全 文 ：给 8 卷 第 2 期
. 19 :年 s月
病 毒 学 推
C H INS J E E O U RA N L O FV 互 R O L OG 丫
V o l
.台 N o。 2
l u口 . 9 19 3
用 免疫 电镜 技 术研 究 长 叶车 前花 叶
病毒 株 系 的血 清学 关 系
徐均烧 李拐葆
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州 )
萤
扭 . 应用免疫吸附和免痊修饰电镜技术研究了长叶车前花叶病毒杭州株 ( R M V ha ) 、 油
莱花叶病毒北京株 ( Y M V 15 ) 、 烟草花叶病毒上海株 ( T M V I 及 T M V I ) 、 烟 草 花叶病毒浙
江农科院番茄分离株 ( T M V n 。 ) 等的血清学关系。 以抗血清吸附的病毒 t 和病毒 被抗 血清. 饰
的强弱 , 确定各毒株间的血清学关系发现 , R M V h a 与Y M V 15 关系较近 ; T M y l 与 T M V n 。有一
定的血清学关系 ; 但R M V h a 、 Y M V i s与T M V I 、 T M V n o 之间的血清关系较远 . 其 中以 RM V h a
与T M V 。 。关系最远 . 结果表明病毒被同源及异源杭血清吸附及修饰的差异可用以研究不同 T M V 、
RM V间的血清关系。
关份闷 长叶车前花叶病毒 免疫吸附电镜技术 免疫修饰电镜技术
免疫电镜技术由于其直观性强 、 灵敏度高 、 简便快速等优点 , 现己广泛应用于病毒研究
的各个领域 , 如病毒的诊断 、 结构分析、 抗血清效价测定 、 病毒分类及病毒血清关系程度的
研究等 〔1一 7〕 。 长叶车前花叶病毒 ( R i b g r a s s m o s a i e v i r u s , R M V ) 是一种重要的植物病
毒 , 寄主范围广 , 能侵染 10 科 50 多种植物 〔。 , 但对它与烟草花叶病毒 ( T o b a c c o m os ia 。
vi r su
,
T M V ) 等不同毒株间的关系 了解甚少 。 应用免疫电镜技术进行这方面的研究将是一
有益的探索 。
材料与方法
( 一 ) 曲弃来泣及 . 取
R M V h a 杭州大白菜分离物 , 由本校盛方镜赠送 ; Y M V 15北京油菜分离物和 T M V I 及 T M V I 上海油
菜分离物均由本校张永平脂送 : T M V 。 。 浙江农科院番茄分离物 , 由浙江农科院林瑞芬姗送 。
上述分离物分别接种于黄苗愉烟上扩大繁殖 , 取病叶5 0 9 , 冰冻后剪碎 , 加入 1 0 m l 0 . o 5 M P B ( p H 7)
和 1肠筑荃乙醉 , 摘碎 3~ 4分钟 , 双层纱布过健 , 取汁液 , 加人 20 肠抓仿 ( 或 8肠 正丁醉 ) , 低速离心 , 取
上清 , 加 4肠 P E G + 2务 N a CI , 4 ’ C下放置 4小时或过夜 , 4 。。 o r rn/ in 离心 l小时 , 取沉淀 , 悬浮 于生 理盐
水 ( 。 . 85 务 N a C )I 至 3二 I , 4 0 0 r/ nI 恤离心 10 分钟 , 取上清重复离心1次 , 用生理盐水惫浮后保存于4 ’ C 冰箱
中备用 。
( 二 ) 抗血油的一备
Y M V i s
、
R M V h a
、
T M V I
,
T M V n o 等通种抗血清按下法制得 :
取上述各病毒 l m l , 分别加福氏完全佐剂 l tn l , 乳化后分别注射于家兔后腿肌肉 , 每周1次 , 第三次用
提纯抗原直接注射家兔静脉 , 3 周后放血 , 按常规方法分离抗血清 , 琼脂双扩散法侧定效价 , 加 0 . 02 肠盈
收稿 日期 : 1 9幻1年 5月一7日 , 同年 7月1 2日修回 .
