全 文 ：收稿日期:2013 － 01 － 17
基金项目:甘肃省科技支撑计划项目( 0804NKCA119 － 08)
作者简介:王晶晶( 1985 － ) ，女，在读硕士研究生，主要从事中药制剂工艺与新剂型研究。
通信作者:景明( 1963 － ) ，男，教授，主要从事中藏药资源与开发研究。Tel: 0931 － 8761250 E-mail: jm@ gszy． edu． cn
聚酰胺树脂分离纯化藏药湿生扁蕾总黄酮的工艺研究
王晶晶1，景 明1，2，陈正君1，陈 晖1
(1．甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000;2．甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000)
摘要:目的 考察聚酰胺树脂分离纯化藏药湿生扁蕾总黄酮的最佳工艺。方法 70%乙醇回流提取湿
生扁蕾，提取液回收乙醇后上聚酰胺树脂柱吸附，用不同体积分数乙醇洗脱，比色法检测洗脱液总黄酮的含
量。结果 聚酰胺树脂能很好地吸附湿生扁蕾中的总黄酮，70%乙醇洗脱总黄酮的回收率为 90． 32%。聚
酰胺树脂在适当处理后可重复利用，但随着重复利用次数的增加，聚酰胺树脂对黄酮的吸附力不断下降。结
论 湿生扁蕾提取物经聚酰胺树脂分离纯化能得到较纯的总黄酮，且工艺简便易行，得率高，为工业化生产
提供了参考依据。
关键词:湿生扁蕾;总黄酮;聚酰胺树脂;分离纯化
中图分类号:R284． 2 文献标志码:B 文章编号:1003 － 8450(2013)03 － 0035 － 04
湿生扁蕾为龙胆科扁蕾属植物 Gentianopsis pa-
ludosa(Munro)Ma．的干燥全草，藏药名称机合斗，产
于甘肃、青海、四川、西藏等地区，生长在海拔 2
300 ～ 4 100 m的河滩草地、沟边、山坡，具有清热解
毒、健脾止泻等功效，主治肝炎、胆囊炎、热病发斑、
泄泻、肠胃炎、结膜炎、疮疥肿毒等［1］。湿生扁蕾主
要含有黄酮类和三萜类化合物［2］，其中黄酮类具有
抗炎、抗腹泻作用［3 － 4］。对湿生扁蕾中木犀草素等
黄酮类含量测定的研究已有报道［5］，但有关总黄酮
的提取与分离未见报道。聚酰胺树脂对各种黄酮类
化合物具有较好的吸附分离效果，且容量大，近年来
广泛用于天然产物的分离［6 － 7］。我们利用聚酰胺
树脂吸附、乙醇水溶液洗脱的方法，分离湿生扁蕾中
的总黄酮，为充分开发利用这一资源提供依据。
1 材料与仪器
湿生扁蕾药材 2008 年 7 月采自甘肃省甘南藏
族自治州夏河县，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为
湿生扁蕾 Gentianopsis paludosa(Munro)Ma．;芦丁对
照品，中国药品生物制品检定所，批号 100080 －
200707，供含量测定用;聚酰胺树脂，沧州宝恩吸附
材料科技有限公司，批号 20100303;所用化学试剂
均为分析纯。
UV － 3600 二级管阵列紫外可见分光光度计
(日本岛津) ，R － 200 旋转蒸发仪(瑞士 BUCHI 公
司) ，AE －240 电子天平(梅特勒 －托利多仪器上海
分公司) ，KT －350W 超声波清洗器(江苏昆山超声
技术有限公司) ，HH －601 恒温水浴锅(金坛市恒丰
仪器公司)。
2 含量测定
2． 1 对照品溶液的制备
精密称取在 120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品
20． 2 mg，置 50 mL 容量瓶中，加 60%乙醇适量，超
声使溶解，放冷，加 60%乙醇至刻度，摇匀。精密量
取 25 mL，置 50 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇
匀，即得每毫升含无水芦丁 0． 202 mg的溶液。
2． 2 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液 1． 0，2． 0，3． 0，4． 0，5． 0，
6． 0 mL，分别置 25 mL 量瓶中，各加 30%乙醇至 6
． 0 mL，加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，
再加 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。加氢
氧化钠试液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置 15
min，以相应试剂为空白，在 500 nm波长处测定吸光
度。以吸收度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘
制标准曲线，得回归方程为 A = 11． 660 35C + 0． 000
