全 文 ：基金项目:广东省自然科学基金(编号:2015A030313585) ，国家中医药管理局行业专项(编号:201507004)
通讯作者:沈志滨 Tel:13724866019 E-mail:szb8113@ 126．com
狗肝菜多糖 P2B对 CCl4致 L-02肝细胞损伤的保护作用
许丹华1 何宇愿1 杨世豪1 李恺祺2 杨雄辉3 沈志滨1 (1． 广东药学院 广州 510006;2．中国药科大学药学
院;3．国药集团德众药业有限公司)
摘 要 目的:探讨狗肝菜多糖(P2B)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝 L-02细胞损伤的保护作用。方法:培养人肝 L-02 细胞，
建立 CCl4肝细胞损伤模型，分组实验:正常对照组、CCl4损伤组和不同浓度的 P2B(0．125、0．25和0．5 mg·ml
－1)样品组。采用
MTT法检测生化分析培养液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)以及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛
(MDA)含量。结果:与 CCl4损伤组相比，各 P2B样品组细胞活力明显增强，上清液中 ALT、AST活性明显降低;细胞内 SOD明
显升高、MDA含量降低。结论:P2B对 CCl4诱导的体外 L-02肝细胞损伤均具有保护作用，随着浓度的增加，作用也随着增强，
其机制可能与其抗氧化作用有关。
关键词 狗肝菜多糖;肝损伤;四氯化碳
中图分类号:Ｒ285．5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2016)04-0675-03
Protective Effect of Diclipterachinensis Polysaccharide P2B on Carbon Tetrachloride-induced Injury of Liv-
er Cell Line L-02
Xu Danhua1，He Yuyuan1，Yang Shihao1，Li Kaiqi2，Yang Xionghui3，Shen Zhibin1(1． Guangdong Pharmaceutical University，Guan-
gzhou 510006，China;2． School of Pharmacy;3． Sinopharm Dezhong Pharmaceutical Co． Ltd．)
ABSTＲACT Objective:To evaluate the protective effect of Diclipterachinensis polysaccharide P2B on liver cell line L-02 injury in-
duced by carbon tetrachloride (CCl4)． Methods:The human liver L-02 cells were cultured，and the injury model was built by CCl4 ．
The L-02 cells were divided into the normal control group，the CCl4-damaged group，and the P2B sample groups (0．125，0．250 and
0．500 mg·ml－1)． The contents of alanine aminotransferase (ALT) ，aspartate aminotransferase (AST) ，superoxide dismutase (SOD)
and malondialdehyde (MDA)were determined by MTT assay． Ｒesults:Compared with the CCl4-damaged group，P2B could improve
the activity of L-02 cells，and the activity of AST and ALT in the supernatant was significantly reduced，and the content of SOD in the
cells was increased and that of MDA was decreased． Conclusion:P2B can significantly prevent L-02 cells from the damage induced by
CCl4 in a dose-dependent manner，and the mechanism may be related with the anti-oxidative activity of P2B．