DOI : 10. 13242 /j . cnki . bi ngduxuebao . 000776
乞期 用免皮电镜技术研究长叶车前花叶病毒株系的血清学关系 1 7 5
氮钠低温保存。
( 三 )免疫电镇方法
1
. 免疫吸附电镜法 ( s iEM )在保涅的培养皿蜡膜上分别滴一滴稀释抗血清 , 载网倒扣其上 , 处理 5分
钟 , 用 20 滴连续的0 . I M的 P B ( p H 7 )冲洗载网 ,滤纸吸去水份后立即倒扣在一滴有病毒的 样品上 ,放置15
分钟或过夜 , 用 30 滴不连续的蒸馏水冲洗载网面 , 经 6滴 2肠磷钨酸染色后 ,以滤纸接触载网边缘吸干水份 ,
在 1 2。。 E X透射电镜1万倍下观察 、 拍照并随机计数 10 个视野的病毒粒子数 。
2
. 免疫修饰电镜法 载网倒扣在 1摘有病毒的样品上 , 放置 1 5分 , 用 20 滴。 . I M P B ( p H 7 )连续冲洗 ,载
网吸去水份后 , 立即倒扣在抗血清液摘上 , 室温下保持 15 分 , 用 30 滴蒸馏水冲洗载网 , 经 6滴 2肠磷钨酸染
色 , 滤纸吸去水份后让其干燥 , 在放大 3万倍的电镜下拍照 , 并比较修饰强弱 。
结 果
一 、 免疫吸附电镜技术检 测各毒株的血清学关系
上述 4种病毒株分别用 4种同源及异源抗血清吸附处理 , 以正常血清为对照 , 所得结果列
于表 1 , 用新复极差法 ( s R 法 ) 进行差异显著性比较表明存在极显著差异 。 从病 毒 与抗血
清交互吸附结果分析可看出 : 1 . 病毒被同源抗 血 清吸附的量为最大 , 极显著地多于被其它
异源抗血清吸附的量 , 不同的异源抗血清吸附量之间也有显著或极显著差异 。 从差异的显著
性可 了解血清学关系的程度 。 2 .某一病毒的抗血清吸附各病毒及此病毒被各抗血清吸附的量
差异显著性比较所得的结果是一致的 。 3 . 各病毒与抗血清交互吸附比 较结 果 是一致 的 , 即
R M V h a 与 Y M V 15关系很近 , 两者和 T M V I关系较近 , 和 T M V n o很远 , 而 T M V I 和 T M V n o
间的关系也较远 , 但看来要比后者与 R M v h a和 Y M v 15 间的关系近一些 , R M v h a 与 T M V n 。
间的关系最远 。
表 1 不同抗血清对 4种病毒的吸附 l
T a b
.
i T h e f o u r t r a p p e d n u m b e r o f p a r t i e l e s b y h o m o l o g o u s a n d h e t e
r o l o g o u s
a n t i s e r a
抗 血 清
A n t i s
e r a
病毒 V i r u s
R M V h a Y M V 1 5 T M V I T M V n o ( T M V n ) T i
. 。
X
R M V h a
Y M V 1 5
T M V I
T M V
n o
正常血清
N o
t 口 a l
S e r U 刃O
5 9 8 5
6 1 6 0
2 72 3
2 5 1
2 3
4 0 95
1 1 3 6 1
2 5 2 7
2 2 8
2 1
4 6 9 0
7 0 3 3
8 0 1 3
1 6 5 9
5 5
3 1 3
1 5 1 2
2 0 3
6 3 5 1
7 4
4 7 9 0
3 7 9 6
2 0 5 8
4 14 4
6 8
1 9 8 7 3
2 9 8 6 2
1 5 5 2 6
1 2 6 3 3
2 4 1
3 9 7 4
。
6
5 9 72
。
4
5 9 7 2
。
4
2 5 2 6
。
6
4 8
。
2
T
。
i
。
X
。
i
。
1 51 4 2
3 0 2 8
。
4
1 82 3 2
二3 6 46 。 4
2 1 4 5 0
4 2 90
。
6
8 4 5 3
1 6 9 0
。
6
1 4 85 6
2 9 71
。
2
7 8 1 3 3
注 : T i二 与 T . i . 为横行及竖行总和 , X i二与X . i . 为横行及竖行平均数 。
N
o t e : T i二 , T . i . r e P r e s e n t t h e t o t a l s o f v e r t i e a l l i n e a n d h o r i z o n t a l l i n e , r e s P e c t i v e l y . X i二
X
.
