全 文 ：— 25 —现代中药研究与实践2015年第29卷第1期Chin. Med. J. Res. Prac., 2015 Vol. 29 No.1
分光光度法测定展毛地椒提取物中总
黄酮含量的适应性研究
豆浩然 1，葛　亮 2,3，陈　杨 1，许梦洁 1，董晓旭 1，付　京 1，倪　健 1*
（1. 北京中医药大学中药学院， 北京 100102 ；2. 新疆名医名方与特色方剂学重点试验室，新疆 乌鲁木
齐 830011 ；3. 新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011）
摘　要： 目的　建立适应展毛地椒提取物中总黄酮含量的分光光度测定方法。方法　以芦丁、芹菜素、
木犀草素及槲皮素为对照品，比较直接测定法、盐酸 -镁粉、亚硝酸钠 -硝酸铝 -氢氧化钠及三氯化铝显
色法在 200 ～ 600 nm 扫描图谱，分析不同方法对展毛地椒提取物中总黄酮含量测定的适应性。结果　直接
测定法、盐酸 -镁粉显色法中，四种对照品溶液与样品溶液均无共有吸收波长。亚硝酸钠 -硝酸铝 -氢氧
化钠法以芦丁为对照品，检测波长为 502 nm。三氯化铝法以芹菜素为对照品，检测波长为 340 nm。两种方
法方法学考察均符合定量测定要求，可用于测定样品溶液中总黄酮。结论　硝酸铝显色法测定总黄酮含量
是三氯化铝显色法的 4倍左右，含量显著偏高。故选用三氯化铝显色法，其干扰小，专属性好，准确性高，
且简便快速，更适用于展毛地椒提物中总黄酮的含量测定。
关键词：展毛地椒提取物； 总黄酮；分光光度法；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2015)01-25-04
doi:10.13728/j.1673-6727.2015.01.008
Adaptability Study on Determination of Total Flavonoids in Extract of Thymus by
Ultraviolet Spectrophotometry
DOU Hao-ran1, GE Liang2,3,CHEN Yang1, XU Meng-jie1,DONG Xiao-xu1,FU Jing1, NI Jian1*
(1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 100102, China; 2. Xinjiang Key Laboratory of Famous
Prescriptions and Formulas, Urumqi 830011, China; 3. College of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical
University, Urumqi 830011, China)
Abstract: Objective To establish an ultraviolet spectrophotometry method for determining the content of
total fl avonoids in extract of Thymus. Methods Wavelength-scanning spectra were compared between 200 and
600 nm with direct method and coloration methods by Mg–HCl , NaNO2–Al(NO3)3 –NaOH, AlCl3, respectively.
Adaptability was analyzed for different methods. Results Direct method and Mg–HCl coloration method can not
apply to determine total fl avonoids in the sample solution, because the reference substances do not have the same
absorption wavelength with the extract of Thymus. The methodological evaluation of NaNO2–Al(NO3)3–NaOH
and AlCl3 coloration methods both can meet the requirements of quantitative determination, so the later two
methods can be used for determining the content of total fl avonoids. Conclusion The content of total fl avonoids
determined by NaNO2–Al(NO3)3 –NaOH was four times more than that of AlCl3. So AlCl3 coloration method
can be simple, rapid, reliable and reproducible, and can be better used for the determination of total fl avonoids in
extract of Thymus.
Key words: extract of Thymus；total fl avonoids；ultraviolet spectrophotometry；content determination
基金项目：北京市“十病十药”研发项目（Z131100002513011）；国家自然科学基金项目（面上项目：81173563）；北京中医药大学复方中药制药创新团队基
金项目 (2011-CX70-13）
作者简介：豆浩然（1989-），女，在读硕士，研究方向：中药制剂新剂型及新技术研究。E-mail ：dhrbucm@163.com
* 通讯作者：倪健（1964-），男，博士，教授，研究方向：中药制剂新剂型及新技术研究。E-mail ：njtcm@263.net
展 毛 地 椒 Thymus quinquecostantus Celak. var.
