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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):73-80
肌动蛋白（Actin）是一种普遍存在于真核生物
细胞中的结构蛋白质，是构成细胞骨架中微丝的主
要组分。它是单一多肽链的球状蛋白，由 375-377
个氨基酸组成［1］。由于 actin 蛋白是组成型表达，在
细胞中能稳定表达，常作为半定量 RT-PCR 以及实
时荧光定量 PCR 分析基因表达水平的经典内参基
收稿日期 ：2016-02-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30760126），公益性行业（农业）科研专项（200903022）
作者简介 ：龚明霞，女，博士研究生，研究方向 ：植物生理与分子生物学 ；E-mail ：ff9903@126.com
通讯作者 ：何龙飞，男，博士，研究方向 ：植物生长发育与逆境 ；E-mail ：lfhe@gxu.edu.cn
山药 Actin 基因片段的克隆及表达分析
龚明霞1，2，3  周芸伊1  王爱勤1  罗海玲1，2  何龙飞1
（1. 广西大学农学院，南宁 530004 ；2. 广西农科院作物遗传改良生物技术重点实验室，南宁 530007 ；
3. 广西农科院蔬菜研究所，南宁 530007 ）
摘 要： 通过山药 Actin基因的克隆和表达分析，为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。
根据 GenBank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因（Actin）的保守序列设计一对简并引物，采用 RT-PCR技术从山药块茎中分离
出 1个 Actin基因 cDNA片段，命名为 DoActin。片段长度为 1 091 bp，编码 357个氨基酸，并提交 GenBank（登录号：KU669295）。
与 NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对，该序列与其他植物 Actin基因核苷酸序列的同源性均在 83%以上，氨基酸序列的同源性均
在 97%以上。进化分析结果显示，DoActin与海枣 Actin-2、木本棉 Actin-7的亲缘关系最近。实时定量 PCR结果显示，DoActin在
山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定，表明其适宜作为山药的内参基因。
关键词 ： 山药；Actin基因；克隆；表达分析；序列分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.011
Cloning and Expression Analysis of Actin Gene Fragment from
Dioscorea opposite
GONG Ming-xia1，2，3 ZHOU Yun-yi1 WANG Ai-qin1 LUO Hai-ling1，2，3 HE Long-fei1
（1. College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530004 ；2. Guangxi Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and biotechnology，
Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 ；3. Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，
Nanning 530007）
Abstract: The cloning and expression analysis of Actin gene fragment from Dioscorea opposite was studied in order to provide the
foundation for studying its function and other genes expression and regulation in yam growth and development. A pair of degenerate primers
were designed based on the conserved sequences of the published Actin genes of other plants in GenBank. The cDNA fragment of 1 Actin gene
was isolated from yam tuber by RT-PCR and designated as DoActin. It’s length was 1 091 bp encoding a protein with 357 amino acids residues，
and was deposited in GenBank（Accession number ：KU669295）. Homologous alignment according to the nucleotide and protein databases
showed that it shared over 83% nucleotide sequence similarity and over 97% amino acid sequence similarity with Actins in other plants. The
phylogenetic tree reconstructed on the base of amino acid sequences suggested that the DoActin had the nearest relationship with Phoenix
dactylifera Actin-2 and Gossypium arboreum Actin-7. RT-PCR results revealed that the expression levels of DoActin in different organs such
as leaf，aboveground stem and underground tuber，as well as tubers and leaves in different developmental periods were relatively stable，
indicating that DoActin can be used as an appropriate reference gene for D. opposite.