039 ，R = 0． 998 9，芦丁在 0． 202 ～ 1． 212 mg 范围内
呈良好的线性关系。
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2． 3 样品测定
精密吸取相当于湿生扁蕾 2． 0 g 的提取液、上
柱液、流出液、水洗液及洗脱液，分别置蒸发皿中，水
浴蒸干，残渣加 60% 乙醇，超声使溶解，转移至 1
00 mL容量瓶中，加 60%乙醇至刻度，摇匀，精密量
取 25 mL，置 50 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇
匀，精密量取 3． 0 mL，置 25 mL容量瓶中，加 30%乙
醇至 6． 0 mL，按“2． 2”项下的方法，自“加 5%亚硝
酸钠溶液 1 mL”起，依法测定总黄酮含量。其中提
取液总黄酮含量为 1． 83 mg /mL。
3 分离纯化条件优选
3． 1 上柱液的制备
称取湿生扁蕾全草，粉碎，过 60 目筛，70%乙醇
回流提取 2 次(12 倍量，1． 5 h;8 倍量，1． 5 h) ，合并
提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，离心
(3000 r /min，15 min) ，得上清液，平均分为 5 份，分
别加水稀释至总黄酮质量浓度为 0． 86，1． 17，1 ． 35，
1． 61，1． 83 mg /mL的溶液作为上柱液。
3． 2 上柱液质量浓度的确定
将不同质量浓度的湿生扁蕾上柱液分别通过 5
根聚酰胺柱(内径为 1． 5 cm 的玻璃柱，树脂量以干
树脂计均为 15． 0 g) ，收集流出液，树脂柱用水洗至
流出液近无色，收集水洗液，分别测定流出液及水洗
液总黄酮的含量，计算比上柱量和比吸附量，最佳上
样质量浓度为 1． 35 mg /mL，结果见表 1。
表 1 上样浓度考察结果
上样质量浓度
/(mg /mL)
上样体积
/mL
比上柱量
/(mg /g)
比吸附量
/(mg /g)
0． 86 331． 4 22． 32 21． 38
1． 17 243． 6 22． 17 21． 31
1． 35 211． 1 22． 13 21． 24
1． 61 177． 0 19． 49 17． 35
1． 83 155． 7 17． 46 14． 18
3． 3 上柱量的确定
量取质量浓度为 1． 35 mg /mL 的湿生扁蕾上柱
液 300 mL，过聚酰胺柱，分段收集流出液，每 2 5 mL
收集 1 份，共收集 12 份，测定每份流出液总黄酮质
量浓度。第 11 份流出液总黄酮质量浓度突然增大，
说明总黄酮开始泄漏，此时上柱液体积为 250 mL，
上柱量 22． 5 mg /g，结果见表 2。
表 2 上柱量考察结果
流份
(序号)
总黄酮质量浓度
/(mg /mL)
流份
(序号)
总黄酮质量浓度
/(mg /mL)
1 0． 00 7 0． 00
2 0． 00 8 0． 00
3 0． 00 9 0． 00
4 0． 00 10 0． 02
5 0． 00 11 0． 97
6 0． 00 12 1． 35
3． 4 洗脱剂的确定
按上述所确定的吸附条件，取质量浓度为 1
． 35 mg /mL的湿生扁蕾上柱液 250 mL，共 4 份，分别
通过 4 根聚酰胺柱，先用水洗，再分别以 30%，
50%，70%，95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，测定总
黄酮含量，计算保留率，70%乙醇洗脱的保留率达
90%，结果见表3。
表 3 洗脱剂考察结果
洗脱剂体积分数
/%
洗脱剂用量
/mL
总黄酮回收率
/%
30 187 21． 65
50 112 64． 01
70 80 90． 32
95 59 91． 02
3． 5 洗脱剂用量的确定
将质量浓度为 1． 35 mg /mL 的湿生扁蕾上柱液
250 mL 上柱，水洗，70%乙醇洗脱，分段收集洗脱
液，每 10 mL收集 1 份，共收集 14 份，测定洗脱液总
黄酮质量浓度。第 9 份洗脱液中总黄酮质量浓度已
明显降低，说明总黄酮的洗脱已基本完全，此时
70%乙醇用量 80 mL，结果见表 4。
3． 6 树脂重复使用次数的考察( 稳定性考察)
按上述确定的工艺条件，在同一根树脂柱上重
复进行吸附—解吸附操作，分别计算树脂对总黄酮
的比吸附量。随着树脂的吸附 － 解吸附次数的增
加，总黄酮比吸附量呈下降趋势，当树脂的吸附—解
吸附次数达 12 次时，总黄酮的比吸附量低于 70%，
此时已不能达到含量限度的要求，提示树脂使用 12
次以后应进行再生。因湿生扁蕾是用 70%乙醇进
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行提取，其提取液水溶性杂质较少，所以树脂能重复
使用 12 次，结果见表 5。
表 4 洗脱剂用量考察结果
流份
(序号)
