全 文 ：第28卷第4期
2009年8月
生态
Ecological
科学
Science
28(4)：335-34l
Aug．2009
獐ISSR．PCR反应体系的建立与优化及引物筛选
张龙龙1，鲍毅新“，于华会2，许婧1，孙 波1
1．浙江师范大学生态研究所，金华321004
2．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江，富阳311400
【摘要】 利用正交试验L16(45)对影响獐(Hydropotcsinennis)ISSR．PCR反应的勋gDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物
浓度、M矿+浓度及模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行优化，同时对退火温度进行梯度PcR反应，以建立适合于
獐IsSR．PCR反应的最佳体系。最终确定獐25旺ISSRIPCR反应体系为：丁幻酶I．25U·25此～、M9 +浓度2．5mmol·L～、
引物浓度O’3岬ol·L-1、DNA模板量350n分25此-l、dNTP浓度0．15mmol·L．1。在此基础上，利用优化的反应体系成功筛
选出10条用于獐相关研究的IssR引物并确定了各自的最佳退火温度，为今后利用ISSR技术进行獐的物种鉴定与分类、
亲缘关系、系统发育和生理病理学研究奠定了技术基础，也为开展其它大型资源动物如黑麂的保护遗传学研究提供理论
基础。
关键词：獐：正交试验；ISSR；引物筛选
doi：lO．3969(i．issn．1008-8873．2009．04．009中图分类号：Q953；Q959．842文献标识码：A文章编号：l008-8873(2009)04．335-07
EstabIishmentandop imizationofISSR—PCRreactionsystemandprimer
screeningforChinesewaterdeer㈣却D纪s加P，．m括)
Z地≮NGL0ng．10n91，BAOYi．xin“，YUHua-hui2，XUJin91，SUNB01
、．1nsnttlte可Ecolo影．zheji矾gNomatUn如ersny．Jh她d32l004。China
2．ReSe甜chlnStlnl|e研sub们pic越F0resn劈CAF，zhejiang．F坶傩g3n400．chin口
Abst瑚ct：Five磊lctlDrsof锄plificati伽system，such嬲concenn蜘onofM∥+，dNTPs，硼mefs，砌DNApolym蹦雠锄dDNA
劬pIatew reinvestigatedt0optimizetheISSR—PCRreactionsystcmofH加P删捃throu曲onhogomltests．Ttledatawere
觚a1)，zedbys0胁areDPS．Asaresult，asatisfhcto巧ISSRreactionsystemf；DrH伽鲫行西withdesirablerepea油il时锄d
pol舯。啦icbandswasestablished．neoptimizedIsSR-PCRsystemofH加明村括included2．5mmoI．L。M∥+，1．25U 此1
砌DNApolymera∞，0．3灿lol’L．1研m％350ng·25pL．1DNAtemplate绷d0．15mm01．L．1dNTPsin25灶，PCRreaction
system．Tbnprime玮wi吐lstableamplificationalldrichpolymorphismforISSRwerescreenedusingthisreactionsystem柚dits
optimala柚∞lingt锄peratureforISSR-PCRreactionw勰pmposedby酬i朗tPCR．TIlisoptimizcdISSR—PCRreactionsy咖m
、vouldprovidenleb勰isf．ort11e粕a】ysisofgeneticd Vers咄phylog即eticanalys s，physiologicalorpatholo百calevents鲫d