1
. r e P r e s e n t t 五e m e a n v a l u e s o f v e r t i e a l l i n e a n d h o r i z o n t a l l i n e , r e s P e e t i v e l y 。
17 合 病 毒 李 报 8 卷
二 、 修饰法检测各毒株的血清学关系
取上述四毒株分别用4 种抗血清进行修饰 , 以正常血清作对照 , 电镜下观察 拍 照 , 结果
如表 2及图版 I 。 从病毒与抗血清交互修差异表明 : 1 . 病毒被同源抗血清修饰最强烈 , 各异源
抗血清也能不 同程度地部分修饰 , 但均不能被对照血清所修饰 , 说明病毒被修饰的强弱一定
程度上可反映病毒的血清学关系 。 2 .某一病毒间被不 同抗血清修饰与某一抗血清修饰各病毒
的结果分析是一致的 。 3 . R M V h a与 Y M V 15 关系很近 , T M V I与 T M V n 。间 的关系也很近 ,
但 R M V h a 、 Y M v l s与 T M V I 、 T M v n o间的关系较远 , 且以 R M v h a 与 T M v n o 间的关系更
远 。
衰
T a b
病弃与杭血清交互修饰趁异
D i f f e r e n e e o f d e e o r a t i o n s t r e n g t h b y h o m o l o g o u s
a n d h e t e r o l o g o u s a n t i s e r a
抗血清
种 类
T y P O o f
挂 n t l -
吕. r扭
病毒被杭血清修饰强弱差异 类病毒 种 抗血清间修饰病毒强弱羞异
0 i f f e r e n c e o f d . c o r a t i o n
一t r o n g t h ` m o n g v i r u s e s
T y P o o f
V I ! U 吕 e 吕
D i f f
e r e n c e o f d e c o r a t i o n
s t r e n g t h a m o n g a n t i s o r .
+ 十 十 + + 士 ( 一 ) 十 + 十 土 ( 一 )
A n t i
-
R M V h
a
R M V h a Y M V 1 5 T M V I
T M V n
o
R M V h
a A n t i
一
A
n t i
·
A n t i
-
R M V h a Y M V 1 5 T M V I
A n t i
·
T M V n
o
A
n t i
-
丫 M V 15
Y M V 1 5 R M V h a T M V
n o
T M V I
Y M V 15 A n t i
一
A
n t i
一
A n t i
一
A n t i
-
Y M V 1 5 R M V血 T M V n o T M V I
A n ! i
·
T M V I
T M V I T M V n o R M V h
a Y M V 1 5 T M V I A n t i
-
T M V I
A
n t i
·
T M V 立。
A n t i
·
Y M V 15
A n t i
·
R M V h吕
A
n t i
-
T M V n o
T M V n o T M V I R M V h a
Y M V 15
T M V n o A n ! i
一
A
n t i
-
T M V n o T M V I
A n t i
-
Y M V 15
A n t i
-
R M V h -
注 . + + + , 表示修饰最强烈 , 十 + 表示修饰较强 , + 表示能够修饰 , 但修饰很弱 , 士不能修饰 。
N
o t e : + + + D e c o r a t e d v e r y s t r o n g l y , + +
,
D e c o r a t e d s t r o n g l y , +
,
D e c o r a t e d w e a k l y ,
士一 N o t d e c o r a t e d 。
三 、 修饰法与 I SE M法的比较
1
. 修饰法与 I S E M 法所得结果基本 上是一致 的 。 但修饰法结果表明 T M V I与 T M V n 。 的
关系很近 , 而 sI E M 未能看出二者间有明 显 的关系。 其原 因可能与低效价的 T M V I抗血清经
稀释后对 T M v n 以内毒的吸附量明 显 减 少 有关 。 但从总体上看其分析结果是一致的。
2
. 作者采旧 T M V n 。抗血清处理后的载网分别吸附四种不 同病毒 , 然后再分别用 T M V n 。
抗血清修饰 , 结果发现 T M V n o 的病毒吸 附量最大 , 相应的修饰也最强烈 , T M V I的吸附量
次之 , 修饰也次之 ; Y M V 15 的吸附量 明显减少 , 修饰也较弱 ; R M V h a 的吸 附量最少 , 修饰
也最弱 。 这进一步证实了 _巨述结果所认为 的 4种病毒株间的亲缘关系程度 。 所以我们认为这
两种方法相结 合叮成为 R M V 等病毒株 间 血清关系研究及区 分的较好方法 。
3
.