Key words: Dioscorea opposite ；Actin gene ；cloning ；expression analysis ；sequence analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.774
因［2-4］。 至 今， 已 相 继 从 拟 南 芥［5］、 水 稻［6］、 玉
米［7］、 长 穗 偃 麦 草［8］、 木 薯［9］、 百 合［10］、 陆 地
棉［11］、海州香薷［12］及香樟［13］等高等植物中克隆
出 Actin 基因。这些基因在真核细胞进化过程中高度
保守，氨基酸序列同源性高达 70%-100%。
山药为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dios-
corea）草本植物，是一种药食兼用的重要块茎类经济
作物［14］。薯蓣全球共有 600 多个种，其中山药品种
（D. opposita）为全球最重要的 6 大可食用的薯蓣品
种之一［15］，在亚洲国家被广泛种植［16］，也已成为
我国山药的主栽品种之一。我国山药种植面积已由
2008 年的 20 万 hm2 左右发展到 2013 年的近 47 万
hm2［17］。因此，山药的产量和品质不仅关系到山药
产业的生产效益问题，而且关系到国家的粮食安全
问题。为促进山药产业的发展，近 10 年来，科技工
作者加强了山药栽培技术［18-20］、新品种选育［21-23］、
深加工［24］等方面的研究，而在山药块茎生长发育、
产量形成调控机理等方面的基础研究很薄弱。基因
表达量差异的研究，需要一个恒定表达的内参基因
作为标准来衡量。目前，已有报道借用其他物种的
Actin 作为内参基因［25-27］，在 GenBank 中仅有盾叶
薯蓣（俗称黄姜，D. zingiberensis）的 1 个 Actin 蛋白
质和 mRNA 片段的记录，并被作为内参基因在紫山
药上进行应用［28］，而尚未见有关山药（D. opposita）
的 Actin 基因克隆和应用研究的报道。因此，获取山
药中 Actin 基因，分析测定其表达稳定性，以确定其
是否能够作为山药植物内参基因使用，对今后山药
重要调控和功能基因表达的研究具有重要意义。本
研究采用 RT-PCR 法进行山药 actin 基因克隆，并进
行序列比对分析，同时结合实时荧光定量 PCR（RT-
qPCR）技术研究其在山药叶片、地上茎、地下块茎
以及不同发育时期的块茎和叶片中的稳定性，旨在
为山药优良内参基因的确定、山药生长发育中肌动
蛋白的作用等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 以广西农科院经济作物研究所选
育的山药品种“桂淮 5 号”为供试材料，分别取块
茎膨大期的叶片、地上茎、地下块茎以及不同发育
时期的块茎，经液 N2 速冻后放入 -80℃冰箱中保存
备用。
1.1.2 主要试剂与仪器 DL2000 DNA Marker、Taq
DNA 聚合酶、dNTP、大肠杆菌 JM109 菌株、克隆
载 体 pMDTM19-T、RNA 提 取 试 剂 盒、 反 转 录 试 剂
盒、胶回收试剂盒等均购自 TaKaRa 公司，氨苄青
霉素（Amp）、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-
氯-3-吲哚 -β-D-吡喃半乳糖苷（X-Gal）购自上海生
工。RT-qPCR 反应试剂为 iTaq Universal SYBR Green
Supermix、0.2 mL 低位白色 8 联管以及光学级 8 联
管平顶盖等购自美国伯乐（Bio-Rad）公司。荧光定
量 PCR 仪为美国伯乐公司生产的 CFX-96 实时荧光
定量系统。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计及合成 通过比对 GenBank 中已
公布的其他植物 Actin 基因 cDNA 序列，根据保守区
域利用 Primer5.0 软件设计一对简并引物，上游引物
DoAct-R ：5-TGAYAATGGDACWGGNATGG-3，下游
引物 DoAct-F ：5-CACTTCCKGTGVACAATGG-3（其
中 ：Y=C/T，D=A/T/G，W=A/T，N=A/C/G/T，K=G/
T，V=G/C/A），预测所得片段长度约为 1 100 bp ；根
据 DoActin 基因核苷酸序列的特异区域设计一对实时
荧光定量 PCR 引物 DoAct-RTR ：5-GAGCAAGGAA-
ATCACAGCAC-3 和 DoAct-RTF ：5-TCAGGGAAG-
CCAAGATAGAG-3，扩增片段 138 bp。引物合成和
基因测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。
1.2.2 山药总 RNA 的提取 根据 TaKaRa 的 MiniBE-
ST 多 糖 多 酚 植 物 组 织 总 RNA 抽 提 试 剂 盒 说 明
书，分别提取山药叶片、地上茎、地下块茎中的总
RNA。用 IMPLEN 超微量紫外分光光度计测定 OD260
