全 文 ：中国农学通报 2015,31(7):154-158
Chinese Agricultural Science Bulletin
峨嵋双蝴蝶提取物抑菌作用研究
周罗琴，田宏现
（吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000）
摘 要：为解决峨眉双蝴蝶抑菌作用原理问题，运用滤纸片扩散法研究峨嵋双蝴蝶提取物对致病菌的抑
菌作用。结果表明：峨嵋双蝴蝶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强。不同方法提取的提取物中
水提取物的抑菌效果最好。峨嵋双蝴蝶提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为3.125%。与
青霉素溶液标准曲线对照，测得峨嵋双蝴蝶提取物的抑菌效价相当于0.77 U/mL，即61.72 U/mg。
关键词：峨嵋双蝴蝶提取物；金黄色葡萄球菌；抑菌作用
中图分类号：Q949.95 文献标志码：A 论文编号：2013-2726
Study on Antibacterial Effects of the Extract of Tripterospermum cordatum
Zhou Luoqin, Tian Hongxian
(College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou Hunan 416000)
Abstract: In order to understand the antibacterial effects of the extract of Tripterospermum cordatum, the
antibacterial effects of the extract of Tripterospermum cordatum on pathogenic microbes were studied by filter
paper pervasion. The results showed that the extract of Tripterospermum cordatum had strong antibacterial
activities against Staphylococcus aureus than the other bacteria. The water extract of Tripterospermum cordatum
suppressed pathogenetic microbes effectively by different extracting methods. The minimal inhibitory
concentration of the extract of Tripterospermum cordatum was 3.125%. Compared with the penicillin standard
curve, the inhibitory potency of the extract was equivalent to 0.77 U/mL, or 61.72 U/mg.
Key words: the extract of Tripterospermum cordatum; Staphylococcus aureus; antibacterial effect
0 引言
峨嵋双蝴蝶(Tripterospermum cordatum)属于龙胆
科双蝴蝶属，为多年生常绿缠绕茎草本。叶对生，全
缘，三出脉，基生叶倒卵形，无柄；茎生叶卵圆形或卵状
被针形，顶端渐尖，基部圆或略带心形。花单生叶腋或
数朵成聚伞花序，花萼管状，柱头膨大。浆果，种子多，
三棱形，棱上无翅。花果期 9—11月。双蝴蝶属植物
全球大约 17种，中国有 15种，其中台湾分布 5种。它
们都具有相似的形态和利用价值，主要分布于湖南、湖
北、重庆、四川、贵州、云南等地区[1]。双蝴蝶属植物喜
阴暗潮湿，常生长于海拔 300~1000 m的山坡、山谷林
下和灌丛中。双蝴蝶主要采其茎叶入药，中医记载其
性寒、味甘辛，具有润肺止咳、止血、清热利尿、解毒、消
肿等功效，用于肺痨、咯血、肺脓疡、外伤出血、支气管
炎等。临床上有用治疗支气管炎以及肺结核咯血者，
既可单味服用，也可与其他药物搭配应用[2]。对峨嵋
双蝴蝶植物目前研究不多，基础生物学方面仅见陈世
龙等[3]2000年报道了峨嵋双蝴蝶的胚胎学特征。笔者
主要研究峨嵋双蝴蝶提取物对致病菌的抑菌作用，以