I S E M 法能 从病毒吸附量的变化定 员地分析病毒株间的血清关系 , 而修饰法则较适宜
」从病 毒修饰的强弱变化定性地区分不同的病毒株 。 如作者用一种抗血清 修饰同一载 网上的
2 期 用免疫电镜技术研究长叶车前花叶病毒株系的血清学关系
两毒株 , 结果凡是血清学上有差异的病毒株均能用抗血清修饰的强弱来区分 。 这些试验更直
观地证实了各病毒株间的血清学关系的差异 。
讨 论
1
.上述结果与生物化学特性的研究结果是一致的 。 如 G ib bs 等〔 8〕和 P a l u k ia it s等〔的分别
用外壳蛋白氨基酸序列及R N A核昔酸序列的同源性测定结果分析了 R M V 、 Y M v 与 T M v 等
株系间的进化关系 , 认为Y M V 与 T M V 的氨基酸序列及R N A核昔酸序列同 源性 差异相对较
小 , 而 R M V 与 T M V 间的这些差异相对较大 , 这与 本 研 究中R M V h a与 T M V n o血清关系比
Y M V 巧远的结果是一致的 。 又如张永平等〔10 〕用单克隆抗体技术对不 同血清型长叶车 前花叶
病毒进行分型 , 发现 T M V g u 一 t( 广州番茄株与 T M V n o 相似 ) 与 T M v l 有一个异源决定簇 , 血
清差异率为 1 % ; T M V g u 一 t与 R M V h a和 Y M V 1 5有 9个异源决定簇 , 血清差 异 率为 60 % ,
T M V I与 R M V h a和 Y M V l s有 8个异源决定簇 , 血清差异率为 5 7% ; T M V I与 T M v l 有 8个异
源决定簇 , 血清差异率为 62 % , 这些结果与本试验所得结果基本相符 , 但他们未发现 R M V ha
与Y M V 15 间的血清型差异 , 而本试验中发现两者是有差异的 。
2
.