和 OD280 值及 RNA 浓度，用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA 的完整性。
1.2.3 RT-PCR 扩 增 根 据 PrimeScriptTM Ⅱ 第 一 链
cDNA 合成试剂盒操作说明书，取 1 μg RNA 反转录
合成第一链 cDNA，作为 PCR 扩增山药 Actin 基因片
段的模板。PCR 扩增反应体系为 25 μL，具体如下 ：
cDNA 2.0 μL，10× PCR Buffer（含 20 mmol/L Mg2+）
2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L Primer-R
1 μL，10 μmol/L Primer-F 1 μL，Taq DNA 聚合酶（5
2016,32(7) 75龚明霞等：山药 Actin基因片段的克隆及表达分析
U/μL）0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。 反 应 条 件 为 ：94℃
预 变 性 5 min ；94℃ 变 性 30 s，45-48℃ 退 火 45 s，
72℃延伸 1 min，35 个循环 ；72℃延伸 10 min，4℃
下低温放置。2% 琼脂糖凝胶检测 PCR 扩增产物。
1.2.4 PCR 扩 增 产 物 回 收 检 测 扩 增 产 物 与 预
期 大 小 相 符 后， 另 做 8 管 20 μL 体 系， 合 并， 在
1.5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳， 利 用 TaKaRa 的
MiniBESTVer.4.0 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，回
收目的条带。用 IMPLEN 超微量紫外分光光度计测
定 OD260 和 OD280 值及回收产物的浓度。
1.2.5 PCR 扩增产物的连接及转化 参照克隆载体
pMDTM19-T 克隆试剂盒说明书，根据测得的回收产
物的浓度确定产物 DNA 加入的量，将回收目的条
带连接于克隆载体 pMDTM19-T 上，并转化大肠杆菌
JM109 感受态细胞，在含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB
固体培养基上筛选培养，挑选白色菌落扩大培养，
采用目的条带引物检测菌液 PCR，送阳性克隆测序。
1.2.6 Actin 基因的序列分析 应用 NCBI 的 ORF 程
序对所得的序列查找开放阅读框，并推导出其氨基
酸序列。使用 NCBI 中的 Blast 对所得基因的核苷酸
序列与氨基酸序列进行比对，根据结果选取各种植
物的 Actin 氨基酸序列，采用 DNAMAN 软件比对多
序列，采用 MEGA5.1 软件构建多序列进化树。
1.2.7 DoActin 基因的定量表达分析 （1）反应体系
的优化 ：采用 SYBR Green 染料法，在 Bio-Rad CFX-
96 荧光定量 PCR 仪上进行扩增和数据分析。分别对
荧光定量引物的退火温度、引物浓度、循环条件（2
步法和 3 步法）进行优化，确定最佳扩增体系和条件。
优化后的 RT-qPCR 反应体系为 ：Mix 10 μL，DoAct-
RTR 1 μL，DoAct-RTF 1 μL，cDNA（ 稀 释 3 倍 ）2
μL，ddH2O 6 μL。扩增条件为：95℃ 3 min，95℃ 5 s，
60℃ 30 s，循环数 39 个。（2）熔解曲线分析和标准
曲线的建立 ：首先采用普通 PCR，产物用 1% 琼脂
糖凝胶电泳检测，再对 RT-qPCR 产物熔解峰进行分
析，以确定得到的产物是否为目的产物。以其中一
份阳性样品 cDNA 进行 5 倍梯度稀释作为模板，采
用优化好的条件进行 RT-qPCR，建立标准曲线。（3）
提取山药膨大期的叶片、地上茎、地下块茎以及不
同发育时期块茎和叶片中的总 RNA，用吸光值法测
定不同组织的 RNA 量。不同组织取 1 μg RNA 进行
逆转录，然后进行 RT-qPCR 分析。根据各个样品的
平均 CT 值，利用 Excel 2010 作图。
2 结果
2.1 总RNA的提取及检测
以山药块茎为材料提取总 RNA，经 1.5% 琼脂
糖凝胶电泳检测，结果显示 28S rRNA、18S rRNA 条
带整齐清晰，且 28S rRNA 的亮度约为 18S rRNA 的
2 倍（图 1），表明获得的总 RNA 较完整。
28S
18S
图 1 山药块茎总 RNA 电泳图
经 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 和 分 析，RNA 样 品
OD260/OD280 的平均值为 1.95，OD260/OD230 的平均值
为 2.06，浓度为 580-810 ng/μL，表明所提取的总
RNA 样品基本没有酚类、蛋白质及其他小分子物质
的污染，纯度较高，可用于反转录反应。
2.2 RT-PCR扩增
以 第 一 链 cDNA 为 模 板， 用 引 物 Primer-F 和
