全 文 ：亚 太 传 统 医 药
Asia-Pacific Traditional Medicine
Vol. 5 No. 10%
Oct. 2009
第 5 卷 第 10 期
2009 年 10 月
收稿日期：2009－07－17
基金项目：上海市教育委员会科研创新项目（09ZZ131）
粗茎秦艽ISSR-PCR反应体系的优化
秦鲜艳 1，赵志礼 1*，孟千万 1，王峥涛 2
（1.上海中医药大学 生药学教研室，上海 201203；2.上海中医药大学 中药研究所，上海 201203）
摘 要：目的：建立粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk的ISSR－PCR最佳反应体系。 方法：基因组DNA
为模板，分别对体系各因子进行考察。 结果：最佳体系为：总体积10μL，其中含0.5－1.5ng ／μL DNA模板，l0×
Buffer缓冲液1μL，2.5mmol ／ L Mg2＋，0.5U Taq DNA聚合酶，0.6μmol ／ L引物，0.2mmol ／ L dNTPs。 反应程序：94℃预
变性5min；之后，94℃变性30s，54℃复性45s，72℃延伸90s，共38个循环；循环结束后72℃延伸7min。 结论：该体系
可用于粗茎秦艽种下及种间遗传变异分析及药材道地性研究。
关键词：粗茎秦艽；ISSR－PCR；体系优化
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1673－2197（2009）10－0025－03
ISSR（inter simple sequence repeat）技术是建立在 PCR
基础上的一种分子标记技术，自 1994 年建立以来 ［1］，已广
泛应用于生物遗传多样性及品种鉴定研究，并作为构建遗
传图谱的工具［2，3］。其优点在于：不需要事先知道靶序列［4］；
由于较高的退火温度和更长的引物序列，可产生重复性好
的扩增带；模板需要量少，多态性丰富，结果记录方便 ［5］。
ISSR－PCR体系的专属性比较强， 不同种植物甚至不同的
引物，其反应体系有一定差异，只有在最佳条件下，才能获
得稳定清晰的多态性条带。
粗茎秦艽为中药秦艽原植物之一。 近年来，由于种种
原因，野生资源临近濒危状态，粗茎秦艽已被列为《国家重
点保护野生药材物种名录》［6］。 因此，拟建立粗茎秦艽 IS-
SR－PCR 反应体系，以期为深入研究该物种的遗传多样性
提供一种有效方法，进而为其种质资源保护及药材道地性
研究提供基础资料。
1 材料和方法
1.1 供试材料
实验样品 2007 年 8 月采自云南丽江。 取新鲜幼嫩叶
片，硅胶迅速干燥，置－20℃冰箱保存。 原植物由上海中医
药大学赵志礼教授鉴定为粗茎秦艽 Gentiana crassicaulis
uthie ex Burk，凭证标本：赵志礼 20075016，藏于上海中医
药大学中药学院药用植物标本室。
1.2 仪器
PCR仪（Biometra Thermocycler），电泳仪（BIO－RAD）等。
1.3 试剂
引物主要参考加拿大哥伦比亚大学公布的序列［7］及相
关文献［8］，并进行了改进，由上海生工公司合成；其它试剂略。
1.4 基因组 DNA提取
采用经典 CTAB法［9］、改良 CTAB法①［10］和改良 CTAB
法②［11］分别提取基因组 DNA，以筛选最佳提取方法。
1.5 ISSR－PCR初始反应体系及产物检测
参考有关文献 ［12］， 并略加改进。 10μL反应体系：l0×
Buffer缓冲液 1μL，Mg2＋2.0mmol ／ L，Taq DNA聚合酶 0.5U，引
物 0.9μmol ／ L，dNTPs0.1mmol ／ L，10 ~50ngDNA，ddH2O 加至
10μL。 94℃预变性 5min， 之后 94℃变性 30s，52℃复性 45s，
72℃延伸 90s，共 38个循环，循环结束后 72℃延伸 7min。
在 1.2％的琼脂糖凝胶中分离扩增产物， 电泳结束后
在凝胶成像系统下观察照相。
1.6 体系优化实验设计
从 74 条引物中预筛出 7 条稳定性好的引物，以其中
CJ－1 为优化实验的引物，采用单因素分析法，分别考察
DNA 模板、Mg2＋、Taq 酶、dNTPs、引物、退火温度对扩增的
影响。整个过程以初始反应体系为基础，每确定一个因子
的最佳参数后即作为后续研究的固定条件，依次类推。
2 结果
2.1 DNA提取方法的确定
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改良 CTAB 法②得到 DNA 的 OD260 ／ OD280 值在
1.8~2.0之间，提纯效果好，可直接用于扩增。
2.2 反应体系的优化
2.2.1 DNA模板浓度
设置 6水平：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng ／μL。结果显示
浓度 0.5～1.5ng ／μL时条带最多；而大于 1.5ng ／μL 时，条带
数减少，条带也变得模糊，因此 DNA 模板的最佳浓度范围
为 0.5～1.5ng ／μL（图 1）。
图 1 不同 DNA模板浓度对扩增的影响
