘤防治杂志 2009年 9月第 16卷第 17期　　CH IN J CANCER PREV T REAT , September 2009 , Vol.16　No.17
不染色 ,肿瘤中心部分阳性细胞染色多呈黄色 ,且多见
于细胞质染色 ,部分细胞间质有浅染。可见 TACE+
NS阳性表达细胞深染 ,明显强于非 TACE组和 TA-
CE+罗勒大剂量组 , TACE +罗勒大剂量组表达较
弱 ,阳性颗粒少且浅染成黄色 ,且多见于细胞质染色 ,
部分细胞间质也有浅染(图 4)。
3　讨论
肿瘤的浸润与转移是衡量肿瘤生物学行为的重要
指标 ,也是肿瘤危害的根源所在。细胞外基质和基底
膜是肿瘤生长和扩散的基础屏障 ,金属蛋白酶是细胞
外基质代谢的主要调节者 ,肿瘤细胞依靠金属蛋白酶
降解细胞外基质从而促进其浸润与转移[ 4] 。现已发现
MMPs 有 20多种 ,几乎可以降解细胞外基质的所有
成分 。MMP-9 又称明胶酶 B , 在体外实验中 , 用
MMP-9拮抗剂可以抑制大肠癌细胞的移行和黏附 ,
MMP-9阳性表达患者中的腹腔微转移率高达
39.4%, MMP-9可能通过降解细胞外基质和胶原 ,促
进肿瘤细胞沿着缺损的基底膜向浆膜浸润 ,从而导致
癌细胞至腹腔[ 5] 。TACE可以造成术后肿瘤微环境的
·1290· 史传文 ,等　罗勒胶囊对大鼠移植性肝癌 TACE术后肿瘤组织 HIF-1α和 MM P及血清 AFP 表达的影响
乏氧状态 ,而乏氧诱导因子 1α的产生与肿瘤细胞和间
质细胞 MMP-2 、MMP-9 的合成有着密切的关系[ 6] 。
MMP-2和 MMP-9降解基质胶原 ,有利于快速增殖的
肿瘤细胞摆脱 ECM 的束缚而进行迁移 ,是肿瘤细胞
向周围浸润的生化基础[ 7-8] ,进一步了解这一过程 ,对
肿瘤的治疗有积极意义。
图 4　各实验组肿瘤组织 MMP-9免疫组化表达结果(DAB×400)
A:非 T ACE组;B:TACE+NS组;C:TACE+罗勒大剂量组;D:T ACE+罗勒中剂量组;E:TACE+罗勒小剂量组;F:阴性对照
　　本实验建立了大鼠移植性肝癌模型 ,并对模型大
鼠进行了模拟 TACE治疗 ,从肿瘤乏氧的角度观察了
罗勒多糖对术后乏氧微环境中与肿瘤侵袭转移相关的
HIF-1α、MMP-2 、MMP-9 及血清 AFP 表达的影响。
结果显示术后 HIF-1α表达增高 ,提示 TACE 有可能
增加了肿瘤局部微环境的乏氧 ,而罗勒多糖则显著降
低肿瘤局部尤其是瘤体周围组织中的乏氧诱导因子
1α的表达 ,说明罗勒多糖对于术后的肿瘤乏氧微环境
具有改善作用;同时罗勒多糖显著降低肿瘤局部微环
境中 MMP-2 、MMP-9 的合成 ,肝癌组织中的 HIF-1α
与 MMP-2的表达成正相关。表明罗勒胶囊可能通过
改善术后肿瘤乏氧抑制肿瘤细胞运动而起到 TACE
术后对肝移植瘤的抑制作用。本研究认为 ,这与改善
肿瘤乏氧关系密切 ,其具体机制还有待于进一步的深
入研究 。TACE +NS 组较非 TACE 组血清中 AFP
表达显著降低可能与 TACE+NS组的肿瘤细胞坏死
有关 ,与 TACE +NS 组比较罗勒胶囊治疗组并没有
明显改善大鼠移植性肝癌 TACE 的预后。这可能与
该动物模型的生存时间短以致给药时间相对较短有一
定关系 ,在后续研究中 ,将设法延长模型动物生存期以
延长给药时间。
综上所述 ,罗勒多糖通过改善肿瘤乏氧及抑制
MMP-2 、MMP-9的合成从而抑制肿瘤的发生发展 。
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收稿日期:2009-03-21　修回日期:2009-06-10
(编辑:史本玲)
·1291·中华肿瘤防治杂志 2009年 9月第 16卷第 17期　　CH IN J CANCER PREV T REAT , September 2009 , Vol.16　No.17