全 文 ：植物资源与环境学报　2007, 16(4):38-42　　　　　　　
JournalofPlantResourcesandEnvironment　　　　　
　　　 留兰香组织培养及快速繁殖条件的优化
王小敏 , 梁呈元 , 李维林①
〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京 210014〕
摘要:以留兰香(MenthaspicataL.)茎尖为实验材料 , 对外植体消毒 、不定芽增殖和试管苗移栽生根的最佳条件进
行研究。结果表明 , 最佳外植体消毒方法为:用体积分数 75%乙醇浸泡 30 s, 再用 1.0 g· L-1 HgCl2浸泡 10 min,培
养 7 d后外植体生长状况良好。正交实验结果表明 ,在附加 0.2 mg· L-1 6-BA和 0.02mg· L-1 NAA的 MS培养
基中 , 留兰香不定芽的增殖倍数最高 , 试管苗生长状况最好。在含 25 mg· L-1 6 -BA和 50 mg· L-1 NAA的混合
溶液中浸泡 1 h,移栽试管苗的生根率可达 100%,且根较长。
关键词:留兰香;组织培养;快速繁殖
中图分类号:Q943.1;S567.23 +9　　文献标识码:A　　文章编号:1004-0978(2007)04-0038-05
ConditionoptimizationoftissuecultureandrapidpropagationofMenthaspicata　WANGXiao-
min, LIANGCheng-yuan, LIWei-lin①(InstituteofBotany, JiangsuProvinceandtheChineseAcademyofSciences, Nanjing210014, China), J.PlantResour.＆ Environ.2007, 16(4):38-42
Abstract:Theoptimalconditionsfordisinfectingofexplants, propagatingofadventitiousbudsandrootingoftransferringplantletsofMenthaspicataL.werestudiedbyusingstemtipsasexplants.Theresultsshowedthattheoptimaldisinfectionmethodwastoputexplantsin75% alcoholfor30s, thenin
1.0g· L-1 HgCl2 for10 min.Asaresultofdisinfection, growthstatusofexplantswasbeterafterculturedfor7d.Orthogonaltestresultsshowedthatproliferationtimeofadventitiousbudswasthehighest
andgrowthstatusofseedlingswasthebestinMSmediumcontaining0.2 mg· L-1 6-BAand0.02
mg·L-1 NAA.Rootingrateoftransferingplantletswere100% andtheirrootswerelongerwhenputing
insolutioncontaining25mg· L-1 6-BAand50mg·L-1 NAAfor1 h.Keywords:MenthaspicataL.;tissueculture;rapidpropagation
　　留兰香(MenthaspicataL.)为多年生草本植物 ,
在江苏 、安徽 、浙江和四川等地均有栽培 ,新疆有野
生种分布[ 1] 。留兰香在医药 、日用化工 、食品生产 、
农业生态保护 、生物防治及环境美化等方面具有广
泛的应用价值[ 2] 。在生产中 ,由于留兰香种子发芽
率较低 ,且有性繁殖易发生变异等原因 ,多采用扦插
及分株的方法进行繁殖[ 3 ～ 5] 。长期无性繁殖易导致
留兰香产生病毒感染 ,引起品种退化及产量和质量
的下降 ,因此 ,选择适宜的繁殖方法对扩大留兰香的
生产规模及提高其产量和质量有重要作用 。由于组
织培养技术可用于植物脱毒复壮等领域 ,因此可通
过组织培养对留兰香进行复壮和规模化生产。有研
究表明 ,留兰香的愈伤组织可诱导成苗 [ 6, 7] ,但在诱
导过程中愈伤组织易产生变异 ,且诱导成功率较低 。
由于可以诱导留兰香外植体直接产生丛生芽 ,既能
省去愈伤组织诱导分化的过程又可缩短成苗时间 ,
因此 ,作者以留兰香茎尖为外植体 ,通过诱导不定芽
达到快速繁殖的目的 ,并优选出最佳培养条件及试
管苗移栽技术 ,为留兰香的脱毒复壮提供基础资料。
1　材料和方法
1.1　材料
实验用留兰香(MenthaspicataL.)于 2004年引