总黄酮质量浓度
/(mg /mL)
流份
(序号)
总黄酮质量浓度
/(mg /mL)
1 0． 10 8 1． 25
2 0． 15 9 0． 25
3 0． 18 10 0． 18
4 0． 75 11 0． 13
5 2． 30 12 0． 05
6 2． 40 13 0． 01
7 2． 00 14 0． 00
表 5 树脂使用次数考察结果
使用
次数
比吸附量
/(mg /g)
使用
次数
比吸附量
/(mg /g)
1 21． 43 8 20． 15
2 21． 35 9 19． 64
3 21． 19 10 18． 42
4 21． 12 11 16． 16
5 21． 04 12 15． 21
6 20． 87 13 13． 33
7 20． 43 14 11． 54
4 讨论
从天然药物中分离黄酮类化合物的方法较多，
较常用的是聚酰胺色谱。聚酰胺树脂是分离纯化黄
酮类物质的较好的分离载体，黄酮类物质含有较多
的酚性 － OH，其羟基通过氢键容易与带有酰胺键的
聚酰胺树脂很好结合。不同的黄酮类化合物在聚酰
胺上的层析行为有一定的规律性，而影响聚酰胺吸
附能力的因素很多，主要有:1)与黄酮类化合物分
子形成氢键的基团数目有关，能形成氢键的基团数
目越多则吸附力越强;2)与形成氢键基团的位置有
关，如所处位置易于形成分子内氢键，则吸附能力减
小;3)分子内芳香化程度越高，共轭双键越多，则吸
附力越强;4)不同类型黄酮类化合物被吸附强弱顺
序不同，黄酮醇 ＞黄酮 ＞二氢黄酮醇 ＞异黄酮;5)
与溶剂介质有关。在水中形成氢键的能力强，吸附
强，在有机溶剂中则较弱，在酸性溶剂中强，碱性溶
剂中最弱，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱
至强的顺序为:水 ＜甲醇或乙醇(浓度由低到高)＜
丙酮 ＜稀氢氧化钠水溶液或氨水 ＜甲酰胺 ＜二甲基
甲酰胺 ＜尿素水溶液［8］。
本试验对聚酰胺树脂吸附分离湿生扁蕾黄酮类
化合物的工艺条件进行了考查，结果表明，湿生扁蕾
黄酮的上样质量浓度为 1． 35 mg /mL、上样量为 2
2． 5 mg /g(每克干树脂)时湿生扁蕾黄酮不会发生
泄漏。洗脱剂乙醇不同体积分数的洗脱效果具有较
大差异，且并不是乙醇的体积分数越大洗脱效果越
好，这与近年来的文献报道的结果有所不同。30%，
50%乙醇对湿生扁蕾总黄酮洗脱的回收率分别为
21． 65%，64． 01%，达不到含量要求，70%，95%乙醇
洗脱湿生扁蕾总黄酮的回收率均在 90%以上，但
95%乙醇易挥发，操作的安全性较差，经综合考虑确
定 70%乙醇为洗脱剂，用量为干树脂体积的 5 ． 5
倍。湿生扁蕾黄酮纯化含量达到 70%，湿生扁蕾黄
酮类物质得到很好的纯化效果。
聚酰胺对湿生扁蕾总黄酮有较好的吸附力，但
随着吸附 －洗脱次数的增加，对总黄酮的吸附将会
减弱，当使用一定的周期而总黄酮的回收率不能满
足要求时，必须进行再生，且再生工艺应能保证再生
后树脂性能的相对稳定，并能保证树脂纯化工艺的
稳定。当聚酰胺经有机溶剂进行再生处理后，湿生
扁蕾总黄酮回收率仍不能达到要求时，应根据需要
更换新的聚酰胺。
参考文献:
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菌作用初探［J］． 天然产物研究与开发，2005，17(5) :5
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扁蕾中木犀草素和 1，7 －二羟基 － 3，8 －二甲氧口山酮的
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其在银杏黄酮类化合物提取中的应用［J］． 植物资源与
环境，1999，8(1) :10 － 14．
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Technical study on separation and purification of total flavonoid in
Gentianopsis paludosa(Mum．)Ma by polyamide resin
Wang Jingjing1，Jing Ming1，2，Chen Zhengjun1，Chen Hui1
(1． Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China;
2． Gansu Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology，Lanzhou 730000，China)
Abstract:Objective To investigate the optimum process on separation and purification of total flavonoid in
