全 文 ：第 3 卷 第 1期
1 9 8 7年 3 月
病 毒 学 报
CH IN E S E J O U R N A L O F V IR O L O G Y
V o l
.
3
M a r e h
N
o
.
1
1 98 7
长叶车前花叶病毒上海分离株 ( HRvs h )
外壳蛋白免疫多肤的研究
朱慧慧` 巫爱珍么 王 鸣岐 ` 孙玉 昆“
祖共 长叶车前花叶病毒上海分高株 ( H R V s h )的外壳蛋白中含有 4个甲硫氨酸残基 .本文采用
澳化氛裂解 , 业结合葡聚糖凝胶 G 一 1曰柱层析 、 高压纸电泳及纸层析等方法 , 分离纯化了 6 个多肚
片段 . 经 ’ “ I标记抗体对免疫多肚的鉴定 , 表明其中二段多肚与 ” 一 gI G 的结合能力接近 完整 病
毒的水平 , 说明这二段多肚具有 H R V s h的抗原专一性 ,决定 H R V s h抗原性的抗原决定簇主要分
布子这二个肤段中 .
外壳蛋白的胰蛋白醉醉解肤谱及多肤氨基酸序列分析的结果 , 表明 H R V . 五和 H R V标准株系
间在氨基酸序列上有很大相似性 , 这就决定了两者密切的血清学亲缘关系 .
关位润 长叶车前花叶病毒 免疫多肤 氨基酸序列
应用快速 、 准确 、 特异的近代新技术 , 研究病毒外壳蛋 白的抗原性 , 不仅可进行病毒鉴
定 , 而且对病毒疫苗的研制 、 病毒性疾病或病害的诊断和防治都具有重要意义 。 近年来 , 阐
明多肤抗原的研究 已成为分子病毒学的一个重要方面〔 1〕 。
H R V
s h 是烟草花叶病毒群长叶车前花叶病毒的一个新的分离株 , 它与 H R V标准株间存
在着免疫交叉反应 , 但在氨基酸组成上不完全相同〔 2 〕。 本文报道了用澳化氛裂解 , 葡 聚糖
凝胶 G 一 10 柱层析 , 高压纸电泳 ,纸层析等方法对免疫多肤的分离与纯化 , 以及用放射免疫沉
淀方法对各个肤段抗原专一性的研究 , 比较了 H R V s h和 H R V标准株间外壳蛋 白的酶解图谱
及多肤的氨基酸序列 。
材料与方法
( 一 ) 城荆 澳化氛为上海化学试剂厂产品 ; N a ’ “ I由中科院上海细胞生物学研究所提供 , 聚跳胺薄
膜系国营黄岩化学实验厂出品 , 硫代异氛酸苯酮 ( P I T C ) 及 4 一 N N 一二甲胺基偶氮苯 4 ’ 一硫代异氛酸 醋
( D A B I T C )为中科院上海生物化学研究所东风生物化学试剂厂产品 .其它试剂均为国产 G . R及 A . R试剂 .
( 二 ) 脚. H R V s h的制 . 用毒源 H R V s h摩擦接种青菜 ( B , a : ; ￡e a e h云。 e , : i: ) , 从感病青菜中 分
离纯化 H R V s h 的方法按前文所述〔幻 .
( 三 ) 脚弃 H RV标准株的翻奋 用毒原H R V摩擦接种三生烟 ( N . t a b a e u用 c o . S a 用 s 。 , ) . 从感病
烟叶中分离纯化 H R V的方法按 G o o d i n g 和 H e b e r t方法进行〔幻 .
( 四 ) 脚 . 外亮受白的澳化佩拱解 按 F r a e n k e l一 C o n r at 〔 3〕方 法 制备病毒外壳蛋白 , 业冷 冻 千燥
得白色粉状物 . 取 10 m g蛋白用 1 nt l7 。肠甲酸溶解 , 然后按蛋白分子中含 4 个甲硫氨酸计算 , 以其 10 倍 t
加入澳化佩 , 充 N : , 在 30 ` C水浴中保温24 小时 . 反应结束 , 用蒸馏水稀释 10 倍 , 冷冻干燥 .