przewalskii (Kom.) Ronn. 为唇形科百里香属植物，以
地上部分入药，是 1977 版药典收载的地椒栽培品种
之一，功能祛风解表，行气止痛，用于感冒、头痛、
牙痛、周身疼痛、腹胀冷痛 [1-2]。百里香属植物含挥
发油类、黄酮类、三萜类、单萜糖苷、有机酸等化合
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物 [3]，其中挥发油类成分研究较多，黄酮类成分鲜有
报道。目前已报道的黄酮类成分主要有芹菜素、木犀
草素、紫衫叶素、藤黄菌素、芫花素、圣草酚、槲皮
素等 [4]。总黄酮含量作为质量控制指标，一般采用比
色法和HPLC 法，比色法应用较广的有亚硝酸钠 –硝
酸铝 –氢氧化钠法、三氯化铝法、盐酸镁粉法 [5]。不
同紫外分光光度法对展毛地椒总黄酮的适应性研究
未有相关报道。本实验选用芦丁、芹菜素、木犀草素、
槲皮素四种常见黄酮对照品，比较不同显色方法的全
波长扫描图谱，选择对展毛地椒提取物中总黄酮具有
适应性的测定方法，为展毛地椒总黄酮的进一步研究
提供参考。
1　仪器与试药
1.1　仪器
TU1810 紫外 - 可见分光光度计（北京普析通用
仪器有限责任公司）；ZDHW 电热套（北京中兴伟
业仪器有限公司）；BT-125D 型电子分析天平 ( 德国
Sartorius 公司 ) ；DZKW-4 水浴锅（北京中兴伟业仪
器有限公司）。
1.2　试药
芦丁（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：
311）；芹菜素（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：
03/080610）；槲皮素（四川成都维克奇生物科技有限
公司，批号：100081）；木犀草素（四川成都维克奇
生物科技有限公司，批号：111520）；其它试剂均为
分析纯，水为蒸馏水。
展毛地椒提取物（展毛地椒购于北京峰顺康医
药有限责任公司，批号：11313101）由北京中医药
大学中药鉴定系刘春生教授鉴定该样品为唇形科百
里香属植物展毛地椒Thymus quinquecostati Celak. var.
Przewalskii (Kom.) Ronn.
2　方法和结果
2.1　标准溶液的制备
精密称取芦丁、芹菜素、木犀草素、槲皮素对照
品各 3.14、4.13、3.25、3.16 mg，分别置于 50 ml 容
量瓶中，加 70%乙醇适量超声溶解，定容至刻度线，
配制成浓度分别为 62.8、82.6、65.0、63.2 μg·ml-1
的对照品溶液。
2.2　样品溶液的制备
精密称取展毛地椒提取物 0.05 g，置于 50 ml 量
瓶中，加 70% 乙醇适量超声溶解，定容至刻度线，
离心取上清液备用。
2.3　显色方法的考察
2.3.1　直接测定法　　精密吸取一定量芦丁对照品
溶液、芹菜素对照品溶液、木犀草素对照品溶液、槲
皮素对照品溶液及样品溶液置入 10 ml 量瓶中，70%
乙醇定容至刻度线，在 200 ~ 600 nm 波长范围内进
行扫描，70% 乙醇作空白溶液。结果见图 1 , 芦丁 (A)
在 362 nm 和 258 nm 处有两个最大吸收峰，芹菜素 (B)
在 341 nm 和 268 nm 处有两个最大吸收峰，木犀草素
(C) 在 354 nm 和 256 nm 处有两个最大吸收峰，槲皮
素 (D) 在 372 nm 和 256 nm 处有两个最大吸收峰，而
样品 (E) 在 328 nm 和 285 nm 处有两个最大吸收峰，
对照品和样品的最大吸收波长均不吻合，说明直接测
定法不适合于测定展毛地椒提取物中总黄酮。
图 1 直接测定法全波长扫描图
Fig.1 Full wavelength scanning of direct method
2.3.2　盐酸 - 镁粉法　　精密吸取一定量芦丁对照
品溶液、芹菜素对照品溶液、木犀草素对照品溶液、
槲皮素对照品溶液及样品溶液，分别置于有 300 mg
镁粉的具塞刻度试管中。将试管置于冷水浴 (15℃ )
中，缓慢滴加 3 ml 浓盐酸，并不时振摇试管。待反
应充分后加入 70% 乙醇补足至 10 ml 并摇匀，置于
沸水浴中加热 60 min，取出 , 迅速冷却至室温，用
