全 文 ：气相色谱-质谱联用
对香荚兰豆中香兰素的分析
何秀芬 王明月
(中国热带农业科学院测试中心 海南儋州 571737)
摘要 采用气质联用仪和高效液相色谱仪测定香荚兰豆样品中香兰素的含量 , 对两种方法及检
测结果进行比较和相关性判定。
关键词 气相色谱-质谱 高效液相色谱 香兰素
香荚兰豆是兰科(orchidaceae)香荚兰
种(vani lla plani folia andrews)[ 1]的果实。
香荚兰豆经发酵生香工艺处理后 ,具有特殊
香味 ,可直接添加于食品中 ,也可以用作进
一步提取高级食用香料的材料[ 2] ,其中所
含的香兰素(又名香草醛 ,化学名称为 3-
甲氧基-4-羟基苯甲醛)是名贵的香料之
一。本文同时采用高效液相法(按国际标准
ISO 5565-2:1999中 4.2高效液相法测定
香兰素)和气质联用法(GC/MS)对香荚兰
豆中的香兰素作了定量分析 ,并比较了两种
方法的测量结果和方法间的优劣。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品及来源 香荚兰由中国热带农
业科学院香料饮料研究所提供 。
1.1.2 主要仪器 高效液相色谱系统由美
国Waters公司生产的 510 泵 、UV490E 紫
外-可见检测器 、727自动进样器 、大连物
化所 95WL 色谱工作站组成;C18色谱柱为
Waters公司 C18柱(150×4.6 mm ,5 um)。
气相色谱-质谱由美国 Thermo Quest
集团生产的 TRACE MS 和 TRACE GC
2000 组成;色谱柱为 DB-1(30 m ×0.25
mm×0.25 μm)。
1.2 方法
1.2.1样品处理 除注明外本实验所用试
剂均为分析纯 ,水为超纯水 , 称量及定容器
具都按需要级别进行了校准。香兰素标准
(上海试剂厂)贮备液的配制:称取预先在干
燥器中放置 48 h 以上的香兰素 ,用 95 %的
乙醇配制成 0.2 g/L(称量精确至 0.0001
g)左右的溶液。试样加工:抽取具代表性的
香荚兰豆样品 ,切段并研磨成粉状(最大颗
粒小于 1 mm)充分混匀 。对样品的提取处
理采用了两种方法 ,第一种按国际标准 ISO
5565-2:1999 , 4.2中高效液相法测定香兰
素的样品处理;第二种为自定方法。
第一法(A 法):称取 20±2 g 已制备好
的样品(称量精确至 0.01 g),放入预先准备
好的索氏抽提器中 ,用大约 200 mL95 %的
乙醇抽提试样 16 h(溶剂循环 25 ～ 30次),
将提取液移入 200 mL 容量瓶中加标定容。
第 8 卷 第 4 期 华 南 热 带 农 业 大 学 学 报 2002年 12 月
Vol.8 No.4 JOURNAL OF SOUTH CHINA UNIVERSIT Y OF TROPICAL AGRICULT URE Dec.2002
第二法(B法):称取 1±0.1 g 已制备
好的样品(称量精确至 0.001 g),放入预先
准备好的 50 mL 具塞三角瓶中 , 加入 20
mL 95 %的乙醇浸泡 2 h ,然后放入超声波
发生器中超声振荡 15 min ,滤出清液;残渣
再加入约 15 mL 95 %乙醇超声振荡 10
min ,滤出清液 ,重复一次 ,用少量 95 %乙
醇淋洗残渣 。合并提取的清液定容于 50
mL 容量瓶中 。
1.2.2 高效液相色谱仪的参数设置及操作
程序 检测器波长254 nm ,泵流量 1 mL/min ,
进样量 10 ul ,色谱柱工作温度为室温。流
动相以 25 份体积的甲醇(色谱纯)和 75份
体积的 0.01 mol/L 稀磷酸水溶液混合 ,用
0.45 um 膜过滤并脱气 。
进样前将香兰素标准储备液 、A 法制取
的样液用流动相稀释 10 倍 , B 法制取的样
液稀释 5倍 ,用 0.45 um 膜过滤。
1.2.3 气相色谱-质谱联用仪主要参数设
置及操作程序 色谱参数:载气为高纯 He ,
流量1.5 mL/min;分流/不分流进样口 ,温度
250 ℃;初始炉温 100 ℃保留 1 min ,以 2 ℃/
min升至130 ℃保留 3 min ,再以 30 ℃/min升
至 250 ℃保留 1 min。质谱参数:EI+源 ,源温
200 ℃,电子能量 70 eV;接口温度 250 ℃;
检测电压 350 V;其他参数以仪器正常工作
后的仪器所带内标校正为准。
进样前将香兰素标准储备液 、第一法制
取的样液用无水乙醇稀释 25 倍 ,第二法制
取的样液稀释 2.5倍 ,稀释前加入预先用无
水乙醇配制好的内标液(加入内标物的量应
使其响应值与被测目标相近 ,)用 0.45 um
膜过滤 。
2 结果与讨论
2.1 检测数据及计算结果
液相色谱法检测数据及计算见表 1;液
相色谱法回收率检测数据和计算见表 2;香
兰素 GC/MS 测定标准曲线见表 3;气质联
用法检测数据和计算见表 4;气质联用和高
效液相法对 A法 、B 法的统计比较计算及结
果见表 5和表 6。
表 1 液相色谱法检测数据和计算
方法及重复 取样量(g) 定容体积(mL) 稀释倍数 K 峰响应面积值 R 香兰素含量(g/ 100g)
A1 20.58 200.0 10 55 095 2.189
A2 20.96 200.0 10 54 508 2.126
A3 20.45 200.0 10 54 162 2.165
A4 20.32 200.0 10 52 162 2.099
平均值 2.145
B1 1.051 50.00 2 56 476 2.197
B2 1.102 50.00 2 57 645 2.138
B3 1.064 50.00 2 55 415 2.129
B4 1.150 50.00 2 58 624 2.084