geneticv撕ationOfinlp唧嗽mt仃aitsofH加们行括．
Key啪rds：chin岱ewaterde r似抛删括)；orthogonaltests；IssR；两merscr∞ning
收璃日期：2009．06．04收稿，2009-07．15接受
基金项目：浙江省重点学科(生态学)基金和浙江省新苗人才计划基金(2007R40G20301521
作者简介：张龙龙(1984一)，男，硕士研究生，研究方向：动物生态学与分子生态学。E—mail：血锄glonglongok@126．舢
奉通讯作者：鲍毅新，男，教授。E·mail：sky90@zjnu．cn
万方数据
l 前言(Introduction)
ISSR(Inte卜SimpleSequenceRepeat)又称简单
序列重复区间扩增，是在微卫星技术上发展起来的一
种新型分子标记技术，由Zietkiewicz等⋯首先提出并
创立。相对于RFLP(RestrictionFragInentLe 跏
Polymo咄ism)和RAPD(RandomAmplified
PolyTno印hicDNA)，ISSR能提供更多的遗传信息，
同时又具有SSR的稳定性和重复性，能够直接反映
基因组DNA的多态性，已受到越来越多的关注【2-5】，
被广泛用于动、植物的遗传多样性检测16j、物种鉴定
与分类⋯们、亲缘关系与系统发育‘11，121、物种形成和
种质鉴定【l3】等诸多领域。
獐，别名河麂、牙獐，属偶蹄目(Aniodac够la)
鹿科(Cervidae)，为国家二级保护动物。獐是主要产
于我国的一种鹿科动物¨3。”】，国内外学者从生理学
【161、繁殖行为和交配体制【17-20】、集群行为‘181、食性
及摄食行为【2122】等方面开展了一些研究，至今未见关
于ISSR标记在獐上的研究报道。
本研究采用L16(45)正交试验设计，对獐
IssR．PcR反应体系的砌酶、M矿+、dNTP、引物和
模板DNA5个因素，在4个水平上进行梯度优化试
验，并利用DPS软件对试验数据进行分析，寻找獐
ISSR．PCR反应的最佳体系组合，利用最佳体系筛选
出可利用于獐扩增的ISSR引物。此研究为ISSR标记
在獐及其它大型珍惜资源动物如黑麂的遗传多样性、
亲缘关系等方面的应用提供一个较为完善的体系。
2材料与方法(Materialsandmethods)
2．1材料及引物合成
试验样品于2008年9月采自浙江舟山市白泉镇
表l獐ISsR-PCR反应中的影响因素水平
1abIel Fact0鸺andIevebofPCR地acHon
獐繁育中心死亡的幼獐肌肉5份及2008年11月采集
于野外发现的死獐皮毛2份，带回实验室，置于．70℃
超低温冰箱中保存备用。
dNTP、7砷酶、Mg什、标准分子量(Marker)
DL2000购自死勋阳公司，引物参照加拿大哥伦比
亚大学提供的ISSR引物序列，由上海生工公司合成。
2．2方法
2．2．1獐基因组DNA提取
獐肌肉和毛皮的DNA提取采用Hu【14】的方法，
于l％琼脂糖凝胶电泳检测，用Eppendorf公司生产
的Bio．Photometer核酸检测仪检测DNA模板浓度。
2．2．2獐ISSR_PCR正交试验设计
针对影响PcR反应的7细酶、M矿+、dNrP、引
物、模板DNA5个因素，利用DPS软件生成在4个
水平(表1)上试验L16(45)正交表(表2)。引物为
84l(GA)8YC。
将表2的16个处理重复2次，进行扩增反应。
反应体系总体积为25此，除含有上述变化因素(表
2)外，还含有10×PCRbu仟er2．5此。
根据引物的砌值及参考相关文献【23】确定正交
试验扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，
5l℃退火40s，72℃延伸1min，循环40次，72℃
总延伸7min，4℃保存，由Bio．RadMyCyclerⅢPCR
仪完成PCR反应。产物用1．5％琼脂糖凝胶电泳检测，
Bio．Rad公司的GetDoc凝胶成像系统拍照和分析，
得到獐ISSR．PCR反应各影响因素的最佳水平，利用
梯度PCR找到引物的最佳退火温度，并利用7个
DNA样品对优化体系进行检测。