KEY WOＲDS Diclipterachinensis polysaccharide;Hepatocyte injury;Carbon tetrachloride
狗肝菜为爵床科植物狗肝菜属狗肝菜(Di-
clipterachinensis L． Ness)的干燥全草，主产于福建、
台湾、广东、广西等地。味甘、苦，性微寒。具有清热
解毒、凉血止血、生津、利尿等功效。常用于感冒发
热，暑热烦渴，乳蛾，疔疮，便血，尿血，小便不利等
症。，前期工作表明，狗肝菜多糖保肝作用的活性部
位为相对分子质量小于 6 000 Da 的多糖部位，对已
分离得到的 6 000Da以下的均一多糖组分 P2B进行
了体外实验［1，2］。本文采用 CCl4损伤 L-02 肝细胞
作为体外肝细胞损伤模型，研究 P2B 对肝细胞损伤
的保护作用。CCl4可经肝细胞的细胞色素 P450 Fe
2+
作用产生 O2－，并通过自由基反应扩展程序产生·
CCl3等自由基。·CCl3生成后引起脂质过氧化而导
致细胞膜、细胞器损伤［3］，从而选择维生素 E 为阳
性对照。本实验通过建立 CCl4体外肝损伤模型，研
究 P2B对 CCl4肝细胞损伤的保护作用，并初步探究
其作用机制，为狗肝菜多糖在预防和治疗肝损伤性
疾病提供实验依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验用肝细胞株:L-02 人胚肝细胞，购自广州
永津生物科技有限公司。狗肝菜(全草)购于广州
市清平市场，经广东药学院中药学院刘基柱副教授
鉴定为爵床科植物狗肝菜 Diclipterachinensis(L．)
Nees．。P2B由广东药学院中药楼 435 实验室提取
(对狗肝菜多糖的活性部位分子量小于6 000Da部位
进行分离纯化。采用二乙胺基乙基纤维素(DEAE-
52)离子交换层析法和葡聚糖凝胶 G-50 层析法，通
过凝胶渗透色谱法进行纯度鉴定，最终得到均一多
糖组分 P2B，P2B 相对分子质量为 4 925，纯度为
576
中国药师 2016年第 19卷第 4期 China Pharmacist 2016，Vol．19 No．4
98%以上，批号为 20140306)。
1．2 试药
高糖 DMEM 培养基［赛默飞世尔生物化学制品
(北京)有限公司］，批号:NZK1246;青链霉素混合
液(北京索莱宝科技有限公司) ，批号:20140624;胎
牛血清(杭州四季青) ，批号:140809;胰蛋白酶
(Gibco 公司) ，批号:20140706;二甲基噻唑二苯基
四哗溴盐(MTT，Sigma 公司) ，批号:MKBP4399V;二
甲亚砜(DMSO，阿拉丁公司) ，批号:C1411039;四氯
化碳(CCl4) (天津市科密欧化学试剂有限公司) ，批
号:20140806，丙 氨 酸 转 氨 酶 (ALT) ，批 号:
20141225，天冬氨酸转氨酶(AST) ，批号 20141228，
超氧化物歧化酶(SOD) ，批号:20141230，丙二醛
(MDA) ，批号 20141230，试剂盒均购于南京建成生
物工程研究所;维生素 E(Sigma公司) ，批号 V8030。
1．3 仪器
超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限
公司)二氧化碳恒温培养箱(Thermo)倒置显微镜
(Olympus)酶标仪(BioTek Instruments)。
1．4 MTT法测定细胞存活率
实验分组:设空白对照组、CCl4模型组(终浓度
为 6 mmol·L－1)、维生素 E(终浓度为 50 mmol·
L－1)+ CCl4组、相对分子质量小于 6 000 Da 多糖
(0．5 mg·ml－1)+ CCl4组、P2B(0．5，0．25，0．125 mg
·ml－1)+ CCl4 3 个样品组，每组设 6 个复孔。
待测细胞悬液于 96 孔培养板培养 24 h 后，每
孔加入 100 μl 终浓度为0．5 mg·ml－1的 MTT 溶液
(无血清培养基稀释)。培养箱继续培养 4 h 后，吸
弃 MTT 溶液后，每孔加入 150 μl DMSO，震荡 15
min至沉淀充分溶解后，于酶标仪 570 nm 处检测 吸
光度(A)值。
存活率计算:细胞相对存活率 =(试验组 A 值－
空白组 A值)/(对照组 A 值－空白组 A 值)×100%。
1．5 细胞培养上清液中 ALT、AST、SOD、MDA 检
测［4］
取上述贴壁生长的肝细胞，实验设空白对照组、
CCl4模型组 (终浓度为 6 mmol·L
－1)、维生素 E
(终浓度为 50 mmol·L－1)+ CCl4组、相对分子质量
小于 6 000Da 多糖组(0．5 mg·ml－1)、P2B(0．5，