平均值 2.137
注:香兰素标样浓度为 0.2046 mg/ mL , 三次进样的峰响应面积平均值为 50 048。 A 法数据的标准偏差为
SA=0.040 , 变异系数 CV%=1.9;B 法数据的标准偏差为 SB=0.036 ,变异系数 CV%=1.7。
22 华 南 热 带 农 业 大 学 学 报 第 8卷
表 2 液相色谱法回收率检测数据和计算
方法 取样量(g)
标准加入
量(mg)
定容体积
(mL)
稀释倍数
K
峰响应面
积值 R
香兰素测
得值(mg)
样品香兰素
含量(mg)
回收率
(%)
A1 10.58 233.5 200.0 10 55 869 456.8 226.4 98.7
A1 11.02 200.4 200.0 10 53 762 439.6 235.8 101.7
B2 0.5006 10.23 50.00 2 51 498 21.1 10.7 101.1
B2 0.5124 10.23 50.00 2 52 201 21.3 11.0 101.4
注:香兰素标样浓度为 0.2046 mg/ mL , 三次进样的峰响应面积平均值为 50 048。
表 3 香兰素 GC/MS测定标准曲线
香兰素标液浓度 C(mg/ mL) 香兰素峰高响应值(h1) 内标物峰高响应值(h2) h1/ h2
0.0489 63 451 61 258 1.0358
0.0978 120 833 60 315 2.0034
0.1956 264 426 61 793 4.2792
注:回归方程为 C=0.0448x+0.0047;相关系数 r=0.9985。 x 为 h1/h2。
表 4 气质联用法检测数据和计算
方法 取样量(g)
定容体积
(ml)
稀释倍数
K
目标物峰高
(h1)
内标物峰高
(h2) h1/ h2
香兰素含量
(g/ 100g)
A1 20.58 200.0 20 138 792 61 258 2.2657 2.066
A2 20.96 200.0 20 141 354 60 315 2.3436 2.095
A3 20.45 200.0 20 137 915 59 026 2.3365 2.141
A4 20.32 200.0 20 137 038 59 125 2.3178 2.138
平均值 2.110
B1 1.051 50.00 5 113 407 60 452 1.8760 2.112
B2 1.102 50.00 5 118 910 60 994 1.9495 2.089
B3 1.064 50.00 5 114 810 60 987 1.8825 2.093
B4 1.150 50.00 5 126 168 60 786 2.0756 2.125
平均值 2.105
注:香兰素含量由表 3 回归方程算出。 A法数据的标准偏差为 SA=0.036 ,变异系数 CV%=1.7;B 法数据
的标准偏差为 SB=0.017 , 变异系数 CV%=0.78。
23第 4期 何秀芬 等: 气相色谱-质谱联用对香荚兰豆中香兰素的分析
表 5 气质联用和高效液相法对 A法 、B法处理的测定值的统计
组别 1 2 3 4
2.066 2.112 2.189 2.197
2.095 2.089 2.126 2.138
2.141 2.093 2.165 2.129
2.138 2.125 2.099 2.084
Xi 8.440 8.419 8.579 8.548
ni 4 4 4 4
平均值 2.110 2.105 2.145 2.137
表 6 气质联用和高效液相法对 A法 、B法处理的测定值的统计判定
步骤[ 5] 计算
a.选择检验的显著性水平α 设α=0.01
b.从 Link-Wallance检验表中查 L的临界值 L0.01=1.33
(n=4 , t=4)
c.计算 n 次测试值的极差, W1 ,W2 , W3 ,W4 W1=0.075 ,W2=0.036 , W3=0.090 ,W4=0.113
d.计算极差和 , Y Y=W1+W2+W3+W4=0.113+0.075+0.036+0.090=0.314
e.计算平均值之间的极差 V V=2.145-2.105=0.04
f.计算 L=nV/ Y L=4×0.04/ 0.314=0.51
g.如果 L>La,则断定 t个测定的平均值是不同 L=0.51
2.2 讨论
从表 1表 4测得数据的标准偏差和变
异系数可看出两方法都具有较好的精密度 ,
符合定量测定的要求 。
从表 2可看出方法具有较好的回收率。
从表 3 可看出 ,GC/MS 法在测定值范
围内有较好的线性关系。
从表 6 可看出对处理 1 和处理 2 的
GC/MS 和 HPLC 两种方法的测定结果在
给定水平内均无差异 。
3 结论
对香兰豆中香兰素的测定两种处理均
合理可靠 ,但处理 2更为省时省试剂。
GC/MS 和 HPLC 两种方法的比较表
明均合理可靠;但 GC/MS法可为其它更多
的成份提供定性(另文发表)或定量结果 ,也
为气相色谱法提供了一定的参考依据。
参 考 文 献
1 焦启源.芳香植物及其利用(上).上海:科学
技术出版社 , 1963.19
2 中国香料香精化妆品工业协会编.中国香料香
精发展史.北京:中国标准出版社 , 2001.306～
309
3 彭黎旭 ,等.气相色谱法快速分析香荚兰豆中香
兰素.中国青年农业科学学术年报 , 1997.803 ～
806
4 ISO 5565-2:1999 Vanilla the international o r-
ganization For standardization.5 ～ 9
5 蒋子刚.分析检验的质量保证和计量认证.华
东理工大学出版社 , 1998.50 , 127 ～ 140 , 641
24 华 南 热 带 农 业 大 学 学 报 第 8卷