70% 乙醇补足溶液至 10 ml，以溶剂及显色试剂为参
比溶液，在波长 200 ~ 600 nm 范围内扫描对照品溶液
和样品溶液的吸收光谱 , 结果见图 2。由图 2可见，
A、B、C、D 四曲线在 200 ~ 600 nm 之间与 E曲线均
无共有吸收波长，盐酸 -镁粉显色法不适合于展毛
地椒提取物中总黄酮的测定。
图 2 盐酸镁粉显色法全波长扫描图
Fig.2 Full wavelength scanning of Mg–HCl coloration method
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2.3.3　亚硝酸钠 –硝酸铝 –氢氧化钠法　　精密吸
取一定量芦丁对照品溶液、芹菜素对照品溶液、木
犀草素对照品溶液、槲皮素对照品溶液及样品溶液
分别置入 25 ml 量瓶中，各加 70% 乙醇至 6 ml，加
5% NaNO2 的溶液 1 ml，摇匀放置 6 min ；加 10% 的
Al(NO3)3 溶液 1 ml，摇匀放置 6 min ；加 4% NaOH 溶
液 10 ml，再加 70% 乙醇定容至刻度，摇匀，放置
15 min。以溶剂及显色试剂为参比溶液，在 200 ~ 600
nm 全波长扫描，结果见图 3。由图 3可见，B、D两
曲线在 200 ~ 600 nm 之间无最大吸收，A、C、E 三
曲线在 500 nm 左右均有最大吸收，其中芦丁对照品
溶液 A的最大吸收波长为 502 nm，样品溶液 E的最
大吸收波长为 500 nm，两者最大吸收波长吻合。因
此亚硝酸钠 –硝酸铝 –氢氧化钠显色法可用于测定总
黄酮含量，以芦丁为对照品，检测波长为 500 nm 。
图 3硝酸铝显色法全波长扫描图
Fig.3 Full wavelength scanning of NaNO2–Al(NO3)3–NaOH coloration
method
2.3.4　三氯化铝法　　精密吸取一定量芦丁对照品
溶液、芹菜素对照品溶液、木犀草素对照品溶液、槲
皮素对照品溶液及样品溶液分别置入 10 ml 量瓶，加
0.1 mol·L-1 的 AlCl3 70% 乙醇溶液 0.5 ml，70%乙醇
定容至刻度，摇匀，放置 15 min，以溶剂及显色试剂
为参比溶液，在 200 ~ 600 nm 全波长扫描 [6]，结果见
图 4。由图 4 可见， A 的最大吸收波长为 425 nm，C
的最大吸收波长为 400 nm，D的最大吸收波长为 430
nm。芹菜素对照品 B和样品溶液 E的最大吸收波长
均为 340 nm，最大吸收波长吻合。三氯化铝显色法
可用于测定总黄酮的含量，以芹菜素为对照品，检测
波长为 340 nm 。
图 4 三氯化铝显色法全波长扫描图
Fig.4 Full wavelength scanning of AlCl3 coloration method
图 1 ~ 图 4 ：芦丁 (A) 显色后全波长扫描图，芹
菜素 (B) 显色后的全波长扫描图，木犀草素 (C) 显色
后的全波长扫描图，槲皮素 (D) 显色后的全波长扫描
图，样品 (E) 显色后的全波长扫描图。
由上述 4种方法可见，直接测定法不适合于测定
展毛地椒提取物中总黄酮。而盐酸镁粉显色方法中，
样品图谱与对照品图谱相差甚远，最大吸收波长均
不吻合，同样不适合展毛地椒总黄酮的测定。以硝
酸铝显色法测定展毛地椒总黄酮时，样品显色后的全
波长扫描图谱与芦丁对照品显色后的全波长扫描图
基本接近，最大吸收波长分别 500 和 502 nm，最大
吸收波长吻合，可用于展毛地椒总黄酮含量的测定；
氯化铝显色法中，样品显色后的最大吸收波长与芹菜
素对照品显色后的最大吸收波长均为 340 nm，可用
于测定展毛地椒中总黄酮。通过图谱比较，亚硝酸钠 –
硝酸铝 –氢氧化钠显色法和三氯化铝显色法均可用于
测定展毛地椒总黄酮含量，以下通过比较两种显色方
法的方法学考察数据和总黄酮含量测定差异，优选展
毛地椒总黄酮的最佳测定方法。
2.4　亚硝酸钠 –硝酸铝 –氢氧化钠法和三氯化铝法
的方法学考察
2.4.1　亚硝酸钠 –硝酸铝 –氢氧化钠法的方法学考
察　　按 2010 版《中国药典》附录ⅩⅧ A“中药质
量标准分析方法验证指导原则”，进行了方法验证。
结果显示：芦丁浓度在 0.012 ~ 0.096 mg·ml-1 范围，