( 五 ) 奋肚的分离与纯化 澳化氛裂 解 物用 o . o rN 盐 酸 溶解 后 , 上 S e p h a d e x G 一 1 0 0 柱 ( 1 . o x
2。。 c m ) 层析 . 洗脱液为。 . p I N盐酸 , 流速 1 Om l / 小时 . 流出液用 7 5 1型紫外分光光度计测定2 3 On m 的 光
1
. 上海复 旦大学生物系 2 . 中国科学院 上海生 物化学研究所
收稿日期 : 1 9 8 6年 5 fj Z 日 , 同年 8 月2 5日修回 。
DOI : 10. 13242 /j . cnki . bi ngduxuebao . 000298
1期 长叶车前花叶病毒上海分离株 ( R HVs h )外壳蛋白免疫多肤的研究
学
密度 .收集洗脱峰液 ,抽干后进一步进行高压纸电泳及纸层析 . 高压电泳缓冲液为毗吮 : 醋酸 : 水 ( V / V =
10 。 , 4 , 9。。 ) 含 7 M尿素 , 在 3 。。。V 电压下电泳 l 小时 . 纸层析溶剂系统为正丁醇 : 醋酸 : 水 : 毗 吮
( V / V 二 3 0 : 6 : 24 , 20 ) , 上行层析约 1。小时 . 电泳及层析结果用 P a ul y试剂和布三酮溶液显色 . 由
于尿素付荀三嵋显色的干扰 , 电泳毕须先用酒精洗去滤纸上的尿素 , 然后再喷霉荀三酮溶液 .
( 六 ) 多肚 N末端妞若吸残` 及旅序洲定— 。 A B IT C和 PI T c双侧 合 法汤〕 多肤 样 品 用50 劳 毗 嚏溶解 , 加入 D A B I T C的毗咙溶液 , 充 N : , 50 ’ C水浴保温 50 分钟 , 再加入 P I T C , 保温 30 分钟 · 用正庚 烷 /
乙酸乙酣溶液充分洗涤反应产物以除去过量试剂 . 样品真空干燥 . 然后用无水三氟醋酸裂解 , 并用醋酸丁 醋
抽提游离的 N 末端氨基酸 . 经卯肠三氟醋酸转化后 , 用聚酞胺薄膜双向层析鉴定 . 第一向层析溶剂为 3 3肠
醋酸 , 第二向溶剂为甲苯 : 正巳烷 : 冰醋酸 ( V / V = 2 : l : 1 ) 二
( 七 ) 多吐 C末端权谷破残甚洲定— 狡肚咬 A法 仁 5 , 6 1 梭肤醉 A先 行 预 处理 〔 5 1 , 然后将多肤及蛋 白样品分别用 p H S . 5 、 。 . 2M , N 一 乙基玛福林一醋酸缓冲液溶解 . 按底物 , 醉 = 50 : 1 的比 例 , 加
入预处理的酶液 , 在 37 ’ C保温 , 按一定时间间隔取出反应液 , 沸水浴中加热 2 分钟 , 离心除去沉淀物 , 上
清液抽干后按上述方法 ( 六 ) 检查游离的氨基酸 .
( 八 ) ” ` !标记的勺Q的翻奋〔7 〕 以纯 H R V s h 制剂为抗原按常规方法免疫家兔 , 制备 H R V s h 的抗血
清 , 测定其效价为 l 口2 4 . 用 35 肠饱和度硫酸铁沉淀法制备免疫球蛋白 I g G . 取 I g G溶液 。 . s m l ( 约 1 二 g )
依次加入 1 m C i N a ’ ” I溶液及 1。时抓胺 T 溶液 ( 8 . s m g / m l ) , 混匀 , 室温反应 2 分钟 , 然后 加入 20 微
升亚硫酸氢钠溶液 ( 、24 m g / m l ) 及 1。叮 碘化钠溶液 ( 20 o m g / m l) 停止反应 . 将反应液上 S e p h a d e x ,
G一 5。柱 ( 。 . s x 6 c0 m ) 层析 , 用碘化钠溶液 ( 10 m g / m l ) 洗脱 , 收集流出液 l m l / 管 , 在井型 探 头上
测各管的放射性强度 ( c p m ) , 先流出的峰为 ’ ” I一gI G , 其最高放射强度为 6 . 4 x l o . c p 。 / 。 1 . 上述溶浓
均用。 . 01 M , p H 7 . 5的磷唆缓冲液配制 .
