全 文 ：收稿日期:2015-02-13; 修订日期:2015-06-08
基金项目:广西自然科学基金创新研究团队项目
(No． 2011GXNSFF018006)
作者简介:周 倩(1990-)，女(汉族)，浙江嘉兴人，广西中医药大学在读
硕士研究生，学士学位，主要从事中药制剂的分析与检验工作．
* 通讯作者简介:滕建北(1972-)，男(汉族)，广西玉林人，广西中医药大
学副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中药民族药品种、品质与
资源开发工作．
正交实验优选鲫鱼胆总黄酮的最佳提取工艺
周 倩，滕建北* ，颜萍花，周 洁
(广西中医药大学，广西 南宁 530001)
摘要:目的 优选鲫鱼胆总黄酮的提取工艺。方法 采用乙醇 －水法从鲫鱼胆中提取总黄酮，利用正交实验优选总黄酮最
佳提取工艺，考察乙醇浓度，提取时间，料液比，提取次数对总黄酮含量的影响。结果 总黄酮最佳提取工艺为 65 倍量
75%乙醇，回流提取 3 次，60 min /次，总黄酮的含量为 17． 06%。结论 醇 －水提取法可用于鲫鱼胆总黄酮的提取，优化的
提取工艺可为鲫鱼胆总黄酮的进一步研究提供基础。
关键词:正交实验; 鲫鱼胆; 总黄酮; 提取工艺
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 09． 024
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)09-2118-02
壮药鲫鱼胆为木犀科植物青藤仔 Jasminum nervosum Lour．的
茎、叶或花［1］。又名青藤仔、侧鱼胆、蟹角胆藤，主产于广西宜
山、河池、都安、巴马、东兰、南丹、南宁、武鸣等地［1］。全株可入
药，味微苦，性凉，具有清湿热、解毒、敛疮的功效，主治痢疾、疟
疾、疮疡肿毒，溃烂不敛［2］。经文献检索发现，其化学成分主要
含有黄酮类，三萜及其苷类成分、挥发油［3］等。现代临床药理作
用研究表明，鲫鱼胆用于治疗菌痢［4］。因此，对鲫鱼胆挥发油以
外成分的深入研究对于揭示鲫鱼胆广泛的药理作用是十分有必
要的。
近年来，黄酮类化合物以其广泛的药理作用备受青睐，该类
化合物能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗菌抗
炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗衰老和增强免疫力等药理作用［5］。
鲫鱼胆为广西民间常用药物之一，有关鲫鱼胆黄酮类成分的研究
报道较少，本文对鲫鱼胆总黄酮提取工艺进行了研究，旨在为鲫
鱼胆的进一步开发奠定基础。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 Agilent UV － 8453 型紫外 －可见分光光度计(美国安
捷伦)，KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，
HH － S6 数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。
1． 2 药材 采自广西，经广西中医药大学药用植物园高级园艺师
朱意麟老师鉴定为木犀科植物青藤仔 Jasminum nervosum Lour．的
茎、叶或花。阴干后粉碎(过 4 号筛)备用。
1． 3 试药 芦丁对照品(批号 100080 － 200707，中国药品生物制
品检定研究院);其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 总黄酮的测定
2． 1． 1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品
17． 7mg，精密称定。置 50ml量瓶中，加乙醇溶解，并定容至刻度，
摇匀，即得质量浓度为 0． 3540mg·ml －1的芦丁对照品溶液。
2． 1． 2 标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品溶液(0． 3540mg
·ml －1)0． 5，1，2，4，8，10ml，分别置 25ml量瓶中，加 5%NaNO2 溶
液 1ml，摇匀，放置 6 min，加 10%Al(NO3)31ml，摇匀，放置 6 min，
加 4%NaOH溶液 4ml，加水定容至刻度，摇匀，放置 15 min，以相
应溶剂为空白，于 507nm波长处测定，记录吸光度。以吸光度为
纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程为 Y =
11． 223X － 0． 001 (r = 0． 9993)，表明芦丁在 7． 08 ～ 141． 6mg·
L －1范围内呈良好线性关系。标准曲线见图 1。
图 1 芦丁标准曲线
2． 1． 3 样品溶液的测定 准确称取 0． 5g 鲫鱼胆粉末，经石油醚
萃取后按正交实验设计表中的要求，加一定浓度乙醇 75ml，提取
一定时间及次数，水浴提取，放冷，过滤，定容，取 1ml 到 25ml 容
量瓶中，按“2． 1． 2”项下测吸光度，计算总黄酮含量。
2． 2 单因素实验
2． 2． 1 提取溶剂的浓度对黄酮提取的影响 在恒定提取时间为
1h，提取次数为 1 次，液料比为 1∶ 75 的条件下，分设 55%、65%、
75%、85%及 100%共 5 个提取浓度进行提取，一式 3 份，计算鲫
鱼胆粉末中总黄酮的含量(见图 2)。随着乙醇浓度的增加，总黄
酮的含量明显降低，当乙醇浓度为 55%时总黄酮的含量最高，可
能是由于 55%乙醇水溶液对总黄酮溶解性能好，对原料的溶胀
系数高的原因，故提取溶剂选为 55%乙醇。
2． 2． 2 料液比对黄酮提取的影响 在恒定提取时间为 1h，提取
次数为 1 次，提取溶剂为 55%乙醇的条件下，分设 40，55，65，75，
85ml共 5 个乙醇用量进行提取，一式 3 份，计算鲫鱼胆粉末中总
黄酮的含量(见图 3)。从图 3 可以看出，乙醇用量为 40ml 的时
候总黄酮含量最高，随着用量的增加，总黄酮的含量有所下降，到
65ml时曲线趋于平缓。故选 40ml为最佳的乙醇用量，料液比为
1∶ 40。
2． 2． 3 提取时间对黄酮提取的影响 在料液比为 1∶ 40，提取次
数为 1 次，提取溶剂为 55%乙醇的条件下，分设 15，30，45，60，90
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min共 5 个提取时间进行提取，一式 3 份，计算鲫鱼胆粉末中黄
酮的含量(见图 4)。从图 4 可以看出，随着提取时间的增加，当
提取时间为 45min的时候鲫鱼胆总黄酮的含量最高，但随着提取
时间的增加，总黄酮的含量明显降低，可能由于长时间加热会造
成总黄酮的损失，故选提取时间为 45min。
2． 2． 4 提取次数对黄酮提取的影响 在恒定提取时间为 45min，
提取溶剂为 55%乙醇，液料比为 1∶ 40 的条件下，分设 1，2，3，4，
5 共 5 个提取次数进行提取，一式 3 份，计算鲫鱼胆粉末中总黄
酮的含量(见图 5)。由图 5 可知，提取 3 次即可将总黄酮提取完
全，故设定提取次数为 3 次。
图 2 提取溶剂的浓度对总黄酮含量的影响
图 3 提取溶剂的用量对总黄酮含量的影响
图 4 提取时间对总黄酮含量的影响
图 5 提取次数对总黄酮含量的影响
2． 3 正交实验 在单因素实验基础上，选取影响总黄酮含量的 4
个因素:乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)
作为考察因素。因素水平安排见表 1。
表 1 实验因素水平
水平
A
乙醇浓度 /%
B
料液比 /g·ml － 1
C
提取时间 /min
D
提取次数 /次
1 55 1:40 30 1
2 65 1:55 45 2
3 75 1:65 60 3
取鲫鱼胆粉末 0． 5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按正交表
L9(3
4)进行表头设计和安排试验，结果见表 2。
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D 总黄酮含量 /mg·g － 1
1 1 1 1 1 82． 07852
2 1 2 2 2 120． 72792
3 1 3 3 3 174． 88974
4 2 1 2 3 137． 95892
5 2 2 3 1 117． 61920
6 2 3 1 2 132． 34743
7 3 1 3 2 130． 99887
8 3 2 1 3 139． 60651
9 3 3 2 1 133． 42602
K1 377． 69619 351． 03632 354． 03247 333． 12375
K2 387． 92555 377． 95364 392． 11287 384． 07422
K3 404． 03141 440． 66319 423． 50781 452． 45517