Primer-R 在不同退火温度下进行 PCR 扩增，获得
一条约为 1 100 bp 的条带，与预期的目的片段大小
相似（图 2）。根据相同量的 PCR 产物的亮度可知，
在 47℃下产物条带最亮，说明引物对 Primer-F 和
Primer-R 适宜的退火温度为 47℃。
2.3 PCR产物回收
将目的条带进行凝胶回收，紫外分光光度计测
得的回收产物 OD260/OD280 为 1.8，OD260/OD230 为 2.0，
浓度为 177 ng/μL，说明回收的 DNA 产物纯度高，
无蛋白质和盐分的污染。
2.4 回收产物的克隆
以 pMDTM19-T Vector 为载体，吸取适量的回收
产物 DNA 进行 TA 连接，转化大肠杆菌 JM109。在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.776
选择培养基（含 Amp、X-Gal、IPTG）上挑取 10 个
白色菌落，菌落 PCR 鉴定重组质粒，结果（图 3）
表明，10 个克隆中有 7 个为阳性克隆。
与番荔枝（Annonacherimola，AFD62269.1）及木本
棉（Gossypiumarboreum，KHG20985.1）的相似性达
99%。将山药 Actin 蛋白与 NCBI 数据库中筛选出的
22 种植物的 Actin 蛋白，采用 DNAMAN 进行了多序
列比较分析，结果发现有 339 个氨基酸处于保守区
域，而仅有 38 个氨基酸不保守（图 4），即不同植
物的 Actin 蛋白氨基酸序列只有在少数位置有突变
发生，说明了植物肌动蛋白基因高度保守。
2.6 山药Actin蛋白系统进化树的构建
从 NCBI 下 载 与 山 药 肌 动 蛋 白 同 源 性 较 高 的
不 同 类 型 的 22 个 Actin 蛋 白 氨 基 酸 序 列， 采 用
MEGA5.1 软 件， 以 邻 位 相 连 法（neighbor-joining，
NJ）构建进化树，各参数的设置采用默认值。结果（图
5）显示，22 个植物 Actin 蛋白被分进了两个亚群即
Class Ⅰ、Class Ⅱ中。山药肌动蛋白分布在 Class Ⅰ中，
与 海 枣（Phoenix dactylifera，XP_008809027.1）Act-
in-2、木本棉（Gossypiumarboreum，KHG20985.1）Ac-
tin-7 的亲缘关系最近，说明这 3 种植物 Actin 基因之
间的进化可能只是在少数核苷酸位点上产生突变。
2.7 DoActin基因定量分析
2.7.1 定量引物的分析 利用 DoAct-RTR 和 DoAct-
RTF 引物进行普通 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果
显示扩增产物长度与预期长度一致，无引物二聚体
和非特异条带。对荧光定量 RT-PCR 产物进行熔解
峰分析（图 6），DoActin 片段在 Tm=80-80.5℃处显
示特异性单峰，进一步说明扩增产物无引物二聚体
及非特异性扩增，证实引物设计的合理性和特异性。
2.7.2 标准曲线的建立 以其中一份阳性 cDNA 样
品进行 5 倍梯度稀释，以优化好的条件进行荧光定
量 RT-PCR 扩增。得到的扩增曲线（图 7）和标准曲
线（图 8），结果显示，以 Cq 值为纵坐标（Y），以
稀释倍数的对数为横坐标（X）建立的相对定量标
准曲线，在所使用的浓度范围内具有良好的线性关
系（R2=0.996），扩增效率为 99.3%。
2.7.3 DoActin 基因在山药不同器官及不同发育时
期块茎和叶片中的表达分析 RT-qPCR 分析结果
显示，DoActin 基因在山药块茎膨大中期的地下块
茎、地上嫩茎、叶片中的平均 CT 值无显著差异（图
9-A），不具有组织表达特异性 ；DoActin 基因在山
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4
M ：2000 bp DNA Marker ；1 ：45℃ ；2 ：46℃ ；3 ：47℃ ；4 ：48℃
图 2 不同退火温度下的 PCR 产物
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M ：2000 bp DNA Marker ；1-5，9，10 ：阳性克隆 PCR 扩增结果 ；
6-8 ：阴性克隆 PCR 扩增结果
图 3 菌落 PCR 阳性克隆检测
2.5 测序结果与序列分析
送其中 5 个阳性克隆进行测序，其测序结果
完 全 一 致， 得 到 1 091 bp 片 段， 编 码 358 个 氨 基
酸。将核苷酸序列在 NCBI 网站上进行 Blastn 比对
分析。结果表明，山药和油棕等其他 100 多种植物
Actin 核苷酸序列的相似性均在 83% 以上，其中与海
枣（Phoenix dactylifera，LOC103720863）Actin-2 的
同源性达 86%。由此推断，本研究所获得的基因片
段应该为山药肌动蛋白 Actin 基因片段，将其命名为
DoActin，提交 GenBank，登录号为 KU669295。