( 九 ) ” , !一g G与杭旅免度沉浪反应 〔幻 将抗原 H R V s b及多肤溶液分别置于小塑料离心管中 , 加
入 1。以 ’叮标记的抗体 , 混匀 . 在 3 7 ’ C水浴中保温 1 小时 , 然后加入等体积 40 肠饱和度硫酸按溶液 , 混
匀 , 18 。。。 r / m in 离心 2 分钟 , 弃上清 , 沉淀用2D 肠饱和度硫酸钱溶液洗涤二次 , 最后将管外及管盖冲洗
干净 , 测定反应管放射强度 ( 。 p m ) . 实验中用牛血清白蛋白溶液作对照 .
( + ) 奴肚 . 反应 将氨肤酶溶于。 . IM , p H 7 . 9的 T r is 缓冲液 , 使酶液浓度为 1 m g / m l ,将 S e p h ,
d e 1 G一 1。。柱层析分离的峰 I 用。 . ol M , p H 7 . 8的磷酸缓冲液溶解 , 离心取上清液 , 按 2 30n m光吸收估计
含 t . 取 40Q叭多肤溶液 ( 约80 协g ) 加入 1。时氨肤酶液 , 40 ’ C水浴中保温 20 分钟 .
( 十一 ) 病弃外壳受白映蛋白醉醉解肚奋 纤维素板准备 : 称取 , 5 9微晶纤维素 ,加 , 0 m l蒸馏水 ,匀浆
后均匀辅于 5块玻璃板上 ( 20 x 2 c0 。 ) . 板保持水平 , 室温干燥后在 70 ’ C烘箱中烘数小时 , 里干燥容器中
保存备用 . 将 T P C K处理的腆蛋白醉溶于。 . 01 M碳酸氢钱溶液 , 配成 l m ` / m l 的醉液 . H R V比和 H R V
外壳蛋白分别称取 1 m g , 加。 . 5m l重蒸水 , 在 10 ’ C水浴中煮沸 1分钟 ,冷却后加入 20 日 。 . 2 M N H . H C O :
及 50 时 T P C K 一胰蛋白酶酶液 , 3 7 ’ C水浴中保温 3小时 , 冷冻停止醉解 . 取少且蛋白醉解液点样于纤维 素
板上 , 在 p H 6 . 4的毗咙 : 醋酸 : 水 ( V / V 二 2 0 0 : 4 : 。 0 0 ) 溶液中电泳魂5分钟 , 电压为 s o o V / 每块板 。
电泳毕 , 使纤维素板干燥后在正丁醉 , 醋酸 , 水 : 毗吮 ( V / V = 3。 , 6 : 24 , 20 ) 层析溶剂中进行上 行
层析 . 层析毕 , 将板干燥 , 用。 . 3肠荀三酮 / 丙酮溶液喷雾 , 80 ` C供箱中保持 1小时 , 肤点呈蓝紫色 .