期对峨嵋双蝴蝶的药用价值提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 峨嵋双蝴蝶全草，秋末采集于湖南怀
化市中方县农村，经中科院植物标本馆林祁研究员
基金项目：湖南省高校产学研合作示范基地开放项目(2011jsjk003)。
第一作者简介：周罗琴，女，1987年出生，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事植物学研究。通信地址：416000南省吉首市人民南路 120号，E-mail：
549166780@qq.com。
通讯作者：田宏现，男，1953年出生，湖南保靖人，教授，博士，主要从事微生物学和林业生物技术方面的研究。通信地址：416000湖南省吉首市人民
南路120号，E-mail：jstianhx@163.com。
收稿日期：2013-10-17，修回日期：2015-01-22。
周罗琴等：峨嵋双蝴蝶提取物抑菌作用研究
鉴定。
1.1.2 供试菌种 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、福氏痢疾
杆菌 (Shigella dysenteriae)、表面金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus epidermidis)、乙型溶血性链球菌
(Streptococcus beta hemolytic)、异型枸椽酸杆菌，以上
菌种由湘西自治州人民医院检验科提供。
1.1.3 培养基 血液琼脂培养基；牛肉膏蛋白胨琼脂培
养基。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器 RE52-99旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器
厂）、FA2004上皿电子天平（上海精科天平厂）、YXQ-
LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公
司医疗设备厂）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长
城科工贸有限公司）、MDF-V2086S低温冷冻干燥机
（北京四环科学仪器厂）、HPS-280生化培养箱（哈尔滨
市东明医疗仪器厂）、试管、培养皿、三角瓶、烧杯、细菌
过滤器等。
1.2.2 试剂 无水乙醇、乙醇(75%)、石油醚、氯仿、乙酸
乙酯（以上试剂均为国产分析纯，由学校实验室提供）、
注射用青霉素钠（160万单位）、无菌兔血。
1.3 双蝴蝶提取物的制备
1.3.1 水煮提取 称取用植物粉碎机粉碎的峨嵋双蝴蝶
干叶 100 g，加入 2000 mL水煮提取，水煮 20 min后再
过滤，将滤液通过旋转蒸发仪减压蒸发浓缩成100 mL
的浓溶液，得到含生药浓度为 1 g/mL的双蝴蝶水煮提
取原液，其定义是 1 mL原液中含有 1 g双蝴蝶生药提
取物的原液。
1.3.2 乙醇抽提石油醚萃取、乙醇抽提氯仿萃取、乙醇
抽提乙酸乙酯萃取、乙醇浸提 称取用植物粉碎机粉碎
的峨嵋双蝴蝶叶粉 1 kg，先加入 5000 mL 70%乙醇在
60℃、功率为60 kW的条件下，用数控超声波清洗器超
声 1 h，然后过滤，再加入 3000 mL 70%乙醇重复 1次，
过滤，再加入3000 mL 70%乙醇重复1次，过滤，合并3
次滤液（见图1）。
将滤液通过旋转蒸发器，开始时温度控制在 61~
62℃、压力0.09 MPa下蒸发酒精，此时，冷凝管壁没有
水滴或汽雾。当冷凝管中出现水滴或汽雾时，液体中
的水分开始蒸发出来，将温度升高至68℃，压力不变以
加快速度。
峨嵋双蝴蝶乙醇抽提石油醚萃取得 4.2284 g浸
膏，经旋转蒸发器减压浓缩再冷冻干燥至恒重得
3.9864 g浸膏粉。氯仿萃取物经浓缩干燥得13.5364 g
浸膏粉。乙酸乙酯萃取物经浓缩干燥得1.6693 g浸膏
粉。乙醇浸提物直接减压浓缩干燥得 142.0000 g浸
膏粉。
1.4 培养基的制备
1.4.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备 按照配方依次
准确称取所需药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl，按试验操作
步骤配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；使用高压蒸汽灭
