全 文 ：第 4 卷 第 1期
9 15 5 年 3月
病 毒 学 报
H CI N E S E JO U R N A O LF V I R O O G L Y
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19 8 8
单克隆抗体亲和层析纯化长叶车前花叶病毒
涂正金 于善谦
( 复旦大学生物系 , 上海 )
提要 长叶车前花叶病毒上海分离株 ( H R V s il ) 单克隆抗体 I H 2 , 经纯化后 以嗅化 氰活化
法偶联于S e p h a r o s e 4 B上制成亲和层析住 . H R V 5 h感染的三生烟提取液 , 经一次聚乙二醇 沉淀
初步纯化 , 悬浮液上亲和层析柱 , 于磷酸缓冲液中吸附 , 蒸馏水洗脱 。 收集的病毒制剂接种 心叶
烟有感染性 , 电镜观察见典型的 H R V s h粒子 , 紫外吸收光谱与常规方法提纯的病毒相似 , S D S -
聚丙烯酸胺凝狡电泳呈一条带 。 结果表明单克隆抗体亲和层沂得到高度纯化的 H R V s h . 最后 讨
论了单克隆抗体亲和层析方法的优点 .
关健词 长叶车前花叶病毒 单克隆抗体 亲和层析
植物病毒的纯化 , 一般需经匀浆 、 净化 、 高速和超速离心 、 密度梯度离心等步骤 。 设备
条件要求高 , 所费时间长 , 病毒在纯化过程中易受到破坏及丢失 , 特别是性质相近的几种病
毒混合感染及含量甚微的病毒 , 往往难以达到理想的纯化效果 。
近年来发展起来的杂交瘤技术获得的单克隆抗体具有针对单一抗原决定簇的特异性 。 将
其与固相载体相偶联制成免疫亲和柱 , 可特异地分离 纯化对应的抗 原 物 质。 淋 巴 因子 、 生
长因子 、 干扰素 、 受体及病毒抗原等许多物质的分离纯化已 有 报 道 。 D ia c 。等 〔1〕和 R o n a ld
等〔“ 〕分别报道了大豆花叶病毒和南方菜豆花叶病毒的单克隆抗体亲和 `层析纯化 。 本文 报 道
用长叶车前花叶病毒单克隆抗体制成亲和层析柱对该病毒的纯化 。
材料与方法
( 一 ) 病毒 长叶车前花叶病毒 上 海 分 离 株 ( R i b g r a s s M o s a i e V i r u s S h a n g h a i 15 。 l a t e ,简称
H R V s h或 R M V s h ) , 是从青菜 ( B r a : s i e a c h i n e s i s ) 上得到的一个分离株〔 3 〕, 用三生烟进行繁殖 . 按常
规纯化方法〔 4〕 , 在。 . ZM磷酸缓冲液 ( P B , p H 7 . 。 ) 中匀浆 , 8 帕正丁醇净化 , 二次聚乙二醇 ( P E G )
沉淀和一次超速离心 ( 35 。。。 r / m i n l小时 ) . 病毒最后悬浮于蒸馏水中 .
( 二 ) 单克隆抗体 H R v s h单克隆抗体 IH 2的制备 , 参考我们已报道的方法〔5 〕进行 。 H R v s h免疫分
3 次进行 : 第 l次 , 每只 B a lb / c小鼠以 5口。件g抗原用福氏完全佐剂乳化后 , 腹腔及皮下注射 . 2周后进行第
2次免疫 , 方法同前 . 第 3次 ,于融合前 3 天进行 , 经尾静脉注射5。。协g抗原溶液 。 融合时取其脾脏与小 鼠骨
髓瘤 s P Z / 。细胞以 5。肠 P E G ( M W 1 0 。 , M e r c k ) 进行细胞融合 。 经 H A T选择 , 间接E L sI A法筛选及
有限稀释法克隆 , 获得的分泌H R V s h 单克隆抗体杂交瘤接种于小鼠腹腔内 , 制备小鼠腹水 .
( 三 ) 免疫亲和柱的制备 按照 〔6〕 的方法亚作了改进 . 单克隆抗体 1H Z腹水以 4 次硫 酸铁 沉淀 及
DE AE
一纤维素柱层析纯化 , 根据 A 280n 蒯定蛋白浓度 (嗽{盖一 ` · ` ) ·取 ,0m1 沉积体积邮 e p “ a r o s e 4 ”
( P h a r a m i e a ) 加 到 Zo m l含 2 . 5肠 澳化 氰 ( B r C N , M e r e k ) 的蒸馏水中 ( 现配 ) , 冰浴中滴加 ZN
收稿 日期 : 1 9 8 7年 5月25 日 , 同年 7月 1 日修回 。
DOI : 10. 13242 /j . cnki . bi ngduxuebao . 000396
5 4病 毒 学 报 4卷
Na 0 H 控制p H l 左右 , 活化反应 a1 分钟 , 用4 0 m l预冷的蒸馏水洗涤 , 加入预先对 。 . IM N a H C O : ( 含
。 . 6 M N a CI ) p H S
.