结 果
一 、 HR V s h外壳蛋白澳化抓裂解多肚的分离与纯化 用 67 %醋酸法制得的H R V hs 外壳蛋
白在 2 8 o n m 处呈现典型的蛋 白吸收峰 。 纯化的蛋 白制剂经澳化氰裂解及 eS p h a d e x G 一 1 0 柱
层析分离 , 按 23 o n m 光吸收 , 可得到 I 、 I 、 1 3 个洗脱峰 , 见图 l 。 将 I 、 I 两峰进 行 高
压纸电泳 , 峰 I 进行纸层析 , 用 P a lu y试剂显色后 , 峰 I 显示一条带 , 峰 I 、 峰 , 都可再 分
` 8病 毒 学 报 3卷
_ _
_
-一一 一一 .一一一一 ~一 - - -一 _一 一一 - - ~一 -一 一 ~ ~~ ~ ~~ . .月 ~ ~~ ~ ~~ ~` . . . . . . .尸离为 2条带。 用苟三酮显色表明 , 峰 , 中的一条带对苛三酮反应呈阴性。 由于 H R V s h外壳蛋白与 T M V一样 , 其N末端氮基酸被乙酞基所修饰 , 因此推断 , 这一多肤是外壳蛋白的N端肤
段 , 称其为 P I 。 因此 , H R V s h外壳蛋白经滨化帆裂解分为 5条肤段 , 见图 2 。
/,I
, 号
图 1 H R V s h外壳蛋白澳化氛裂解片段的分离
尸 i` . 2 C h r o . a t o g r a p h i e e l u t i o n p a t t e r n
o f e y a n o g e n一 b r o m i d e一 t r e a t e d e o a t
p r 。 t 。 i。 。 r H R v s h r r 。二 弓。 p h 。 d e x G一 10 0
二 、 多肚 N末端及 C末端扭签酸测定 狡
肤酶 A测定结果表明 , H R V s h外 壳 蛋白和
峰 , 中对苹三酮显色的肤段 , 它们的 C末端
氨基酸均为 T h r 。 因此峰 I 中这一肤段是 H
R V s h外壳蛋白的 C末端多肤 , 称其为 P 6 。
由于外壳蛋白采用澳化氛裂解 , 故其余多肚
的 C端氨基酸 均为高丝氨酸 。
多肚 N末端氨基酸的测定 , 用标准氨基
酸作对照 。 标准氨基酸经 D A B I C T偶合后 ,在
聚酞胺薄膜上作双向层析 。 纯化的 多 肤片段
测定结果表明 ,外壳蛋 白N端多肤 P l , 其N末
端氨基酸被乙酞基修饰 , 肘D N P 、 P T H等方
法都不能测出它 的 N末端 氨基 酸 。 用 D A B I
T C方法测出其N末端为 S e r 〔 。 〕 , C 端多肤
P S的N端为 A s n , 其余 3个肤段的N末端分别
为 L e u 、 L v s 、 G l u 。 H R V s h外壳蛋 白经澳化
权裂解的5个多肤的特征见表 1 。
闷破口几,nrnr.`已,
苟三
t
一、
“ i n h y·
d r i n (
-
图 2 多肚片段的进一步纯化
注 : I , l 峰 : 高压纸电泳 ,
n 峰 . 纸层析
… ’ :. 原点
F 19
.
2 P u r i f i e a t i o n o f t h e
p e p t i d e s b y p a p e r e h r o m a t o g r a P h y
( p e a k l ) o r b y h i g h 一 v o l t a g e
p a p e r e l e e t r o p h o r e s i s ( p e a k l
, 皿 )
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o t e . … … , o r i g i n
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ō一峰引P Z日,
峰 1 p e a k r 峰 n p e a k 且
1 期 长叶车前花叶病毒上海分离株 ( H R V s h )外壳蛋白免佼多肤的研究 4 9
衰 1 H RV hs 外亮班白澳化权裂解 5段多脸的特征
T a b
.