sI E M 主要是从病毒吸附量 的差异来进行各毒株间的血清关系的研究的 , 可 结 合 统计
学方法定量地分析差异的显著性 , 对各病毒毒株间的血清学相关程度的研究较为适宜 。 而修
饰法主要是根据病毒被血清修饰的强弱来评定株系间血清相关性的 , 但差异程度很难定量 ,
只能进行定性分析 , 所以在株系区分方面有用 , 如本文应用一种抗血清区分两种不 同的病毒
株 。 如果能把 I S E M 法与修饰法结合起来 , 则对于病毒株间的区分及血清关系程度的研究是较
好的 。
3
. 试验条件的选择对获得稳定可靠的结果 , 保证试验的重现性和特异性具有重要意义 。
本文曾预先比较了试验条件 , 发现载 网以具F or m ar 膜喷碳的镍 网并进行亲水处理后立即使
用效果较好 , 抗血清工作浓度在 sI E M 中以 1 , 25 。 , 修饰法以 1 , 40 较佳 , 处理时间抗血清反
应为 15 分钟 , 病毒捕捉时间为 4小时 ; 温度一般为室温 ;并用 2 %磷钨酸作为负染液效果较好 ,
这些试验条件与国外的某些报道是基本一致的。
参 考 文 献
〔 1 〕 盛方镜等 : 浙江农业大学学很 , 9 , 39 , 1 9 8 3
〔 2 〕 P u e i f u l l D E e t a l : P l a n t D i s , 6 8 : 2 3 0 , 1 9 8 工
C 3 〕 B r a d e s J e t a l : A d y V i r u s R e s , 1 1 : 1 , 1 9 65
〔 4 〕 R o b e r t s 1 M e t a l : G e n V i r o l , 4 7 , 2 0 9 , 1 9 8 4
〔 5 〕 W a l k e y D G A e t a l : r h y t o P a t h o 1 Z , 1 1 0 . 3 1 9 , 1 9 8 4
〔 6 〕 L 七 s七 m a n 几 D E : A e t a H o r t i , 1 2 7 : 1 5 9 , 1匀8 3
〔 7 〕 S h u k l a D D e t a l : P l a n t D i s , 6 3 : 2 04 , 1 9 8生
〔 8 〕 G i b b s A e t a l : I n t e r v i r o l o g y , 1 8 : 1 6 0 , 1 9 8 2
〔 9 〕 P a l u k a i t i s P e t a l : V i r o l o g y , 1 0 7 : 3 5 4 , 1 9 8 0
〔 1 0 〕 张永平等 : 病毒学报 , 8 , 峨5 , 1 9 8 7
1 78 病 毒 学 报 8 卷
几 S D T U O YN T HE
R1BG AS S M R OSA ! C
M 1S C RO C OP Y
S E R O IG O ICA L RA E LT旧 S PN H IAM N OG T HE
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(105 *i t ut 口 o f Bi o t e e 人” 0 10夕夕 , Z h e j .l a . g A 夕 r fe “ l t u r o I U 月 .l口公 r , ` f夕 )
T h e s e r o l o g i e a l r e l a t i o n s h i P s a m o n g f o u r v i r u s s t r a i n s o f R i b g r a s s
M o s a i e V i r u s H a n g z h o u i s o l a t e ( RM V h a )
,
Y o u e a i M o s a i e V i r u s B e i j i n g
i s o l a r e ( B
r a : : i e a e a o P e : t r i s L
.
Y o u e a i
,
Y M V 1 5 )
,
T o b a e 。 0 M o s a i。 V i r u s
S h a n g五a i i s o l a t e ( T M V I ) , T o b a 。 e o M o s a i。 V i r u s Z h e j i a n g i s o l a t e ( T M V
n o )
,
h a v e b e e n s t u d i e s w i t h i m m u n o s o r b e n t e l e e t r o n m i c
r o s e o p y ( I S E M )
a n d i m m u n o 一 d e e o r a t i o 压 e l e e t r o n m i c r o s e o P y b y e o m P a r i s o n r h e t r a P P e d
n u m b e r o f P a r t i e l e s a n d d e
c o r a t i o n s t r e n g t h b y h o m o l o g o u s a n d h e t e r o l o 一
g o u s a n t i s e r a
.
I t w a s f o u n d t h a t t h e r e w a s e l o s e r s e r o l o g i e a l r e l a t i o n s h i P
b e t w e e n R M V h a a n d Y M V 15
, a s w e l l a s T M V I a n d T M V n o
,
h o w e v e r
R M V h a a n d Y M V 1 5 w e r e d i s t a n t l y r e l a t e d r o T M V I a n d T M V n o
, e s P e e i -
a l ly R M V h a t o T M V n o
.