5缓冲液透析平衡的单克隆抗体溶液 , 4 ’ C反应过夜 。抽滤 、洗涤 ,测定抽滤液的 A 2 8 o n ln
计算偶联率 。 以。 . 2 M甘氨酸封闭其中未反应基团 , 即成为 I H 2一 S o p h盯 。 5 0 4 B 。 洗涤后 将其 保存于 磷酸
缓冲液 ( O . o lM P B S p H 7 . o , 含 0 . 0 2肠 N a N : )中 .
( 四 ) H RV hs 粗提纯液制备及亲和层析纯化 取 H R V s h 感染的三生烟叶片 10 克 , 以。 . 2M磷 酸缓冲液
匀浆 , 正丁醇净化和 1次P E G沉淀 , 再以。 . ol M P B S p H 7 . 0分 3 次悬浮 , 低速离心 , 上清即为 病 毒的
粗提纯悬液 . I H 2一 S e p h a r o , e 4 B柱 ( o . o x 1 5 e m ) 预先以 0 . 0 、 M P B S平衡 , H R V s h粗提液上柱后 关
闭 , 1。 ’ C过夜 . 再以 。 . ol M P B S洗到 2 6 o n nr 处光吸收小于 。 . 0 5 . 改 用蒸馏水〔7 〕洗脱 , 分 部收 集测 定
0 D 2 6 0
n m
。
( 五 ) 亲和层析纯化样品的生物学特性鉴定 亲和层析样品以磨擦法接种 于心叶烟上 , 观察感染性 .
于紫外分光光度计上测定光吸收曲线 . 样品以 2肠磷钨酸负染 , 日立H U 一 1 1B 电镜观察形态 . 亲和层析纯化
样品 , 用不违续 S D S 一聚丙濡酷胺凝咬电泳阳〕鉴定纯度 . 电泳分离胶浓度为 15 呱 , 浓缩佼3 . 75 呱 , 1 5 OV 电
泳 4 小时 , 考马斯亮蓝 R 2 50 染色 .
结 果
一 、 分泌 H RV s h单 克隆抗体的杂交瘤 I O7 S P Z / o细胞与 105 免疫小鼠脾脏细胞在P E G
作用下融合 , 融合后于含H A T的 R P M I 16 40 培养液中培养 , 7 天后可见有细胞克隆出现 , 换
H T培养液。 待克隆增大时 , 以间接 E L I s A法筛选 , 阳性孔细胞按有限稀释法克隆。 最后获
得的杂交瘤注射到小鼠腹腔内 , 同时注射石蜡油 。 10 ~ 14 天左右产生腹水 ,低速离心去细胞 ,
上清 加 N a N 3到 终浓 度为 。 . 02 % , 4 ℃保存 。 选用的 I H 2杂交瘤腹水效价 E L IS A 法 为 10 日 ,
双扩散法为 12 8 。 抗体亚类为工g G : 。
二 、 单克隆抗体亲和层析纯 化 H R V : h I H 2腹水 Zm l , 纯化后获得 5 . 2 m g免疫球蛋 白 ,
与 l o m l S e p h a r o s e 4 B偶联 , 测得未偶联蛋 白为 1 . 7 r m g , 偶联率为 6 7 % 。制得的 I H 2 一 S e p h
a r o s e 4 B装柱平衡 。 H R V s h的粗提液共 2 9 。 9 2 A Z。 。 n m ,上 I H 2一 S e p h a r o s e 4 B柱 , 洗脱情况
如图 l所示 。 以 P l巧洗柱时出现第 l个大峰 ,
一一 :厂 -
1 0 2 0 3 0 寿 0
竹 号 T u b e n u . be r
图 1 H R V s h亲和层析纯化 (箭头表示用 H : O
洗 )
F 19
.
1 P u r i f i e a t i o n o f 壬王R V s h b y a f f i n卜
t v e il r o m a t o g r a p h y A r r o w i n d i e a 一
t e s e l u t i o 几 w i t h 工于a o
其中含有大量不能吸附的杂质。 改用蒸馏水
洗脱时出现第 2个峰 , 收集该峰 , 测定 总 吸
收为 1 . 87 A 26 o n m ,为亲和层析纯化样品 。
三 、 H R V比纯化样 品特性的鉴定 将
第 2峰纯化样品磨擦接种心叶烟 , 3天后观察
到叶片上出现枯斑 , 表明病毒有感染性 。 电
镜观察到典型的 H R V s h病毒粒子 。 纯化样品
的紫外吸收光谱 (图 Z B )呈现典型的病毒吸收
曲线 , 与按常规方法纯化的样品 (图Z A )相似 。
亲和层析纯化样品的 A 2 60 / A 2 80 和 A 26 0 / A
2 4 5分别为 1 . 1飞和 1 , 14 , 常规纯化的样品分别
1期 单克隆抗体亲和层 析纯化长叶车前花叶病毒
为 1 . 71 和 1 . 10。 亲和层析纯化和常规纯化的样品经不连续 S D S一聚丙烯酸胺凝胶电泳都 得 到
一条带 ,如图 3中A和 B所示 。 它们电泳移动距离相 同 , 说明分子量相同 。
一 6 6 。 o k
一 4 5 。 o k
一 3 4 。 7 k
一 2 4 。 o k
一 1 8 。 4 k
一 1吞。 3 k
2心 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 0 .