1 C h a r a e t e r i s t i e o f t h e f i v e p e P t i d e s o f H R V s h e o a t P r o t e i n
A
c
P l P Z P 3 P 4 P I5 CO O H
苟三 酮反应
N i n h y d
r i n
波利反应
P
a o ly r e a e t i o n
N一端
N一 t e r m i n a l
C一端
C一 t e r m i n a l
S
e r
高丝氨酸
h o m o
-
S e f l n e
L
e u
高抄氨酸
h
o m o
-
S e t l n e
L y s
高丝氛酸
h
o m o
-
s e r i o e
G lu
高丝氮酸
h
o功。 -
S e f l n e
人 s n
苏氮酸
T h r
免疫活性
I m m
u n o
l
o g i e a l
a e t i v i ty
( e Pm )
2 0 5 4 91 6 4母6 6 1 1 9 2 41 . 4
三 、 氮肚酶对球免疫蛋白 . g G活力的影响 用 H R V s h和 H R V s h外壳蛋白分别与氮肤 酶
液反应 2 0分钟 , 后与 ’ Z B I标记的 I g G反应 。 结果表明 ( 表 2 ) , H R V s h及 H R V s h 外壳蛋白与
免疫球蛋白 I g G的免疫沉淀反应都不受氨肤酶的影响。 说明氨欣酶既不水解 H R V s h的外壳蛋
白— N 末端乙酞化 , 也不影响免疫球蛋 白抢G的活性 。
裹 2 抓吐醉对 l g G反应活性的影晌
T a b
.
2 E f f e e t o f a m i n o P e P t i d a s e
o n H R V s h a n d o n t h e
a e t i v i t y o f Ig G
`二 I一 I g G与H R V s h特异性
样 本 反应沉淀物中的放射性强 度
( e P m )
S
a m P le e P m o f t h
e s P e e i f i
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-
e i P i t a t e , i t h
’ : “
I
一
I g G
t o H RV s h
B S A O
H RV s h 2 89 0
H RV
s
h + 撅肚酶
H RV s h + a m i n o P e P t id a s e 2 6 3 2
H RV
s h蛋白
H R V s h 一 P r o t e i n 5 4 1 6
HRV s h蛋白 + 氨肤酶
H RV s h一 P r o t e i n + 5 8 2 4
a m i n o Pe P t宜d a s e
甲 , 阅 , ~ ,
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-
.
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一 - ~ .
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衰 3 橄肚. 处理前后免应 , 肚的杭 . 活 力
T a b
.
5 A n a l y s i s o f i m m u n o l o g i e a l
a e t i v i t y o f P e P t i d e s b e f o r e
a n d a f t e r a m i n o P e P t i d a s e
t r e a t m e n t
样
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a m P Ie
免疫活性 (反应沉淀物中
的 e Pm )
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o尽 i e a l a e t i v i t y
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B S A
H RV s h
P 2
P 3
P 4
P l + P S
Pl + P S+ 擞肤酶
P l + P S+ a I n i on 碑 P -
t i d
a s e
0
37 8 8
9 1 6
48 6 6
1 1 9 2
6 3 2 8
2 0 5 4
6 0 病 毒 学 报 3 卷
四 、 免痊乡肚的鉴定 多肤的放射免疫沉淀反应结果见表 3 , 其中 , P l与 P S直接用柱层
析峰 l 为样品参加反应 , 这是由于它们必须在含有尿素的缓冲液中才能完全溶解进行高压电
泳 , 因而不利于样品的回收。 从表 3 可见 , H R V hs 、 P 3 、 以及 P I + P S混合 物表现出较高的
放射计数 。
将 1P 与P S的混合物用氨肤酶保温 , 再进行免疫沉淀反应 , 结果表明 (表 3 ) , 经氨肤酶处
理的 P l 十 P S混合物的放射计数大大减弱了 。 由于 P I是外壳蛋白 N端多肤 , 其 N 末端被乙陇基
封闭不能被氨肤酶水解 , 而 P S可被氨肤酶水解 , 因此表明混合物原有的较高放射计数来源于
P S
, 当 P S被破坏 , 放射计数也随之减弱 。
以上给果表明 , H R V s h 以及 P 3 、 P S都能与 ’ 2 ` I标记的免疫球蛋白发生免疫沉淀反应 , 表
现出较强的放射强度 。 因此 , P 3 、 P S是 H R V s h的免疫多肤 ,它们具有 H R V s h的抗原专一性 ,
是 H R V s h抗原决定簇的所在区域 。
五 、 多胶的氮签酸序列分析 用D A BI T C 一 P I T C双偶合法测定的多肤 lP 与 P S的 氛 基
酸顺序与 T M V普通株有较大差异 , 而与 H R V基本相同 ( 见表 4 ) 〔 1。 〕 .