I n a f u r t h e r s t u d y w e h a v e f o u n d t h a t d i f f e r e n t一
i a l t r a P P i n g w a s m u e h s i m P l e
r a n d b e t t e r t o u s e t h a n t h e d e e o r a t i o n m e 一
t h o d
,
b e c a u s e t h e f o r m e r r e v e a l e d t h e r e l a t i o n s h i P a m o
n g s t r a i n s a m e n a b l e
t o q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t
, 5 0 t h e f o r m e r 15 m o r e s u i t a b l e f o r s t u d y i n g
t h e e x t e n t o f s e r o l o g i e a l r e l a t i o n s h i P a m o n g s t r a i n s
,
w h i l e t h e l a t t e r
15 b e t t e r f o r d i a g n o s i s a n d t o d i s t i n g u i s h t h e s t r a i n s
.
I t 15 s u g g e s t e d
t h a t I S E M e o m b i n e d w i t h d e
c o r a t i o n m a y b e t h e b e s t w a y t o d i s t i n g u i s h
5 t r a i n s a n d t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t o f s e r o l o g i e a l r e l a t i o n s h i P
.
K e y w o r d ,
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R i b g r a s s m o s a i e v i r u s I m m u n o s o r b e n t e l e e t r o n m i e r o -
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n o 一 d e e o r a t i o n e l e e t r o n m i e r o s e o P y
图版 皿 用免疫电镜技术研究长叶车前花叶病毒株系的血清学关系 (正 文见第 1 7 4贯 )
l Pat e兀 Sr u d yon t h es er ol o gi a el r el at i n o s hi Pa mon gt h ei R bg r a s s Mo s ai c
Vi r u s s ew i t hl m mun o
一 el e et rn o mi r eo s o e P y
( O
ri i gn al a rt i c l n o e p
.
z 7 8 )
一 、 2、 3 、 J:分别为T M Vn o抗 血清处理后吸附的T M Vn o、 T M VI、 Y M Vx s、 R M V ha病毒粒子 ( x0 10 00 )
6
、 6
、
7
、
8:分别为 T M Vn o抗 血清修饰 的 T M Vn o、 T M VI、 Y M V 25、 R M V ha病毒粒 子 ( x0 0 0 0 10 )
9 :T M Vn o抗血清修饰的 Y M V1 5和T M Vn o病 毒粒子 (义 0 0 40 0 )
10
:
T M Vn o抗血清修饰的 R M V ha和 T M Vn o病毒粒子 ( x0 400 o )
1, 2 , 3 , 4 : T M V n o
,
T M V I
,
Y M V 1 5
,
R M V h a a b s o r b e d b y a n t i
一
T M V n o r e s P e e t i v e l y ( x 1 0
,
0 0 0 )
5 , 6
, 7 , 8 : T M V n o
,
T M V I
,
Y M V 1 5
,
R M V h a d e e o r a t e d w i t h a n t i
·
T M V n o r e s P e e t i v e l y ( x 1 0 0
,
0 0 0 )
9 : Y M V 15 a n d T M V n o d e e o r a t e d w i t h a n t i
一
T M V n o ( 又 4 0 , 0 0 0 )
10 : R M V h a a n d T M V n o d e e o r a t e d w i t h a n t i
一
T M V n o ( x 4 0
,
0 0 0 )
图版 W用免疫 电镜技术研究长 叶车前花叶病毒株系的血 清学关系 (正 文见第 17 4页)
p la t e W S t ud y n ot h es e r o l og ica le r la t in os h ip a m ong t h eR g b i ra s s M os a ie
V 1r us s e w it h im m n u o
一 e le e t rn om is e e r o oPy
(0
r ig ina la rt ic le onp
.
1 78 )
11
、
2 2
、
13
、
1 4
:为经 TM V n o抗血消吸附 后再经 TMv n o抗血清 修饰 的 TMv n o、 TMv x、 Y Mv 15 、 R Mv ha 病
毒粒子 (火 0 0 40 0)
2 1
,
1 2
,
1 3
,
1凌: T M V n o , T M V I , Y M V 1 5 , R M V h a a b s o r b e d b y a n t i 一 T M V n o a n d t h e n d e e o r a t e d
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T M V n o ( 又 40 , 0 0 0 )