Ｒ 26． 33522 89． 62687 69． 47534 119． 33143
结果表明，影响程度从强到弱依次是:提取次数、料液比、提
取时间和乙醇浓度，其中提取次数是最为显著的因素。提取的最
优组合是 A1B3C3D3。即:乙醇浓度是 55%，乙醇用量是按料液比
为 1∶ 65，提取次数是回流 3 次，提取时间是 60 min。
2． 4 方差分析 通过 SPSS软件对实验结果进行方差分析，结果
如表 3 ～ 4 所示。
表 3 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 f 均方(MS) F值 显著性 P
乙醇浓度 A 470． 036 2 235． 018 57． 068 ＜ 0． 005
料液比 B 5640． 003 2 2820． 002 684． 763 ＜ 0． 005
提取时间 C 3227． 815 2 1613． 907 391． 895 ＜ 0． 005
提取次数 D 9560． 843 2 4780． 421 1161． 000 ＜ 0． 005
从表 3 的方差分析结果可知，A、B、C、D 四个因素均对实验
结果有显著性影响，即乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数均
能明显的影响鲫鱼胆总黄酮的含量(P ＜ 0． 01)。
表 4 单因素统计量表
乙醇浓度 A 均值(M) 标准误差(SE)
95%置信区间
下限 上限
1 125． 899 ． 586 124． 697 127． 101
2 129． 309 ． 586 128． 107 130． 511
3 134． 677 ． 586 133． 475 135． 879
料液比 B
1 117． 012 ． 586 115． 810 118． 214
2 125． 985 ． 586 124． 783 127． 187
3 146． 888 ． 586 145． 686 148． 090
提取时间 C
1 118． 011 ． 586 116． 809 119． 213
2 130． 704 ． 586 129． 502 131． 906
3 141． 169 ． 586 139． 967 142． 371
提取次数 D
1 111． 041 ． 586 109． 839 112． 243
2 128． 025 ． 586 126． 823 129． 227
3 150． 818 ． 586 149． 616 152． 020
从表 4 的单因素统计量表结果可知，最佳水平组合是
A3B3C3D3。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期
2． 5 验证性实验 为了更准确地选择最优条件，结合正交试验
结果表 2 中测定结果最高的组合 A1B3C3D3 和通过直观分析及
SPSS软件分析的最佳组合 A3B3C3D3。对这两个工艺进行验证
性实验。见表 5。
表 5 验证性实验
编号 提取工艺组合 含量 /mg·g － 1 平均含量 /mg·g － 1
1 171． 21065
A3B3C3D3 171． 10804 170． 63864
169． 59724
151． 93227
2 A1B3C3D3 155． 75229 155． 07113
157． 52884
n = 3
2． 6 提取方法的确定 验证性实验表明，A3B3C3D3 提取效率比
A1B3C3D3 较高，所以选择的最优组合是 A3B3C3D3，即用 75%乙
醇 65ml回流 3 次，每次 60 min。
3 讨论
3． 1 提取方式的选择 鲫鱼胆中黄酮类化合物一般采用极性较
大的溶剂进行提取如甲醇，乙醇等，考虑甲醇具有一定毒性，故选
择乙醇为提取溶媒。又对超声法与回流法进行了比较，结果超声
法总黄酮含量 10． 47%，而回流法为 12． 62%，回流法优于超声
法，因此，采用回流法提取。
3． 2 样品前处理方法的选择［6］ 鲫鱼胆不经脱脂直接提取后，
经 5%亚硝酸钠和 10%的硝酸铝及 4%的氢氧化钠显色时，会产
生红色絮状沉淀，影响吸光度的测定，致使测定的鲫鱼胆总黄酮
含量产生误差，而将鲫鱼胆以石油醚脱脂后，再以乙醇提取，显色
时无沉淀产生，推测测定为鲫鱼胆中挥发油所致，因此，测定鲫鱼
胆总黄酮时首先对样品进行了脱脂处理。
参考文献:
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草，第六卷［M］．上
海:上海科学技术出版社，1999:174．