衰 4 H RV hs 外亮蛋白P l 、 P S肚段的板甚 . 序列分析
T a b
. ` C o m P a r i s o n o f p e P t i d e s e q u e n e e o f H R V s h 下 i t h t h a t o f T M V a s
w e l l a s H R V
N一端氮基酸序列 :
N一 t e r川宜n a l a m i n o a e i d
T M V ( V ) A e
H R V A e
H RV s h ( P l ) A e
T M V ( V )
H R V
H R V s h ( P l )
S e q 吐e lt e e .
S e r一 T y r一 Ser 一 I l e 一 T h r一 T h r一P r o 一 S e r 一G I。一P h e一 V a l一P be 一
人 s n
A s 。
一 A , n S e r A s n 一 T y r G l n T y r
一 S e r S e r A s n 一 T y r G l n T y r
L e u一 S e r一 S e r一A la一 T r P一A l a一 A s P一 P r o 一 I l e一 G l u一 L e u一
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A l
a
V
a l 一 一 G l。 一 T h r P r o M e t
P h
e
A l
a
A l
a V a l 一 一 G l u 一
C一端奴基酸序列 .
C一 t e r m i n a l a m i n o a e id s e q u e n e e .
T M V ( V ) 一 S e r一 T y r一 A : n一 A r g一 S e r一 S e r一 P h e一 G l u一 S e r一 S e r一 S e r一G l y一
H RV T y r M e t 一 一 A la G l u 一 一 A l a I l e
H R V s h ( P S ) M e t 一 一 A la G l u 一 一 V a l L e u
T M V ( V ) L e u 一V a l一 T r P一 T h r一 S e r一 G l y一 P r o一 A l a 一 T h r .
H RV L e u P r o 一 一 T h r A la 一 一 一
HR V s h ( P S ) L e u P r o 一 A la T h r A l a 一 一 一
六 、 陇解肚讼比较 从图 3可见 , H R V s h和 H R V外壳蛋白的胰蛋白酶酶解肤 谱 基 本相
似 。 其中主要 区别在于箭头所指处的两个肤点位置不同 . 这一结果也表 明了 H R V s h和 H R V
之间在外壳蛋白氮基酸序列上有很大相似性 。
气
讨 论
长叶车前花叶病毒上海分离株 H R V s h的外壳蛋 白含有 4个甲硫氨酸 , 用澳化银 裂 解 可
得到 5 条多肤片段 。 其中 P l 、 P S分别为外壳蛋白的 N 端及 C端多肤 , P Z 、 P 3 、 P 4业不表示
它们在外壳蛋白中的先后次序 , 只是为示意方便而定 。 实验结果表 明 , 多肤 P 3 与 P S 能 与
HR v
s h的抗体产生免疫沉淀 , 具有结合H R v s h抗体的能力 , 因 此 说 明这 二个肤段 含 有
1期 长叶车前花叶病毒上海分离株 (HR V sh)外壳蛋白免疫多肤的研究 5 1
图 3
F 19
a nd
HR V sh和 HR V外壳蛋白胰蛋白酶酶解肤谱
A
:R HV shB :R HV
3Pe p tid e ma pP i ng of t he t r了 P tie pe P tid e sofR V H shP rote i n
,
H R V p r o t e i n
A 一 H R V s h B
:
H R V
H R V
s h 的抗原决定簇的组成部分 。 T o d d曾提出 , 天然蛋白质抗体与变性的蛋白质或它的多
肤片段的结合都是很微弱的 , 因为只有极少数的肤段能保持其在天然蛋白 质 中 的 原 有 构
型 1[ 1 〕 。 但是 , 也有一些实验报道了分离的肤段在与天然蛋 白抗体的反应上接近 了天然蛋
白的水平 [ 1 2 ~ 1 4 〕 。
可以推测 , H R V s h 的免疫 多肤位于病毒外壳蛋白分 一子空间的表面位置上 , 其中组成抗原
决定簇的氨基酸侧链在序列上可能是远离的 , 但在空间上是十分接近的。
H R V s h与H R V标准株系间存在着免疫交叉反应 , 它们之间之所以有较接近的血清学亲
缘关系 , 很可能在决定这种免疫交叉反应的外壳蛋白亚基的抗原决定簇之间有相似的氨基酸
序列。 外壳蛋白酶解肤谱的比较和多肤的氨基酸序列分析结果都一致证实了这一推测 , H R V
s h外壳蛋白N 端多 肤 P l及 C端多肤 P S与 H R V标准株间仅有 个别氨基酸的差异 。
关于免疫多肤 P 3与 P S的免疫原性 , 即对有反应能力的个体引起免疫反应的能力, 及和抗
厚决宇簇的更深人关系 , 有待进一步研究阐明 ,