0．25，0．125 mg·ml－1)+ CCl43 个样品组，每组设 3
个复孔。按照分组分别加入 CCl4、不同质量浓度的
多糖、维生素 E 及培养液，各组继续培养 24 h 后，
收集培养上清液，根据试剂盒说明，测定 ALT、AST、
SOD、MDA的吸光度(A)值。通过查找标准曲线，根
据 A值计算相应酶活力值。
1．6 统计学处理
采用 SPSS 20．0 统计软件处理数据。结果数据
以 珋x±s 表示，比较采用 t 检验双样本等方差假设统
计学处理进行比较分析，双尾 P＜0．05为差异有统计
学意义。
2 结果
2．1 P2B对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤存活率的影响
MTT法测定结果如表 1 所示。CCl4损伤后模型
组细胞存活率明显降低，仅为(62．16±1．62)%。正常
组与 CCl4模型组差异有统计学意义(P＜0．01)。狗肝
菜多糖 P2B各剂量组与 CCl4模型组比较，细胞存活
率显著提高，多糖浓度越高，效果越好，存在剂量效应
关系。各多糖组与 CCl4模型组比较，差异有统计学意
义(P＜0．01)。结果提示狗肝菜多糖 P2B能够显著提
高 CCl4损伤 L-02肝细胞的存活率。
表 1 P2B对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤存活率
的影响(%，珋x±s，n=6)
组别 存活率
空白组 96．02±5．23
CCl4模型组 62．16±1．62a
维生素 E组 93．44±2．07b
相对分子质量小于 6000 Da 多糖组 80．54±5．24b
P2B 高剂量组(0．5 mg·ml－1) 89．50±2．79b
P2B 中剂量组(0．25 mg·ml－1) 82．97±2．30b
P2B低剂量组(0．125 mg·ml－1) 78．43±2．04b
注:与空白组比较，aP＜0．01;与模型组比较，bP＜0．01。
2．2 P2B 对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤培养上清中
ALT、AST的影响
实验结果如表 2 所示。CCl4模型组的 ALT 和
AST水平均较空白对照组明显升高(P＜0．01) ，提示
CCl4损伤肝细胞后，促进了肝细胞内肝功能相关
表 2 P2B对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤中 ALT、
AST的影响(U·L－1，珋x±s，n=3)
组别 ALT AST
空白组 0．67±0．64 0．83±0．76
CCl4模型组 11．01±1．56a 9．17±0．83a
维生素 E组 3．42±2．11 2．04±1．77
相对分子质量小于 6000Da多糖组 3．50±1．44 4．86±0．53
P2B高剂量组(0．5mg·ml－1) 1．13±0．85c，e 2．94±0．17c，d
P2B中剂量组(0．25mg·ml－1) 4．82±1．14d，d 4．35±0．35c，d
P2B低剂量组(0．125mg·ml－1) 7．58±0．85b，d 7．00±0．31b，d
注:与空白组比较，aP＜0．01;与模型组比较，bP＜0．05，cP＜0．01;与
维生素 E组比较，dP＜0．05，eP＜0．01。
676
www．zgys．org 研究论文
酶 ALT和 AST的释放。阳性对照维生素 E 组和各
多糖处理组中的 ALT 与 AST 水平均比 CCl4模型组
降低，P2B各剂量组存在剂量效应关系。P2B高、中
剂量组的 ALT与 AST水平与 CCl4模型组比较，差异
有统计学意义(P＜0．01)。结果提示 P2B 能够显著
改善 CCl4致 L-02肝细胞损伤的肝功能相关酶的释
放。
2．3 P2B 对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤培养上清中
SOD、MDA的影响
CCl4损伤后模型组的肝细胞中丙二醛(MDA)
含量明显升高(P＜0．01) ，超氧化物歧化酶(SOD)的
活性明显降低(P＜0．01) ，提示 CCl4损伤引起了 L-02
肝细胞抗氧化能力的下降。P2B 各剂量组的 MDA
含量与 CCl4模型组比较，差异均有统计学意义(P＜
0．01) ，并存在剂量效应关系，其中 P2B 的高剂量组
抑制 MDA含量升高的能力与阳性药物维生素 E 组
的能力相当。各剂量组 SOD 活力仍可维持在较高
的水平，并且上述变化呈一定的量效关系，结果见
表 3。结果提示 P2B 能够提高 CCl4损伤正常 L-02
肝细胞的抗氧化能力。
表 3 P2B对 CCl4致 L-02 肝细胞损伤中 MDA、