自江苏东台 ,栽培于江苏省 ·中国科学院植物研究
所苗圃内 。
收稿日期:2006-10-23
基金项目:国家 “十一五 ”科技支撑计划项目(2006BAI06A12-12)
和江苏省 “十五 ”高科技研究项目(BG2005317)
作者简介:王小敏(1980-),女 ,山东苍山人 , 硕士 ,研究实习员 ,主
要从事药用植物栽培与生物技术方面的研究。
①通讯作者 E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net
1.2　方法
1.2.1　外植体的消毒和培养　于 2005年 8月至
2006年 4月进行实验 。选择晴天下午 ,剪取留兰香
植株顶端 2 ～ 3cm的茎尖 ,剥去最外层叶片 ,自来水
冲洗 10 min后 ,加少量洗衣粉浸泡 5min,再用自来
水冲洗 20min,转入超净工作台进行后期消毒 。用
体积分数 75%的乙醇浸泡 30 s,无菌水冲洗 3 ～ 4
次 ,将茎尖分为 6组 ,分别用 1.0和 2.0 g· L-1
HgCl2溶液浸泡 5、10和 15min,再用无菌水冲洗 3 ～
4次。消毒完毕后将茎尖剪成约 1 cm的小段 ,无菌
条件下接种到 MS培养基 [ 8]上。于 25 ℃、光照度
2 000 lx、光照时间 12 h· d-1的条件下培养 。每处
理 15株 ,各 3次重复 。 7 d后观察外植体的生长状
况 ,并统计污染率 。
1.2.2　激素浓度的单因素实验　取初代培养一段
时间后长势较好且无污染的茎尖 ,剪成长约 1cm的
茎段 ,并接种到附加不同浓度 6-BA和 NAA及 40
g· L-1蔗糖 、7.5 g· L-1琼 脂的 MS培养 基(pH
5.8)中 ,其中 6-BA浓度分别为 0.2、0.5、1.0、1.5、
2.0和 2.5 mg· L-1;NAA浓度分别为 0.01、0.02、
0.05、0.10、0.20和 0.50 mg· L-1。于 25 ℃、光照
度 2 000 lx、光照时间 12 h· d-1的条件下培养 。每
处理 10瓶 ,每瓶 2株 ,各 3次重复。 20 d后观察试
管苗的生长情况 ,统计增殖系数并测量芽长。
1.2.3　培养条件的正交实验 　以 6 -BA浓度 、
NAA浓度及基本培养基类型为 3个因素 ,每因素设
3个水平; 6-BA浓度分别 为 0.1、 0.2和 0.5
mg·L-1;NAA浓度分别为 0.02、 0.05和 0.10
mg·L-1 , 基本培养基类型分别为 MS、 3/4 MS和
1 /2MS。选择初代培养一段时间后长势较好且无
污染的茎尖 ,剪成约 1 cm的茎段 ,接种到供试培养
基(含 40 g·L-1蔗糖和 7.5 g· L-1琼脂 , pH5.8)
中 。于 25 ℃、光照度 2 000lx、光照时间 12 h·d-1
的条件下培养。每处理 15瓶 ,每瓶 2株 。 20 d后观
察试管苗的生长情况 ,统计增殖系数并测量芽长。
1.2.4　试管苗的移栽条件筛选　将增殖培养 30 d
的健壮无根试管苗(株高 3 ～ 5 cm)在室内打开瓶盖
炼苗 3 d后 ,将其置于含不同浓度 6 -BA(0、25和
50 mg· L-1)和 NAA(0、25和 50 mg· L-1)的混合
溶液中浸泡 1 h,再移栽至填有蛭石 、沙子及营养土
(体积比 1∶1∶3)的穴盘中 ,并进行遮阳保水处理 。
每处理 30株苗 ,培养 2周后统计移栽苗的生根率 、
生根数及根长 。
1.3　数据处理
采用 SPSS软件对实验数据进行统计分析 ,并对
各处理间的差异进行显著性分析 。
外植体污染率的计算公式为:污染率 =(污染
苗数 /接种苗数)×100 %。增殖系数的计算公式
为:增殖系数 =有效芽苗数 /接种芽苗数 ,其中 ,有效
芽苗是指株高大于 0.5cm的试管苗 。
2　结果和分析
2.1　最佳消毒方法
不同浓度 HgCl2及消毒时间对留兰香茎尖消毒
效果和生长情况的影响结果见表 1。由表 1可知 ,
用相同浓度 HgCl2溶液消毒 ,随消毒时间的延长 ,虽
然外植体的污染率有所下降 ,但芽的萌发量却减少;
消毒时间相同的条件下 ,用高浓度 HgCl2处理后 ,留
兰香外植体的污染率有所下降 ,但侧芽的萌发量却
急剧减少 。结果表明 ,高浓度 HgCl2处理和长时间
浸泡对留兰香茎尖的损伤较大 ,不利于侧芽的进一
步萌发。
根据污染率的差异显著性分析结果 ,并综合考
虑外植体的生长状况 ,最终确定留兰香茎尖外植体
的最佳消毒方法为:初步清洗后 , 先用体积分数
75%的乙醇浸泡 30 s,无菌水冲洗 3 ～ 4次后 ,再用
1.0 g·L-1 HgCl2溶液浸泡 10min。
2.2　最佳激素浓度的单因素筛选实验结果
2.2.1　最佳 6-BA浓度　接种 7d后 ,留兰香茎尖
及茎段均能产生不定芽 ,且在含较高浓度 6-BA的
培养基中不定芽的诱导数量较多 。接种 20 d后 ,留