公 a v e l e n g t h
图 2 常规纯化 ( A ) 和亲和层 析纯化 ( B )
H R V s h 吸收光谱
F 19
.
2 A b s o r b e n t s P e e t r u m o f H R V s h
P u r i f i e d b y e o n v e n t i o n a l m e t h o d
F 19
( A ) a
n d a f f i n i t y e h r o m a t o 一泛
g r a p h y ( B )
S D S一聚丙烯酞胺凝胶电泳图 ,谱
( A ) 常规纯化病毒 ; ( B ) 亲和层析纯化 病
毒 , ( C , D ) 标准分子量蛋白。
S D S一 P A G E s l a b g e l o f v i r u s P r e 一
P a r a t i
o n s P u r i f i e d b y e o n v e n 一
t i o n a l ( A )
a n d a f f i n i t y e h r o m a t o -
g r a p h y ( B ) a n d m
o l e e u l a r 二 e i g h t
5 t a n d a r d s ( C
,
D )
.
讨 论
H R V
s h感染的三生烟叶片经聚 乙二醇沉淀的粗提液 , 再经 H R V “ h单克隆抗体偶联制成
的亲和层析柱纯化 , 在杂质峰之后用蒸馏水洗脱的部分 , 电镜观察为 H R V s h 棒状颗粒。 紫
外吸收光谱和 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶电泳 比较亲和层析纯化和常规纯化的样品有相 似的 吸收
光谱 , 达到同样的电泳纯 , 业且保 留 H R V hs 的感染活性 。 表明单克隆抗体亲和层析 可 以 达
到理想的纯化病毒效果 。 它所达到的纯度实际上是均一的抗原决定簇纯 , 特别是采用株系特
异性的单克隆抗体还可 以纯化单一株系或变异株 , 而一般纯化方法是不能达到的 。 此外 , 杂
交瘤细胞可大 量生产单克隆抗体 , 业能长期保存 。 亲和层析柱可 以反复使用 。 因此 , 该方法
是较简便 、 快速的 。 用粗提液作层析 , 由朴去除了汁液 中的一些氧化性物质 、 色素及蛋 白酶
等 , 可能比直接以植物汁液来做亲和层析更有利于保护层析柱 , 同时也使柱上杂 质 容 易洗
脱 。 亲和层析的洗脱通常是使用 p H Z . o~ 3 . 0的溶液 。 我们用稍偏酸性的蒸馏水洗 脱 , 条件
较温和 , 也有利于保持病毒颗粒的完整结构 。 这样洗脱之后再用 o . I M甘氨酸盐酸缓 冲液 p H
2
.
8洗层析柱 , 未洗出有光吸收物质 , 说明水洗脱是完全的 。 亲和层析方法可以在没有 超 速
离心机等设备条件下 , 得到理想 的纯化结果。 如果增加单克隆抗体偶联量加大柱体 , 则可以
一次纯化大量的病毒 。
65 病 毒 学 报 4卷
参 考 文 献
〔 1 〕D ia e o Re ta l: J G e n V ir o l, 6 7 : 3 4 5 , 1 9 8 6
〔 2 〕 R o n a l d W P e t a l : P h y t o P a t h o l o g y , 7 6 : 4 9 1 , 1 0 5 6
〔 3 〕徐来升等 : 上海农业科技 , 3 : 2 5 , i g a o
〔 连 〕郁操国等 : 病毒学集刊 , i : 1 2 。 , 1 9 8 2
〔 6 〕于善谦等 : 中国科学 ( B辑 ) , 1 2 : i 2 6 e , 1 9 5 6
〔 6 〕 G o o d A H e t a l : S e l e e t e d M e th o d s i n C e l l u l a r I m m u n o l o g y , p . Z s z 一 2 5 3 , W H F r e e也 a n a n d C o m ,
P a n y
,
S a n F r a n e i s e o
,
1 98 0
〔 7 〕 M a y e s E L V : M e t h o d s i n M o l e e u l a r B i o l o g 了 , V o l . z , P r o t e i n s , p . 2 5 , H u m a n a P r e s s I n e 。 , N 。 J ,
1 9 8 4
〔 8 〕 L e a口 m l i U K : N a t u r e , 2 2 7 : 6 8 0 , 1 9 7 0
F URIF IC A T IO N O F RIB G R AS S MO SA IC V IR U S
BY AF F IN IT Y C HR OMAT OG R AP HY
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( D e P a r t二口 n t o f B i o l o g y , F “ J 。 邝 U n f。 。 r s i t y , S 八a n g 凡a f )
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l e n t l了 b i n d三n g 爪 。 n o e l o n a l a 几性二b 。注了 I H Z , s p o e 王f i e f o r S h a n g h a i i s o l a t e o f
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