菌锅，在0.103 MPa压力下，121℃维持30 min灭菌；将
灭好菌的培养基在无菌环境中倒平板，待冷凝；倒置平
放在恒温箱里，24 h后检查，如培养基未长杂菌，即可
用来培养微生物[4]；将制备好的无菌平板置4℃冰箱冷
藏备用；另可留一部分锥形瓶装的培养基作血琼脂平
板用。
1.4.2 无菌脱纤维兔血琼脂培养基的制备 用配备9号
针头的注射器以无菌操作从健康兔心脏抽取全血，并
立即注入装有无菌玻璃珠的无菌三角瓶中，然后摇动
三角瓶10 min左右，形成的纤维蛋白块会沉淀在玻璃
珠上，把含血细胞和血清的上清液倾入无菌容器即得
到脱纤维兔血，置冰箱备用；待灭菌的牛肉膏蛋白胨琼
脂培养基温度降至 55℃时，按 10%加入无菌脱纤维兔
血于培养基中，立即摇荡，以便血液和培养基充分混
匀；将一部分培养基迅速以无菌操作倒入无菌平皿中，
使成血液琼脂平板，注意不要产生气泡[6]；一部分培养
基分装试管摆斜面，用于菌种活化；置37℃过夜，如无
菌生长即可使用。
1.5 供试菌株的活化及菌悬液的制备
将所有供试菌种接入试管斜面培养基，置于 37℃
恒温培养箱内培养 24 h，挑选生长好无杂菌感染的试
管种，置4℃冰箱冷藏。菌悬液的制备是用无菌水现配
图1 浸出物提取流程
1 kg药粉+11000 mL 70%乙醇 萃取后经旋转蒸发
700 mL石油醚 700 mL浸膏
沉淀720 mL氯仿
740 mL乙酸乙酯 沉淀
沉淀400 mL乙醇
减压浓缩干燥得乙醇浸提物
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现用，用接种环各挑取 3~4环不同的致病菌菌体放入
装有 1 mL无菌水的试管中，充分振荡摇匀，制成菌体
悬液备用[5]。
1.6 双蝴蝶提取液抑菌试验
滤纸片法测定抑菌作用。用打孔器将滤纸打成直
径6 mm的小纸片，放在小型培养皿中，高压蒸汽灭菌
后置于60℃烘箱中烘干备用；在超净工作台无菌条件
下，用移液管吸取1 mL经细菌过滤器过滤除菌的双蝴
蝶水煮 100%提取原液，置于容积为 4 cm3的无菌小瓶
中，用无菌镊子夹取20片灭菌小纸片放入小瓶的药液
中浸泡数分钟；同时以无菌水浸泡小纸片作为对照；在
无菌条件下，把制备好的不同的菌悬液，分别用移液管
吸取 0.1 mL，分别滴到灭好菌的固体培养基平板上，
用无菌涂布棒涂布均匀制成含菌平板；用无菌镊子夹
取浸透药液的小纸片贴于平板上，每皿按十字形放置
4个圆纸片，其中一个为水对照，每种菌平行做3个样；
将制好的培养皿倒置放入 37℃培养箱中培养 24 h，取
出后测定滤纸片抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。每
菌作3个平行，取其平均值[6-8]。
1.7 不同方法的双蝴蝶提取物的抑菌试验
分别称取用4种不同方法提取的峨嵋双蝴蝶浸膏
粉，分别用无水乙醇溶解，配制成含生药浓度为1 g/mL
的药液；水提取法直接取用含生药浓度为 1 g/mL的
原液。
在无菌条件下，以抑菌谱试验中最敏感菌株金黄
色葡萄球菌作为试验指示菌种，用接种环挑取 3~4环
菌体放入装有 1 mL无菌水的试管中，充分振荡摇匀，
制成菌悬液。分别用移液管移取经细菌过滤器过滤除
菌的 5种不同方法提取的峨嵋双蝴蝶药液于小瓶中，
按次序编号，再各夹取 20片小纸片分别浸入其中，然
后放置待各试管中的小纸片的酒精充分挥发；在无菌
条件下，移取制备好的菌悬液制成含菌平板；用无菌镊
子夹取各种含有挥发尽乙醇的药剂浸泡的小纸片贴于
平板上，再另取一个无水乙醇浸泡、挥发尽乙醇的小纸
片和无菌水浸泡的小纸片作为对照；将培养皿倒置
37℃培养箱中培养 18 h后观察，并用游标卡尺量抑菌
圈直径，比较不同方法提取的提取物的抑菌效果[9-11]。
1.8 不同浓度提取液抑菌试验
将生药含量为 1 g/mL的原液用无菌水稀释，得
50%、25%、12.5%、10%、6.25%、5%、3.125%、1.563%、
0.781%加原液 10个浓度梯度，各吸取 1 mL放入小试
管中；用无菌镊子夹取20片灭菌小纸片放入各试管中
浸泡 30 min；以抑菌谱试验中得出的最敏感菌株金黄
色葡萄球菌作为指示菌种；每皿用无菌镊子夹取 2片
浸泡不同浓度药液的小纸片贴在含菌平板上，以无菌
水浸泡小纸片作为对照，每个浓度的药液做3次重复；
倒置37℃下培养18 h后观察并用游标卡尺测量各浓度
下的抑菌圈直径[12-13]。
1.9 峨嵋双蝴蝶提取物抑菌效价的测定
1.9.1 标准青霉素溶液的配制 准确称取0.8 g KH2PO4