M：DNA marker 0： 阴性对照 1－6 分别为：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng ／
μL 扩增产物。
2.2.2 Mg2＋浓度
7 水平：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.75mmol ／ L。 结果显
示，浓度低于 2.0mmol ／ L 时基本无带；2.0～2.5mmol ／ L 时较
好，而 2.5mmol ／ L 时，扩增条带最亮，确定其为最佳浓度
（图 2）。
图 2 不同 Mg2＋浓度对扩增的影响
M：DNA marker1－7 分别为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.75mmol ／ L 扩增
产物。
2.2.3 Taq酶用量
6 水平：0.25、0.5、0.6、0.75、1.0、1.5U。 结果显示，浓度
为 0.25U 时条带少且弱，0.5～1.5U 时扩增出的条带基本相
同，本着降低成本原则，确定其用量为 0.5U（图 3）。
图 3 Taq酶用量对扩增的影响
M：DNA marker 1－6 分别为 0.25、0.5、0.6、0.75、1.0、1.5U扩增产物。
2.2.4 dNTPS浓度
6 水平 ：0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mmol ／ L。 结果显
示，浓度 0.1～0.15mmol ／ L 时扩增条带较弱，0.2～0.25mmol ／
L时扩增条带比较清晰，多态性好。 0.3mmol ／ L 时扩增条带
减少，0.35mmol ／ L 时基本无带， 因此其浓度以 0.2mmol ／ L
为宜（图 4）。
图 4 不同 dNTPs浓度对扩增的影响
M：DNA marker1－6分别为 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mmol ／L扩增产物。
2.2.5 引物浓度
6 水平 ：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol ／ L。 结果显示 ，
0.4～1.0μmol ／ L 时扩增的带型一致，在此浓度范围内，随着
浓度增高条带变得模糊；当大于 1.0μmol ／ L 时条带数目减
少。 以 0.6μmol ／ L 时条带比较清晰、多态性好，因此，引物
浓度确定为 0.6μmol ／ L（图 5）。
2.2.6 退火温度
7水平：46、48、50、52、54、56、58℃。退火温度较低（46～
48℃）或较高（54℃以上）时，条带减少；当温度由 50℃升到
54℃时，带型基本相同。 在允许范围内选择较高退火温度
可减少引物与 DNA模板之间的非特异性结合， 所以退火
温度确定为 54℃（图 6）。
2.2.7 体系稳定性考察
最佳反应体系 ：10μL 反应体系中含 0.5 ～1.5ng ／
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图 7 不同退火温度对扩增的影响
M：DNA marker 1、2 重复 2 次的扩增产物。
图 6 引物 CJ－1重复两次的扩增结果
M：DNA marker 1－6 分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol ／ L扩增产物。
M：DNA marker，1－7 分别为 46、48、50、52、54、56、58℃扩增产物。
图 5 不同引物浓度对扩增的影响
μLDNA 模板，l0×Buffer 缓冲液 1μL，2.5mmol ／ L Mg2＋，0.5U
Taq DNA 聚合酶，0.6μmol ／ L 引物，0.2mmol ／ L dNTPs。 退
火温度 54℃，持续 45s。
以此体系，重复扩增 2 次，每次平行 2 份，结果显示 2
次扩增与平行实验结果均一致， 条带清晰、 多态性丰富
（图 7）。
引物不同，其退火温度不同。 因此以优化好的体系为
基础，分别对另外 6 条引物的退火温度进行考察，均得到
最佳退火温度。
3 讨论
3.1 基因组 DNA的提取
经典 CTAB 法和改良 CTAB 法①，出现大量胶冻状沉
淀，影响 ISSR－PCR 反应结果。 参考相关文献［11］，在提取液
中加入 0.35 倍体积的无水乙醇， 迅速混匀并尽快离心除
去沉淀物。 结果表明，提取的 DNA 满足 ISSR－PCR 扩增的
要求。
3.2 退火温度的确定
退火温度是反应体系中重要因子之一，过低导致非特
异性扩增，重复性降低，而温度过高带较少，导致许多可能
反应多态性的信息丢失［13］。 优化过程中，在允许范围内应
选择较高退火温度以减少引物与模板 DNA 之间的非特异
性结合。
参考文献：
［1］ ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprin
ting by simple sequence repeat （SSR）anchored polymerase chain
reaction amplification［J］.Genomics，1994，20（2）：176-183.