2．2．3引物筛选
利用7个基因组DNA样品，在优化好的反应体
系条件下对ISSR引物进行扩增筛选，并利用梯度
PcR找到各自的最佳退火温度。
万方数据
4期 张龙龙，等：獐ISSR．PcR反应体系的建立与优化及引物筛选 337
表2 PcR正交试验L16(45)设计表及扩增结果
’I’abIe2 orthogonaIdesignf．0rISSR．PCRreactionL16(45)andthemplincatjonresuIt
3 结果与分析(ResuItsandiscussion)
3．1正交试验结果
獐ISSR．PCR正交试验的电泳结果如图l所示。
参照周凌瑜等【24】的方法，采用可识别条带数为每个
结果赋值后再进行数据统计(表3)，从图l中可以
看出，处理2、9、11、12、13、14和16两次重复可
识别扩增条带数较多，分别为12、’12、12、12、14
和12条(表3)。而处理2、12和14的主带更为明
显，且背景也比较清晰。
3．2各因素对ISSR．PCR的影响
计算每个因素不同水平下试验值之和的极大值
和极小值田J以及同一因素不同水平间的极差，各因
素对獐ISSR-PCR反应的影响从大到小依次为砌酶、
M92+、引物、DNA模板和dNllP(表3)。
对各因素进行方差分析，由F值可知，死口酶的
用量对反应结果的影响最大，而DNA和dNTP对反
应结果的影响较小，与极差分析的结果一致，各因素
间均达到极显著差异水平(表4)。
M：DNA标准分子量。l～16：为正交试验中的16个处理．
M：DNAhdd盯，l～16：16仃明tmen缸oforth哩。蛐l懈b．
圈l正交试验PCR产物电泳图
F酥l El∞tmphor髑ismapofPCRpmductsofthe
OrthOgOnalt髓臼．
万方数据
表3 PCR反应各因素扩增片段数的极差分析
1able3 RangeanalysisofbandsforthefactorsfPCR他action
表4 PCR反应各因素间方差分析表
1abIe4 VhrianceaIysisforthehcto聃ofPCRreaction
注No把：¨代表o．ol水平士差异扳显著m哪ssi印i丘啪tdi髓rel髓缸Ⅱ坨o·oIkvd
3．3各因素不同水平对PCR反应结果的影响
3．3．1 勋口酶浓度对PCR结果的影响
砌酶是PCR反应中的关键因素，极差分析和方
差分析表明其浓度变化对ISSR．PCR的带型和背景产
生很大的影响，这与雷雪峰等【25】和关桦楠等126J的研
究一致。从图2可以看出，在0．75～1．50U．25此4
浓度范围内随着砌酶浓度的增加，条带数也随之增
加。综合考虑，而g酶浓度在1．25U．25止d时扩增条
带较多，再继续增加酶浓度条带数增加不显著。
3．3．2Mg什浓度对PCR结果的影响
M92+浓度过低时影响砌DNA聚合酶活性，但
浓度过高会形成复合物影响背景的清晰度【271，可见
M92+对PCR扩增效果的影响极大。极差分析和方差
分析表明其浓度变化对ISSR．PCR的带型和背景影
响很大，在1．5～2．5mmol·L。1范围内随M92+浓度的
升高条带数增多，但继续增加Mg”浓度条带数反而
会下降。据此，选择2．5mmol·L-l为最佳Mgz+浓度
(图3)。
3．3．3 引物浓度对PCR结果的影响
引物浓度对ISSR．PCR的带型和背景会产生明显
的影响124I。极差分析和方差分析结果显示引物浓度
对ISSR．PCR扩增结果产生较大影响。从图4看，引
物浓度选择在0．3岬ol·L‘1时扩增结果最佳。
60
50
餐量40
羹量30
乏乏20
古o
lo
O
0．75 1．oo 1．25 1．50
1姻酶浓度(O．75U．25pL4)
1细DNApolymer踮econcentrati∞
田2不同水平7’叼酶用量对ISSR-PCR的影响
Fig．2Innuen∞ofdif enntlevelsof聊poIymera∞
50
裁名40
羹蜃，o
善懿
O
1．50 2．00 2．50 3．oo
M92+浓度(姗ol·L．I)．．
田3不同水平M92+浓度对IssR．PcR的影响
Fig．3InnuenceofmfferentlevelsofM92+concentration
50
帮书40
枢星