Gentianopsis paludosa(Mum．)Ma by polyamide resin． Methods Gentianopsis paludosa(Mum．)Ma was extracted
by circulation reflux of 70% ethanol，the extracting solution was adsorbed on polyamide resin column after the etha-
nol was recovered，then eluted with different concentrations of ethanol，detected the content of total flavonoid in elu-
tions by colorimetric method． Results Polyamide resin could adsorb the total flavonoid in Gentianopsis paludosa
(Mum．)Ma very well，the retrieve ratio of the total flavonoid was 90． 32% by 70% ethanol，the content of the elu-
tion was 71． 21% ． Polyamide resin could be utilized repeatedly after disposed properly，but the capacity of adsorp-
tion was declining with the times was increasing． Conclusion The more pure total flavonoid in Gentianopsis palu-
dosa(Mum．)Ma can be found by separation and purification of polyamide resin，and the craft is not complicated，it
can offer reference for industrialization production．
Key words:Gentianopsis paludosa(Mum．)Ma;total flavonoid;polyamide resin;
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
separation and purification
·临床研究与报道·
收稿日期:2013 － 03 － 18
基金项目:安徽省高校省级自然科学研究项目( KJ2012Z215)
作者简介:王正( 1976 － ) ，男，主治医师，讲师，医学硕士，主要从事骨伤科临床、科研及教学工作。
关节镜清理配合中药内服治疗早、中期膝关节
骨性关节炎临床观察
王 正1，吕明安2，刘安平1，王 峰1，张建华1，梁文武1，储诚煜1
(1． 安徽中医学院第一附属医院骨伤科，安徽 合肥 230031;
2． 安徽中医学院方剂教研室，安徽 合肥 230038)
摘要:目的 观察关节镜清理配合内服活血利水中药治疗早、中期膝关节骨性关节炎的临床疗效。方法
对 30例膝关节早、中期骨性关节炎患者采用膝关节镜清理配合活血利水中药内服治疗，于术前，术后 2
周、3 月及半年进行疼痛及膝关节功能评分。结果 治疗后所有患者切口均一期愈合，无手术并发症。膝关
节疼痛较术前有不同程度的减轻，关节功能明显改善。治疗前后视觉模拟量表( VAS) 、JOA评分存在显著性
差异，其中术后半年 VAS评分最低、JOA评分最高。术后 3 月、半年 VAS 评分明显低于术前和术后 2 周，术
后半年 VAS评分明显低于术后 2 周、3 月( P ＜ 0． 01) ;术后 3 月、半年 JOA评分明显高于术前和术后 2 周( P
＜ 0． 01) 。结论 膝关节镜清理配合中药内服能有效减轻膝关节疼痛，恢复膝关节功能，对早、中期膝关节
骨性关节炎是较为理想的治疗方案。
关键词:膝关节骨性关节炎;膝关节镜;中药;活血利水
中图分类号:R274． 9 文献标志码:B 文章编号:1003 － 8450(2013)03 － 0038 － 03
膝关节骨性关节炎好发于中老年患者，是以膝
关节软骨退变为主，累及软骨下骨、滑膜和关节周围
组织为特征的一种慢性膝关节疾病，也是最常见的
一种慢性、进展性关节疾病［1］。我们自 2011 年 5 月
至 2012 年 9 月对 30 例(30 膝)早、中期膝关节骨性
关节炎患者采用关节镜有限清理术配合活血利水中
药内服治疗，分别在术后 2 周、3 月及半年随访并进
行疗效评价，疗效满意。
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Vol. 30 No. 3
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