将山药 DoActin 推导的氨基酸序列在 NCBI 网站
上进行 Blastp 比对分析，结果表明，山药与其他植
物的 Actin 蛋白相似性都较高，为 97%-99%，其中
2016,32(7) 77龚明霞等：山药 Actin基因片段的克隆及表达分析ཷᔲ᷌Actin-1ӁᵹActin-1ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-1㣂᷌Actin-4⮚㦄᷍Actin-2ኡ㣽ᆀActin-7ኡ㣽ᆀActin-11Ӫ৲Actin-1зᒤ䶂Actin-7⭌⁡ṳActin-1ኡ㦟ActinਟਟṁActin-3ᵘᵜ㌆Actin-7䟾㥹㧃Actin-1ਟਟṁActin-11⎧ᷓActin-3⎧ᷓActin-1⎧ᷓActin-2ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-7ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-3օ㣡Actin-3⋩ἅActin-3
Consensusཷᔲ᷌Actin-1ӁᵹActin-1ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-1㣂᷌Actin-4⮚㦄᷍Actin-2ኡ㣽ᆀActin-7ኡ㣽ᆀActin-11Ӫ৲Actin-1зᒤ䶂Actin-7⭌⁡ṳActin-1ኡ㦟ActinਟਟṁActin-3ᵘᵜ㌆Actin-7䟾㥹㧃Actin-1ਟਟṁActin-11⎧ᷓActin-3⎧ᷓActin-1⎧ᷓActin-2ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-7ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-3օ㣡Actin-3⋩ἅActin-3
Consensusཷᔲ᷌Actin-1ӁᵹActin-1ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-1㣂᷌Actin-4⮚㦄᷍Actin-2ኡ㣽ᆀActin-7ኡ㣽ᆀActin-11Ӫ৲Actin-1зᒤ䶂Actin-7⭌⁡ṳActin-1ኡ㦟ActinਟਟṁActin-3ᵘᵜ㌆Actin-7䟾㥹㧃Actin-1ਟਟṁActin-11⎧ᷓActin-3⎧ᷓActin-1⎧ᷓActin-2ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-7ሿ᷌䟾㣝㭹 Actin-3օ㣡Actin-3⋩ἅActin-3
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Consensus
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
00 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
00 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
00 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
图 4 山药 DoActin 基因编码的氨基酸序列与其他作物 Actin 氨基酸序列的比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.778
药地下块茎形成期、膨大前期、膨大中期、膨大后
期，以及成熟期的各个块茎样品中的平均 CT 值间也
无显著差异，且在这些时期的各个叶片样品中的平
均 CT 值之间也无显著差异（图 9-B），说明 DoActin
基因在不同的发育时期的块茎和叶片中表达量基本
一致。因此，DoActin 应该为组成型表达的肌动蛋白
基因。
ADW83713.1|actin-1 Musa acuminataሿ᷌䟾㣝㭹
XP_009416898.1|actin-3 Musa acuminataሿ᷌䟾㣝㭹
XP_009413409.1|actin-7 Musa acuminataሿ᷌䟾㣝㭹
XP_010937719.1|actin-3 Elaeis guineensis⋩ἅ
XP_008788057.1| actin-3 Phoenix dactylifera⎧ᷓ
ABR45727.1|actin-1 Actinidia deliciosaཷᔲ᷌
AIC33035.1|actin-1 Panax ginsengӪ৲
AIZ68150.1|Actin-7 Ornithogalum caudatumзᒤ䶂
AGZ90151.1|actin-7 Litsea cubebaኡ㣽ᆀ
XP_010251047.1|actin-3 Nelumbo nucifera㦧㣡
KU669295|Dioscorea oppositeኡ㦟
KHG20985.1|Actin-7 Gossypium arboreumᵘᵜỹ
XP_008809027.1|actin-2 Phoenix dactylifera⎧ᷓ