相应吸光度在 0.136 ~ 1.142 范围内线性关系良好，回
归方程为 A = 12.022C － 0.001 5 ( r = 0.999 8 ) ；加标
回收率为 97.16% (RSD = 0.38%，n=6 ) ；在 80 min 内
进行芦丁对照品和样品的稳定性实验，RSD 分别为
0.12% 和 2.28%，显色稳定；精密度与重复性试验的
RSD 分别为 0.56% 和 2.94%，说明本方法符合定量测
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定要求，可以用于测定展毛地椒中总黄酮含量。
2.4.2　三氯化铝法的方法学考察　　按 2010 版《中
国药典》附录ⅩⅧ A“中药质量标准分析方法验证
指导原则”，进行了方法验证。结果显示：芹菜素浓
度在 1.65 ~ 12.4 μg·ml-1 范围，相应吸光度在 0.127
~ 0.908 范围内有良好线性 , 回归方程为 A = 72.968
C+ 0.009 9 (r = 0.999 8 ) ；加 标 回收率为 100.08%
(RSD=0.67%，n=6) ；在 80 min 内进行芹菜素对照品
和样品显色后的稳定性实验，RSD 分别为 0.47% 和
0.34 %，显色稳定；精密度与重复性试验的RSD 分
别为 0.56% 和 2.28%，说明该显色方法符合定量测定
要求，可用于展毛地椒中总黄酮含量的测定。
2.5　总黄酮含量的测定
亚硝酸钠 –硝酸铝 –氢氧化钠显色法和三氯化铝
显色法测定展毛地椒提取物中总黄酮含量比较，测定
结果见表 1。
表 1 展毛地椒提取物中总黄酮含量测定结果（mg·g）
Tab.1 The content of total flavonoids in extract of Thymus
样品 硝酸铝法 氯化铝法
1 333.86 87.41
2 353.93 86.47
3 355.23 86.30
4 346.15 84.51
5 356.30 88.44
6 340.97 87.67
均值 347.74 86.80
RSD 2.60% 1.58%
由上述数据可以看出：硝酸铝显色法测定样品中
总黄酮含量是 347.74 mg·g-1，氯化铝显色法测定的
含量是 86.80 mg·g-1，前者是后者的 4倍左右，硝酸
铝显色法测得含量显著偏高，干扰偏大，专属性低，
故采用三氯化铝法测定展毛地椒中总黄酮含量，结果
准确合理。
3　讨论
紫外分光光度法是测定黄酮、多糖、生物碱、皂
苷等总部位常采用的方法，以对照品与样品共有吸收
波长为检测波长进行含量测定，但化合物选择吸收
的波长和强度，决定于分子中的生色团和助色团 [7]，
中药成分复杂，种类繁多，选择适宜的显色方法 , 确
保含量测定的准确性尤为重要。硝酸铝显色法是基
于具有 3- 羟基、4- 羰基或 5- 羟基、4- 羰基或邻二
酚羟基的黄酮类化合物与亚硝酸钠和硝酸铝可形成
配合物，并在碱性条件下进一步重排成红色化合物。
某些黄酮类物质 ( 黄芩苷、黄芩素、香蒲新苷、山奈
酚、槲皮素、橙皮苷等 ) 在 500 nm 处无最大吸收或
吸收很弱，而某些具有邻二酚羟基的非黄酮类物质
在 500 nm 处左右也有最大吸收或较强吸收 [8-9]，说
明此方法有局限性，专属性不强，准确性较差。氯化
铝显色法是依据具有 3- 羟基、4- 羰基的黄酮类化合
物与 Al3+ 形成配合物，专属性更强，准确性高。
硝酸铝与三氯化铝两种显色法方法学考察均符
合定量要求，都可用于测定展毛地椒中总黄酮含量，
但前者测得含量是后者的 4 倍左右，结果偏高，可
能是因为在 500 nm 处显色的非黄酮类物质较多，干
扰较大。故展毛地椒中总黄酮的最佳测定方法为三
氯化铝显色法，以芹菜素为对照品，检测波长为 340
nm。后期富集展毛地椒总黄酮研究中发现，以三氯
化铝显色法测定富集物中总黄酮含量为 28%，而硝
酸铝显色法测定含量接近100%，结果远大于真实值，
进一步证明三氯化铝法测定展毛地椒中总黄酮含量
的合理性。此方法的建立为展毛地椒总黄酮的进一步
开发和利用提供了参考。
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收稿日期：2014-05-21