兰香不定芽的生长及增殖状况见表 2。由表 2可以
看出 , 6-BA浓度超过 1.0mg· L-1 ,不定芽的增殖
系数明显增大 ,但玻璃化现象严重 ,且外植体的伸长
生长受到严重抑制;6-BA浓度为 2.0 mg·L-1 ,不
定芽的增殖系数达 4.70,明显高于其他浓度处理
组 ,但平均芽长仅 0.80 cm,且大多玻璃化 。因此 ,
为保证不定芽的增殖及芽的伸长生长 ,留兰香茎尖
增殖培养基中的 6-BA浓度应低于 1.0mg·L-1。
2.2.2　最佳 NAA浓度　不同浓度 NAA对留兰香
茎尖不定芽增殖效果的影响见表 3。由表 3可见 ,
接种 7 d后 ,留兰香无菌茎段在只含 NAA的培养基
上也能产生不定芽 ,但其增殖系数较添加了 6-BA
39　第 4期　　　　　　　　　　　　　王小敏等:留兰香组织培养及快速繁殖条件的优化
表 1　不同消毒方法对留兰香茎尖消毒效果的比较 1)
Table1　ComparisonofdisinfectioneffectivenessindifferentmethodsfordisinfectionofMenthaspicataL.stemtips1)
HgCl2浓
度 /g· L-1
Conc.ofHgCl2
消毒时间 /min
Disinfection
time
外植体数
Numberof
explant
外植体污染率 /%
Contamination
rateofexplant
外植体生长状况
Growthstatusofexplant
1.0 5 15 88.89a 呈绿色 ,大多数有侧芽萌发 Green, mostgeneratinglateralbuds
1.0 10 15 20.00b 呈淡褐色 ,多数有侧芽萌发 Lightbrown, manygeneratinglateralbuds
1.0 15 15 13.33bc 呈暗褐色 ,少量有侧芽萌发 Darkbrown, somegeneratinglateralbuds
2.0 5 15 77.78a 呈淡褐色 ,少量有侧芽萌发 Lightbrown, afewgeneratinglateralbuds
2.0 10 15 15.55bc 呈暗褐色 ,极少量有侧芽萌发 Darkbrown, fewgeneratinglateralbuds
2.0 15 15 6.67c 呈黑褐色 ,无侧芽萌发 Blackbrown, nonegeneratinglateralbuds
　1)表中所有数据均为 3次重复的平均值 Aldatumsinthetablearetheaverageofthreereplications;同列中的不同字母表示差异显著(P<0.05)
Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethesignificantdiference(P<0.05).
表 2　培养基中不同浓度 6-BA对留兰香不定芽增殖培养的影响(培养 20d后)1)
Table2　Effectsofdiferentconcentrationsof6-BA inmedium onproliferationcultureofadventitiousbudsofMenthaspicataL.(after
culturedfor20d)1)
浓度 /mg· L-1
Concentration
增殖系数
Coefficientofproliferation
平均芽长 /cm
Averagelengthofbud
不定芽生长状况
Growthstatusofadventitiousbud
0.2 2.20e 1.51b 良好 ,伸长生长慢 Growingbeter, elongatingslowly
0.5 2.70de 2.12a 良好 ,伸长生长慢 Growingbeter, elongatingslowly
1.0 3.43cd 1.68b 良好 ,个别苗玻璃化 Growingbeter, fewvitrification
1.5 3.80c 1.06c 伸长生长慢 ,玻璃化苗多 Elongatingslowly, manyvitrification
2.0 4.70a 0.80d 苗矮弱 ,玻璃化苗较多 Growingpoorly, morevitrification
2.5 4.17b 0.54e 苗矮弱 ,玻璃化苗最多 Growingpoorly, mostvitrification
　1)表中所有数据均为 3次重复的平均值 Aldatumsinthetablearetheaverageofthreereplications;同列中的不同字母表示差异显著(P<0.05)Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethesignificantdiference(P<0.05).