和0.2 g K2HPO4，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，转入
试剂瓶中灭菌备用。准确称取15 mg注射用青霉素钠
标准品，每毫克含1670单位（1670 U/mg，1 U即1国际
单位，等于 0.6 μg），溶解在适量的 0.2 mol/L的 pH 6.0
磷酸缓冲液中，然后稀释成 10 U/mL的青霉素标准溶
液，按表 1配制成不同浓度的青霉素溶液，保存于 4℃
备用[6]。
1.9.2 标准曲线的制备 移取各浓度的青霉素溶液1 mL，
各加入 20个小纸片浸泡。以抑菌谱试验中得出的最
敏感菌株金黄色葡萄球菌作为指示菌种，取灭菌过的
固体平板 18个，取制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，
涂布制成含菌平板。将每个平板平分成 6个部分，在
间隔的 3个区域中夹取浸有 1 U/mL标准品溶液的小
纸片贴于平板上，将每 3个平板组成一组，共分 6组。
在第1组的每个平板的3个空区域贴入0.4 U/mL的标
准液，如此依次将浸泡 6种不同浓度标准液的小纸片
分别贴入 6组平板上。倒置 37℃培养 18 h，观察并精
确测量各浓度的抑菌圈的直径，分别求得每组 3个平
板中 1 U/mL标准品抑菌圈直径与其他各浓度标准品
抑菌圈直径的平均值，再求出6组中1 U/mL标准品抑
菌圈直径的平均值，总平均值与每组1 U/mL标准品抑
菌圈直径平均值的差，即为各组的校正值[14]。
1.9.3 峨嵋双蝴蝶提取物的效价测定 将峨嵋双蝴蝶水
提取液用无菌水稀释 8倍，移取 1 mL加入 20个小纸
片。同前面方法制备含菌平板 3个，将每个平板平分
成 6个部分，在间隔的 3个区域中夹取浸有 1 U/mL标
准品溶液的小纸片贴于平板上，其他 3个区域贴入浸
试管
编号
1
2
3
4
5
6
10 U/mL工作液量/
mL
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
pH 6磷酸
缓冲液/mL
9.6
9.4
9.2
9.0
8.8
8.6
青霉素含量/
(U/mL)
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
表1 不同浓度标准青霉素溶液的配法
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周罗琴等：峨嵋双蝴蝶提取物抑菌作用研究
有药液的小纸片。倒置 37℃培养 18 h，观察并精确测
量各浓度的抑菌圈的直径，分别求出标准品溶液和双
蝴蝶提取物所致的 9个抑菌圈直径的平均值，按照上
述标准曲线的制备方法求得校正数后，将药液的抑菌
圈直径的平均值校正，再从标准曲线中查出提取物的
效价[15]。
2 结果与分析
2.1 峨嵋双蝴蝶提取液抑菌谱试验结果
从表2中可以看出，峨嵋双蝴蝶水煮100%提取原
液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达
到 40 mm以上，对表面金黄色葡萄球菌的效果次之，
抑菌圈直径达38.12 mm，其次对绿脓杆菌和福氏痢疾
杆菌的效果较好，抑菌圈直径分别为26.44、24.32 mm，
而对乙型溶血性链球菌和异型枸橼酸杆菌的抑制效果
较差，没有明显的抑菌圈出现。
2.2 不同方法的峨嵋双蝴蝶提取物对金黄色葡萄球菌
抑菌试验结果
从表 3中可以看出，水提取的峨嵋双蝴蝶提取物
的抑菌效果最好，其他不同方法提取的双蝴蝶提取物
也有不同程度的抑菌作用。
2.3 不同浓度提取液抑菌试验结果
此项试验中以抑菌谱试验中的敏感菌株金黄色葡
萄球菌作为指示菌种。表 4中结果表明，峨嵋双蝴蝶
提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为原液稀释
32倍，即 3.125%，且随着浓度的增加，抑菌效果明显
增加。
2.4 双蝴蝶提取物抑菌效价的测定
2.4.1 青霉素标准曲线制定 通过对 6组 1 U/mL标准
品抑菌圈直径的测量，求得总平均值为 22.6 mm，而
0.4 U/mL的一组中 9个 1 U/mL标准品抑菌圈直径平
均为 22.4 mm，则其校正数应为 22.6-22.4=0.2 mm，各
浓度青霉素溶液的抑菌圈直径均应为记录值加上校正
数。各浓度标准品抑菌圈直径如表 5所示，各组校正
数为0.2、0.5、0.3、0.1、0.4、0.3。
按照上述求得青霉素溶液的抑菌圈直径大小，以
青霉素溶液浓度为横坐标，以校正后的抑菌圈直径为
纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。
2.4.2 双蝴蝶提取物效价的测定 由培养观察后得到的
结果看，峨嵋双蝴蝶提取原液稀释 8倍后进行抑菌试
验得到的抑菌圈直径大小为 9个数据的平均值，记录
为 20.42 mm。根据上述方法求得的校正值为 0.2，则
不同方法双蝴蝶提取物
水提取
水对照
乙醇抽提石油醚萃取
乙醇抽提氯仿萃取
乙醇抽提乙酸乙酯萃取
乙醇浸提
乙醇对照
抑菌圈直径单位/mm
35.86
—
19.18
21.22
22.10
24.46
±
双蝴蝶提取液浓度/%
金黄色葡萄球菌抑菌圈直径/mm
100
46.06
50
39.08
25
32.34
12.5
26.24
10
18.66
6.25
14.16
5
12.06
3.125
8.60
1.563
—
0.781
—
青霉素含量/(U/mL)
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
抑菌圈直径/mm
18.6
19.6
21.0
22.6
23.8
25.6
校正后的抑菌圈直径/mm
18.8
20.1
21.3
22.7
24.2
25.9
表2 峨嵋双蝴蝶提取物对供试菌的抑菌效果
注：“—”表示没有抑菌圈；“±”表示抑菌圈不明显。下同。
表3 不同方法峨嵋双蝴蝶提取物的抑菌效果
表4 峨嵋双蝴蝶不同浓度提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌试验效果
菌种
金黄色葡萄球菌
绿脓杆菌
福氏痢疾杆菌
表面金黄色葡萄球菌
乙型溶血性链球菌
异型枸橼酸杆菌
双蝴蝶提取原液/mm
42.54
26.44
24.32
35.12
±
±
无菌水
—
—
—
—
—
—
抑菌圈直径应为20.42+0.2=20.62 mm。对照上述标准
曲线，可以查出双蝴蝶提取液的抑菌效价相当于
0.77 U/mL，换成双蝴蝶提取物中每毫克中含单位即为
61.72 U/mg。
3 结论
（1）抑菌试验表明，各种方法制备的峨嵋双蝴蝶提
取物对多种致病菌均有一定的抑制作用，其中对金黄
色葡萄球菌的抑菌效果最好，因此，临床上可将峨嵋双
表5 标准青霉素溶液抑菌圈直径大小测定
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蝴蝶提取物用于杀菌抑菌，尤其是用于治疗由金黄色
葡萄球菌引起的化脓感染等病症。
（2）分别对峨嵋双蝴蝶植物茎和叶进行了水煮提
取物抑菌试验，发现其茎提取物对供试菌均无明显抑
制作用，而叶提取物的抑菌效果明显，因此，可以初步
确定峨嵋双蝴蝶的抑菌物质主要存在于叶中，推测其
抗菌物质的合成在叶细胞中。
（3）比较峨眉双蝴蝶植物的水提物和醇提物的抗
菌效果，表明峨嵋双蝴蝶植物中含有多种抗菌物质，而
且水提取物的抗菌效果明显高于有机溶剂提取物的抗
菌效果，因此，可推测峨眉双蝴蝶植物中的抗菌物质以
水溶性物质为主。
4 讨论
近年来抗生素大量、不合理的使用，以及微生物突
变速度之快，临床耐药菌株呈现不断增长趋势，耐药性
也不断地增强，导致临床微生物感染率不断增加，给医
疗带来极大的危害[16-17]。中草药历史悠久，在疾病治
疗、传染病防控方面发挥了重要作用。中草药成分复
杂，作用机理广泛，因此，在抑菌的过程中作用机制包
括多种形式，能有效抑制病原微生物的生长繁殖；而且
中草药在国内资源丰富，使用广泛，毒副作用低，有效
地开发中草药的抑菌价值具有重要意义。
目前，国内对于中草药的抑菌研究已有不少报道，
大量研究表明，大量常用中草药都具有抑菌效果，而且
有较强的抑制作用，展现出较强的应用前景[16-20]。峨眉
山双蝴蝶植物是传统中药材，资源丰富，具有多种功
效，研究双蝴蝶植物的抑菌作用丰富了其药用价值，同
时为高效低毒抑菌药物的开发利用积累更加丰富的自
然资源。
由于本研究仅对其水提物和醇提物进行了抑菌研
究，都表现出较好的抑菌效果，双蝴蝶植物水提物和醇
提物成分复杂，对于其抑菌药物成分及抑菌机制有待
进一步研究分析。
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图2 青霉素溶液标准曲线示意图
Y=16.2+5.8X
0
5
10
15
20
25
30
0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
青霉素含量/(U/mL)
抑
菌
圈
直
径
/mm
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