5 2 病 毒 学 报 3卷
参 考 文 献
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S T UD IE S O N T HE IMM UNO一 P EP T ID E S O F T HE
C O AT P RO T E IN O F HOL ME S , R IB G RAS S V IRU S ( HRV s h )
Z h u H u i h u i
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S u n Y u k u n Z
I t h a
s b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t h a t t h e r e a r e f o u r m e t h i o n i n e r e s i d u e s i n
t h e e o a t p r o t e i n o f H R V s h
.
I n t h i s p a p e r
, t h e e o a t P r o t e i n w a s d i v i d e d i n t o
f i v e p e p t i d e f r a g m e n t s b y e h e m i e a l e l e a v a g e o f m e t h i o n y l b o n d s w i t h e y a n o -
g e n b r o m i d e
.
E a e h f r a g m e n t w a s s e p a r a t e d a n d p u r i f i e d b y g e l f i l t r a t i o n o n
S e p h a d e x G
一 10 0 , p a p e r e h r o m a t o g r a p h y o r h i g h 一 v o l t a g e p a p e r e l e e t r o p h o r e s i s
.
T w o p e p t i d e s w e r e f o u n d t o p o s s e s s s p e e i f i e i m m u n o l
o g i e a l a e t i v i t y r e l
a t e d
t o t h e
·泞 h o l e p r o t e i n , b e e a u s e t h 已y s h o w e d i m m u n o l o g i e a l r e a e t i o n w i t h t h e
` 2 `
I一 I g G a g a i n s t t h e H R V s h
.
T h i s f a e t i n d i e a t e s t h a t t h e a n t i g e n i e d e t e r m i -
n a n t s i n H R V s h p r o t e i n m a y b e d i s t r i b u t e d i n t h e s e t w o i m m u n o 一 P e p t i d e s
.
P e p t i d e m a p p i n g o f t h e t r y p t i e p e p t i d e s o f H R V s h p r o t e i n a n d a m i n o
a e i d s e q u e n e e a n a ly
s e s o f N 一 t e r m i n a l a n d C
一 t e r m i n a l o f t h e t w o p e p t i d e s r e -
v e a l e d q u i t e s i m i l a r a m i n o a e i d s e q u e n e e b e t w e e n H R V s h a n d H R V
, p a r a l l
e -
l i
n g t h e e l
o s e i m m u n o l
o g i e a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n H R V s h a n d H R V
.
Ke y w o r d s * H o l m e s
` r i b g r a s s v i r u s I m m u n o 一 p e p t i d e A m i n o a e i d
S e q U e n c e
i
。
D e P a r t阴口” t o f B i o l o 夕夕 , F “ d o . U 月 。 `e r : i t夕 , S h a ” 口h a `
2 , S h a : g 石。 ` I o s t` to t e o f B i o e h e , ` S t r夕 , A e a寸e 仍` a 5 1件`c q