［2］ 李海生.ISSR分子标记技术及其在植物遗传多样性分析中的应
用［J］.生物学通报，2004，39（2）：19-20.
［3］ 王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用［J］.遗
传，2002，24（5）：613-616.
［4］ 白玉.DNA分子标记技术及其应用［J］.安徽农业科学，2007，35
（24）：7422-7424.
［5］ 肖海峻，孟利前，李玉冰.ISSR分子标记及其在植物遗传育种中
的应用［J］.内蒙古农业科技，2006，（4）：31-33.
［6］ 周秀佳，徐宏发，顺庆生.中药资源学［M］.上海：上海科学技术
文献出版社，2007.
［7］ 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用［M］.北京：化
学工业出版社，2005.
［8］ 曹雅男 .龙胆DNA指纹图谱分析及质量相关性研究［D］.哈尔
滨：东北农业大学，2004.
［9］ 陈随清，王利丽，段亮亮，等.山茱萸叶脱氧核糖核酸（DNA）提
取方法的研究［J］.河南中医学院学报，2005，20（117）：23-24.
［10］ 魏丹红，徐红，王燕燕，等.金钗石斛遗传多样牲研究的ISSR-
PCR反应休系建立与优化［J］.上海中医药大学学报，2007，21
（4）：64-68.
［11］ 詹亚光， 曾凡锁. 富含多糖的白桦成熟叶片DNA的提取方法
［J］. 东北林业大学学报，2005，33（3）：24-25.
［12］ DEFANG ZHANG，SHILONG CHEN，SHENGYOUN CHEN，et
al.Patterns of genetic variation in Swertia przewalskii.an
endangered endemic species of the Qinhai -Tibet Plateau ［J］.
Biochemical Genetics，2007，45（1/2）：33-50.
［13］ 邓婧，陈新.黄花蒿ISSR-PCR反应体系的优化［J］.成都中医药
大学学报，2006，29（3）：51-53.
（责任编辑：胡 静）
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Optimization of ISSR－PCRReaction System forMedicinal
PlantGentiana Crassicaulis Duthie Ex Burk
Qin Xianyan1，Zhao Zhili*，Meng Qianwan1，Wang Zhengtao2
（1.Department of Pharmacognosy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，
Shanghai 201203，China；2.Institute of Chinese Materia Medica，Shanghai University of Traditional
Chinese Medicine， Shanghai 201203，China）
Abstract：Objective：To establish optimal ISSR-PCR reaction system for Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.Methods：It was used to
optimize ISSR－PCR system by single factor test.Results：An optimal system was established.Conclusion：This suitable ISSR-PCR reaction
system can provide a standardizing process for the analysis of interspecies and intraspecies genetic diversity of Gentiana crassicaulis
Duthie ex Burk.
Key Words:Gentiana Crassicaulis Duthie Ex Burk；ISSR-PCR；System optimization
收稿日期：2009－08－07
作者简介：江秀娟（1980－），女，广东饶平人，广州市药品检验所二分所中药师，研究方向为中药检测与分析。
HPLC法测定麒麟丸中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯
-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量
江秀娟 1，陈 新 1，梁华伦 2
（1.广州市药品检验所 二分所，广东 广州 510250；2.广东省中医院，广东 广州 510515）
摘 要： 目的： 建立麒麟丸中2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的含量测定方法。 方法： 采用
HPLC法测定，色谱柱为Dikma Diamonsil，（C18，250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈—水（14：86），流速1.0mL ／
min，检测波长320nm。 结果：2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷在0.0491~1.473μg之间呈线性关
系，r＝0.9996，平均回收率为95.8％，RSD为1.3％。 结论：该方法简便准确，重现性好，可用于麒麟丸的质量控制。
关键词：麒麟丸；高效液相色谱法；2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673－2197（2009）10－0028－02
麒麟丸收载于中华人民共和国卫生部部颁标准《新药
转正标准》第十三册，是由制何首乌、墨旱莲、淫羊藿等 15
种中药提取精制而成的中药复方制剂， 具有补肾填精，益
气养血功效。 1999年经国家药品监督管理局批准，获得中
药保护品种证书。 原质量标准没有含量测定，不能很好地
控制其质量。制何首乌为方中主药之一，功效为补益精血，
固肾乌须，其主要成分为卵磷脂，约占 3.7％；蒽醌类衍生
物约为 1.1％［1］，其中 2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－
D－葡萄糖苷是该药的主要有效成分之一， 所以测定麒麟
丸中的 2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷
的含量，对控制麒麟丸质量具有重要意义。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪：Agilent1100；超声仪：KQ－600DE 型
数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；天平：JA5
003 CNSHP。
1.2 试剂与试药
乙腈，色谱纯；乙醇，分析纯；水为超纯水。 2，3，5，4’－
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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