SOD的影响(珋x±s，n=3)
组别
MDA
(nmol·mgprot－1)
SOD
(U·mgprot－1)
空白组 4．89±0．19 9．35±0．50
CCl4 模型组 29．70±3．93a 4．27±1．20a
维生素 E组 6．25±0．35 7．12±0．57
相对分子质量小于 6000 Da 多糖组 13．79±0．46 5．65±0．69
P2B 高剂量组(0．5 mg·ml－1) 6．84±0．15c，e 6．71±0．40b，d
P2B 中剂量组(0．25 mg·ml－1) 9．93±0．38c，d 5．97±0．31b，d
P2B低剂量组(0．125 mg·ml－1) 18．77±0．50c，d 5．62±1．15b，d
注:与空白组比较，aP＜0．01;与模型组比较，bP＜0．05，cP＜0．01;与
维生素 E组比较，dP＜0．05，eP＜0．01。
3 讨论
体外的实验模型由于不消耗动物，不受机体其
他系统的影响，模型稳定，容易控制，并且经济便宜，
在保肝药物的研究中起到了很重要的作用，体外实
验适用于筛选试验，后续体内验证。
研究结果显示，CCl4模型组可明显降低 L-02 肝
细胞的存活率，明显升高 L-02肝细胞培养上清液中
的 AST、ALT活性以及 L-02肝细胞内的 MDA含量，
同时可明显降低 L-02 肝细胞内的 SOD 活力。P2B
各剂量组与模型组相比，L-02 肝细胞存活率显著上
升 AST、ALT 活性显著降低，同时 L-02 肝细胞中
MDA的活力显著升高，但是 L-02 肝细胞中 SOD 含
量的变化不明显。说明 P2B 对 CCl4 诱导的体外 L-
02肝细胞损伤均具有保护作用。
其主要机制为 CCl4可与肝细胞的细胞色素
P450结合反应产生·CCl3，其自身能结合核酸、蛋
白，造成肝细胞功能障碍;另外，·CCl3还可以生成
活性更强的 CCl3OO·、OH·等自由基·，这些自由
基会导致 DNA键断裂，也可以攻击生物膜中的多不
饱和脂肪酸，促发膜脂质过氧化链式反应。双链脂
肪酸过氧化(聚合)可导致 MDA 形成增多，MDA 可
作用于核因子 NF-KB，使白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤
坏死因子-α(TNF-α)等致炎因子基因表达、释放增
加;脂质过氧化物可损伤生物膜，使肝细胞膜通透性
增加，从而导致 ALT 与 AST 等酶的释放增加［5，6］。
SOD是细胞内主要的防御性抗氧化酶，能够清除自
由基，减轻脂质过氧化链式反应，保护各种生物膜的
结构稳定与功能完整。CCl4可导致 SOD 活性降低，
清除自由基功能受抑制，从而加重脂质过氧化链式
反应，并导致肝细胞死亡［7］。
参 考 文 献
1 赵沁元，崔红花，吴洁莹，等．狗肝菜不同相对分子质量多糖对
D-GlaN致大鼠急性肝损伤的保护作用［J］．中国实验方剂学杂
志，2013，19(13) :261-264
2 崔红花，于治成，沈志滨，等．狗肝菜不同相对分子质量多糖对四
氯化碳致大鼠急性肝损伤的保护作用［J］．中国实验方剂学杂志，
2013，19(9) :185-190
3 王福根，孙静霞．肝损伤动物模型的建立和应用［J］．中国药房，
2006，17(9) :702-703
4 张玲莉，彭燕．急性肝损伤模型建立与血清生化指标相关性研究
［J］．中国药师，2015，18(9) :1460-1463
5 Yang XJ，Jing L，Ye LB，et al． In vitro and in vivo protective effects
of proteoglycan isolated from mycelia of Ganodermalucidum on carbon
tetrachloride-induced liver injury［J］． World Journal of Gastroenterolo-
gy，2006，12(9) :1379-1385
6 Guo TT，Xu HL，Zhang LX，et al． In vivo protective effect of Por-
phyrayezoensispolysaccharide against carbon tetrachloride induced
hepatotoxicity in mice［J］． Ｒegul Toxicol Pharmacol，2007，49(2) :
101-106
7 李俊鹏，金毅，王平，等．牛樟芝胶囊对大鼠四氯化碳肝损伤的保
护作用研究［J］．中国药师，2013，16(7) :964-966
(2015-10-28收稿 2015-12-31修回)
776
中国药师 2016年第 19卷第 4期 China Pharmacist 2016，Vol．19 No．4