［2］ 广西壮族自治区革命委员会卫生局．广西本草选编，上册［M］． 南
宁:广西人民出版社，1974:828．
［3］ 霍丽妮，李培源．青藤仔叶和茎挥发油化学成分研究［J］．时珍国医
国药，2011，22(11):2616．
［4］ 安定县人民医院．青藤仔治疗菌痢［J］．海南医学，1977，(1) :56．
［5］ 黄爱玲． 黄酮类化合物药理作用研究进展［J］． 安徽农学通报，
2007，13(10):71．
［6］ 李英霞，韩 丽．正交实验法优选香附总黄酮的提取工艺［J］．时珍
国医国药，2010，21(11):2883．
收稿日期:2015-01-10; 修订日期:2015-05-12
基金项目:河南中医学院博士科研基金项目(No． BSJJ2010 － 32)
作者简介:王娜梅(1981-)，女(汉族)，河南洛阳人，河南中医学院第三临
床医学院讲师、主治医师，博士学位，主要从事中西医结合治疗多囊卵巢
综合征、不孕症的研究工作．
* 通讯作者简介:马春芬(1953-)，女(汉族)，河南巩义人，河南省中医院
教授、主任医师，硕士研究生导师，学士学位，主要从事中医药治疗不孕不
育症、多囊卵巢综合征的研究工作．
补肾化痰方对多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗的影响
王娜梅1，贺亚蕾2，李佳浍3，崔 琳4，马春芬5* ，王慧霞1
(1．河南中医学院第三临床医学院，河南 郑州 450008; 2．郑州市中医院，河南 郑州 450007;
3．郑州市第七人民医院，河南 郑州 450006;
4．河南中医学院第一附属医院中心实验室，河南 郑州 450000;
5．河南省中医院，河南 郑州 450002)
摘要:目的 探讨补肾化痰方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠胰岛素抵抗的影响。方法 采用皮下注射脱氢表雄酮
(DHEA)造模法建立 PCOS大鼠模型，将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、二甲双胍组、中药(补肾化痰方)低剂量
组、中药(补肾化痰方)高剂量组，给予相应药物连续灌胃 28 天。行阴道涂片、HE染色观察动情周期;用酶联免疫吸附测
定法(ELISA)检测血清胰岛素(INS)水平;用电子精密天平测量脂肪湿重;用血糖仪测定大鼠血糖水平，计算葡萄糖曲线
下面积(AUC)、胰岛素抵抗指数(HOMA － IＲ)及胰岛素敏感指数(ISI)。结果 与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖、空腹
胰岛素、葡萄糖曲线下面积升高，HOMA指数增高，ISI降低，无规律的动情周期，无排卵，体内脂肪增加。二甲双胍和补肾
化痰方两个剂量组可不同程度的改变 PCOS大鼠上述病理改变，补肾化痰方用药剂量较高效果较好。结论 补肾化痰方
可改善多囊卵巢综合征大鼠高胰岛素血症、胰岛素抵抗状态，降低体脂水平，恢复大鼠动情周期及排卵。
关键词:脱氢表雄酮;多囊卵巢综合征;补肾化痰方;胰岛素抵抗
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 09． 025
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)09-2120-03
多囊卵巢综合征(PCOS)是生殖功能障碍与糖代谢异常并存
的一种特殊疾病，严重影响妇女生殖健康和生活质量。PCOS 患
者的生殖功能障碍主要表现为卵巢排卵功能障碍和雄激素分泌
过多，PCOS患者的代谢异常主要表现为胰岛素抵抗(IＲ)和高胰
岛素血症［1］。高胰岛素血症、IＲ 会加重 PCOS 的各种病理生理
改变并诱导 PCOS远期并发症的出现。改善 PCOS患者的胰岛素
抵抗可以有效地缓解症状，并可预防 PCOS 的远期并发症的发
生。中医古籍没有多囊卵巢综合征的病名，根据其临床表现属中
医“月经后期”“闭经”“不孕”“崩漏”“症瘕”等范畴。现代医家
运用中药复方治疗 PCOS 取得较好的疗效。补肾化痰方是马春
芬教授治疗 PCOS经验方，本研究通过制作 PCOS大鼠模型，探讨
补肾化痰方对模型大鼠胰岛素抵抗的治疗作用。结果报道如下。
1 材料
1． 1 动物 选用 23 日龄雌性 SD 清洁级大鼠 95 只，体重 50 g ±
20 g，由河南省动物实验中心提供。采用 IVC 笼养，喂食标准饲
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9