ACP19072.1|actin-1 Picea abiesӁᵹ
AFD62269.1|actin-2 Annona cherimola ⮚㦄᷍
EOY07537.1|Actin-3 Theobroma cacaoਟਟṁ
BAL27711.1|actin-1 Prunus avium⭌⁡ṳ
XP_004294508.1|actin-1 Fragaria vesca䟾㥹㧃
XP_007028993.1|Actin-11 Theobroma cacaoਟਟṁ
XP_008795328.1|actin-1 Phoenix dactylifera⎧ᷓ
AEO45960.1|actin-4 Mangifera indica㣂᷌
AGZ90152.1|actin-11 Litsea cubebaኡ㣽ᆀ
0.002
图 5 山药 Actin 与其他植物 Actin 的系统进化树
1500
1000
500
0
-d
RFU/dT
65 75 85 95908070
Temperature, Celsius
Melt Peak
图 6 DoActin 基因的熔解峰
R
FU
103 
0 10 20
Cycles
Amplification
30 40
10
8
6
4
2
0
图 7 DoActin 基因的扩增曲线
0 1 2
Log Starting Quantity
Standard Curve
Standard Urknown
SYBR E=99.3%R2=0.995 Slope=-3.339y-int=29.857
3
C
q
30
28
26
24
22
20
18
图 8 DoActin 基因的标准曲线
2016,32(7) 79龚明霞等：山药 Actin基因片段的克隆及表达分析
列虽然有一定的变异，但氨基酸序列却具有较高的
稳定性和一致性，这保证了 Actin 基因功能的稳定
性，这与前人［9，10］的研究结果一致。
本研究中 Actin 进化树表明，山药 Actin 与海枣
Actin-2、木本棉 Actin-7 的亲缘关系最近，推测它们
之间的功能最相似，即推测所克隆到的 DoActin 能
在山药细胞中稳定表达。本实验中 RT-qPCR 结果显
示，DoActin 在山药的各个组织、块茎发育的各个时
期都有稳定的表达，且表达水平基本一致，因此推
断 DoActin 为组成型表达的肌动蛋白基因，适宜将
其作为研究山药其他调控基因表达的内参基因。至
于山药中是否存在 Actin 基因家族，要在后续研究中
加以证实。另外，同一物种如海枣、山苍子中不同
类型的 Actin 蛋白却分布在不同的亚群中，说明肌
动蛋白基因的分化可能发生在物种分化之前，这与
Zhang 等［36］、孔卫青和杨金宏［37］的研究结果相似。
本研究对 DoActin 的克隆填补了山药 Actin 研究
领域的空白，丰富了高等植物 Actin 的核酸数据库，
为进一步深入研究 Actin 的功能、保守性、变异性及
其与生命起源与进化的关系提供了新的数据，同时
也为下一步研究山药中重要调控基因的表达模式奠
定了前期工作基础。
4 结论
本 研 究 所 获 得 的 1 个 山 药 DoActin， 其 与
GenBank 收录的前 100 种其他植物肌动蛋白基因在
核苷酸、氨基酸水平的同源性分别在 83% 和 97% 以
上，说明高等植物的 Actin 基因是一种高度保守的看
家基因。DoActin 基因在山药的各个器官以及不同发
育期的块茎和叶片中表达量稳定，适宜将其作为研
究山药其他调控基因表达的内参基因。
参 考 文 献
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A
B
图 9 山药 DoActin 基因在植物不同器官（A）及不同发育
时期的块茎和叶片（B）中的平均 CT 值
3 讨论
目前，在半定量 PCR 或实时荧光定量 PCR 分
析中，有多种类似的看家基因被选作内参基因，如
肌 动 蛋 白 基 因（ACT）、 甘 油 醛 -3-磷 酸 脱 氢 酶 基
因（GAPDH）、18S 和 28S 核 糖 体 RNA 基 因（18S
rRNA、28S rRNA）及肽链延伸因子（ef1-α）基因
等［29-31］。但在大多植物的表达研究中，Actin 基因家
族是使用最频繁的管家基因。肌动蛋白参与真核生
物细胞的许多重要的生命活动，如 ：细胞分裂、细
胞伸长、胞吞、细胞信号转导、重力传感、顶端生
长、细胞器运动及细胞程序性死亡等［32-34］。Actin 基
因不论在核苷酸还是氨基酸水平上都具有高度的保
守性和同源性，在各种组织中恒定表达，因而常被
作为研究其他基因的表达模式及调控机制的分子内
标，以比较不同来源的基因表达量的差异［35］，主要
包括 ACT2/7、ACT8 和 ACT11 等［4］。因此，本研究
也是最先考虑 Actin 作为研究山药生长发育调控基因
表达的内参基因。对克隆到的 1 个山药肌动蛋白基
因（DoActin）比对分析发现，cDNA 的同源性小于
氨基酸，表明在不同植物中，Actin 基因的核苷酸序
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（责任编辑 狄艳红）