表 3　培养基中不同浓度 NAA对留兰香不定芽增殖培养的影响(培养 20d后)1)
Table3　EffectsofdiferentconcentrationsofNAAinmediumonproliferationcultureofadventitiousbudsofMenthaspicataL.(afterculturedfor20d)1)
浓度 /mg· L-1
Concentration
增殖系数
Coefficientofproliferation
平均芽长 /cm
Averagelengthofbud
不定芽生长状况
Growthstatusofadventitiousbud
0.01 1.13c 1.47e 生长势弱 Growingweakly
0.02 2.17a 1.89d 生长良好 Growingbeter
0.05 1.57b 2.79c 生长良好 Growingbeter
0.10 1.30bc 3.42a 伸长生长快 ,苗弱 Elongatingfast, weakseedlings
0.20 1.13c 3.18ab 节间长 ,苗弱 Weakseedlingswithlonginternode
0.50 1.03c 3.06bc 生长势极弱 Growingmostweakly
　1)表中所有数据均为 3次重复的平均值 Aldatumsinthetablearetheaverageofthreereplications;同列中的不同字母表示差异显著(P<0.05)
Thedifferentlettersinthesamecolumnindicatethesignificantdiference(P<0.05).
的培养基低 ,最高仅 2.17,平均芽长却相对较长 ,最
长可达 3.42 cm。研究结果表明 ,留兰香不定芽的平
均芽长随 NAA浓度不同而有所变化 , NAA浓度超过
0.10mg·L-1 ,平均芽长逐渐降低 ,即较高浓度 NAA
对留兰香不定芽的伸长生长有抑制作用 。因此 ,在
留兰香不定芽的增殖培养过程中 ,培养基中的 NAA
浓度不应超过 0.10 mg· L-1。
2.3　最佳培养条件的正交实验结果
以增殖系数和平均芽长为指标 ,对留兰香茎尖
组织培养条件优化的正交实验结果进行比较 ,并对
各因素的重要性进行分析 ,结果见表 4。由表 4可以
看出 ,就增殖系数而言 ,培养基类型为主要影响因
素 ,其次为 6-BA浓度 , NAA浓度的影响最小;就平
均芽长而言 , NAA浓度是主要影响因素 ,其次为培养
基类型 , 6-BA浓度的影响最小 。说明培养基类型
对留兰香丛生芽的生长和分化有较大影响 。另外 ,
培养基中添加 6 -BA主要影响芽的诱导 ,而添加
NAA则对芽的伸长生长有一定影响 。
若以增殖系数为参考指标 , 则以附加 0.5
mg·L-1 6-BA和 0.02mg· L-1 NAA的 MS培养基
40 　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷　
最好 ;若以平均芽长为参考指标 , 则以附加
0.2mg·L-1 6-BA和 0.05mg·L-1 NAA的 MS培
养基最佳。研究还发现 , 6-BA浓度为 0.5mg·L-1
时 ,留兰香试管苗的玻璃化程度较重 。
综合正交实验结果 ,以增殖系数为主要参考指
标 ,并综合考虑平均芽长和试管苗生长状况等因
素 , 最终确定以添加 0.2 mg·L-1 6-BA和 0.02
mg·L-1 NAA的 MS培养基为最佳增殖培养基。
表 4　留兰香茎尖组织培养条件优化的正交实验设计和结果 1)Table4　Designandresultoftheorthogonalexperimentforculture
conditionoptimizationofMenthaspicataL.stemtips1)
编号
Number
因素和水平　Factorandlevel
A B C D Ⅰ Ⅱ
1 MS 0.1 0.02 - 4.30 2.96
2 MS 0.2 0.05 - 4.57 3.85
3 MS 0.5 0.10 - 4.83 2.63
4 3 /4MS 0.1 0.05 - 3.23 3.15
5 3 /4MS 0.2 0.10 - 3.40 2.54
6 3 /4MS 0.5 0.02 - 4.93 2.23
7 1 /2MS 0.1 0.10 - 2.47 2.31
8 1 /2MS 0.2 0.02 - 3.23 2.76
9 1 /2MS 0.5 0.05 - 3.47 2.45
KⅠ1 13.70 10.00 12.46 11.17
KⅠ
2 11.56 11.20 11.27 11.97
KⅠ 3 9.17 13.23 10.70 11.29
RⅠ 4.53 3.23 1.76 0.08
KⅡ1 9.44 8.42 7.95 7.95
KⅡ2 7.92 9.15 9.45 8.39
KⅡ3 7.52 7.31 7.48 8.54
RⅡ 1.92 1.84 2.06 0.59
　1)A:基本培养基类型 Typeofbasicmedium;B: 6-BA浓度
(mg· L-1)Concentrationof6-BA;C:NAA浓度(mg· L-1 )
ConcentrationofNAA;D:空列 Blank;Ⅰ :增殖系数 Coeficientof
proliferation;Ⅱ:平均芽长(cm)Averagelengthofbud.
2.4　试管苗移栽生根的最佳处理方法
上述培养过程得到的留兰香无根试管苗经过不
同浓度 6-BA和 NAA混合溶液处理 ,移栽后的生根
情况见表 5。由表 5可见 ,不用激素处理的无根试管
苗也能生根 ,但生根率明显低于激素处理的试管苗;
在含不同浓度 6-BA和 NAA的混合溶液中浸泡 1h
后再移栽的留兰香无根试管苗均可生根 ,且生根率
在 96%以上。观察发现 ,扦插 5 d后 ,试管苗开始生
根;2周后 ,不同处理组试管苗的生根数量和平均根
长出现显著差异 。综合分析认为 ,含 50 mg·L-1
6-BA和 50 mg· L-1 NAA的溶液对根的诱导效果
最佳 ,含 25mg· L-1 6-BA和 50 mg· L-1 NAA的
溶液对根的伸长生长最有利。
在试管苗移栽过程中 ,较长根系有利于植株吸
收水分和矿质营养 ,因此 ,应选择有利于根伸长生长
的激素溶液作为留兰香无根试管苗移栽前的最佳处
理液 , 即移栽前将试管苗根部在含 25 mg· L-1
6-BA和 50 mg· L-1 NAA的溶液中浸泡 1h。
表 5　不同处理对留兰香无根试管苗移栽生根的影响 1)
Table5　EffectsofdiferenttreatmentsonrootingofMenthaspicata
L.transferringplantlets1)
浓度 /mg· L-1
Concentration
6-BA NAA
平均生根率 /%
Average
rateof
rooting
平均生根数
Average
number
ofroot
平均根长 /cm
Average
length
ofroot
25 25 96.67 6.8c 1.18c
25 50 100.00 10.2ab 3.17a
50 25 100.00 9.0bc 2.60b
50 50 100.00 12.6a 2.10bc
0 0 83.33 5.3d 0.94d
　1)表中所有数据均为 3次重复的平均值 Aldatumsinthetableare
theaverageofthreereplications;同列中的不同字母表示差异显著
(P<0.05)Thedifferentletersinthesamecolumnindicatethesignificantdiference(P<0.05).
3　讨论和结论
由于留兰香具有在叶腋及茎部密生腺毛的特殊
组织结构[ 10] ,因而其外植体极易带菌 、消毒十分困
难 ,为此 ,作者选择了包括茎尖在内的茎段做为初代
培养的外植体 ,以降低初代培养的污染率。由于
HgCl2消毒对外植体有一定的伤害作用 ,因此应尽量
选择低浓度 HgCl2溶液对外植体进行消毒。根据本
实验的结果 ,留兰香组织培养中外植体的最适消毒
条件为用 1.0 g·L-1 HgCl2溶液浸泡 10min。
由于留兰香试管苗伸长生长非常迅速 ,因此可
选择茎段做为增殖培养的外植体 。又由于留兰香的
分化和生长都需要极高的盐浓度 ,因此组织培养的
基本培养基应选择 MS基本培养基 。留兰香极易生
根 ,盐度较高的培养基还能在增殖培养过程中抑制
根的分化。
相对于薄荷属其他种类而言 [ 11, 12] ,留兰香组织
培养过程中需要的激素水平较低 ,尤其对细胞分裂
素的要求很低[ 1] ,高浓度 6-BA极易导致留兰香试
管苗玻璃化 ,而高浓度 NAA对试管苗的伸长生长也
有一定的抑制作用。根据单因素实验及正交实验结
果 ,确定留兰香茎尖组织培养不定芽增殖的最佳培
养基为:添加 0.2 mg· L-1 6-BA和 0.02 mg· L-1
41　第 4期　　　　　　　　　　　　　王小敏等:留兰香组织培养及快速繁殖条件的优化
NAA的 MS培养基。
留兰香丛生芽在增殖培养过程中极易产生大量
的气生根和底部根 ,因此无需进行专门生根培养 ,只
需在移栽前用一定浓度的激素溶液浸泡一定时间即
可 ,既缩短了培养时间又避免了生根培养时的污染
等问题 ,同时也能节约成本。综合本实验结果 ,确定
留兰香试管苗移栽前的最佳处理方式为:将留兰香
试管苗在含 25mg· L-1 6-BA和 50 mg· L-1 NAA
的混合溶液中浸泡 1h。
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