磔苎30
善善zo
lO
O
O．20 O．30 0．40 O．50
引物浓度(um01．L。1)
Primerconcennjali∞
圈4不同水平引物浓度对ISSR-PCR的影响
Fig．4Innuenoeofdiff．erentlevebofPrimerconcentration
万方数据
4期 张龙龙，等：獐lsSR．PcR反应体系的建立与优化及引物筛选 339
50
40
錾髻so
訾耋zo
吞舌10
0
O．10 O．15 0．20 O．25
dNrP浓度dNTPc∞c∞伽ion(mmol·皿一
圈5不同水平dNTP浓度对ISSR．PCR的影响
Fig．5Innuenceofdiffe托ntIevelsofdNTPconcentraHon
50
錾髻篓
搋
O
200 250 350 400
DNA浓度(n分25恤L-1)
DNAconcenn砒ion
田6不同水平DNA浓度对ISSR-PCR的影响
Fig．6InnuenceofdifkrentIevelIsofDNAconcen仃aⅡon
3．3．4 dNTP浓度对PCR结果的影响
dNTP是砌酶的底物，也是PCR反应的原料，
通过极差分析和方差分析得知，dNTP浓度对PCR反
应的结果造成显著影响。在0．1～O．15姗ol·L‘1范围
内，扩增条带数随引物浓度增大而逐渐增加(图5)。
当浓度大于0．15mmol·L．1时，条带数目减少，因此
确定dNTP最适的浓度为O．15mm01．L1。
3．3．5DNA模板量对PCR结果的影响
通过极差和方差分析可知，DNA模板量也对PCR
结果产生极显著影响。当DNA量为350ng·25肛L-1时
扩增效果最佳(图6)，浓度过低时DNA不能与引物
充分配对，浓度过高时则会过早把引物结合掉，从而
进行随机扩增或延伸，也会使扩增条带减少【26J。
3．4退火温度的选择
引物序列和物种的不同使PCR反应的退火温度
不刚28J，这就使退火温度成为决定IssR．PcR扩增稳
定性的重要因素。 ·
利用PCR仪自动产生温度梯度，最低48．0℃，
最高56．0℃，并重复试验1次。退火温度过低时扩
增特异性较差，退火温度过高时则引物与模板结合能
力差，电泳条带亮度变低。按两次重复所得条带总数
计算，第4个梯度条带数多且背景清晰，故而引物
841(GA)8YC的最佳退火温度应选择52．8℃(图7)。
M：DL2伽o，l～8退火温度分别为Con℃sp伽dingt0
56．O℃、55．4℃、54．4℃、52．8℃、50．9℃、49．5℃、48．5℃和48．O℃
图7梯度PcR电泳图。
Fig．7 E仃e!ctofanneaHngtemperatu他onISSR
ampIi6catiOn
通过正交试验得到獐的ISSR—PCR最佳反应体系
为7幻酶1．25U·25¨L～、Mg计浓度2．5mmol·L～、引
物浓度0．3umol·L～、dNTP浓度0．15mmol·L～、DNA
模板浓度350ng·25pL～。利用优化的体系对引物
841(GA)8YC在退火温度52．8℃下对7个獐DNA样
品进行扩增，得到良好的扩增效果(图8)，并且重
复性和稳定性均较高。扩增结果可以清晰区分7只獐
个体，并且每只个体的扩增条带数不同，这也证明了
ISSR适合于獐遗传多样性、资源鉴定、系统发育和
生理病理学等方面的研究。
3．5引物筛选及退火温度的确定
本试验根据正交试验所得獐ISSR—PCR反应的最
佳体系，并根据各引物的砌值从100个待筛选ISSR
引物中初步确定10个具有稳定扩增条带的引物，并
采用梯度退火试验确定了10个ISSR引物的最佳退
火温度(表5)。
4讨论(ConcIusion)
关于正交试验结果的分析方法，多采用直观打
分后利用极差和方差分析法，这种方法不可避免的
存在由主观打分引起的误差【25，26，291。本研究参照周凌
瑜等[241的方法，利用扩增条带数结合背景清晰程度
万方数据
i塑
． 竺查型堂垦2坦曼堡璺!墨￡堡竺! 兰!鲞
表5 ISSR引物序列和最佳退火温度(Tm)
．
TabIe5 ISSRprimersequencesandsuitabIeanneanngtempentlIre(Tm)
图8 ISSR．PCR最佳反应体系扩增结果．M：DL20∞
Fig．8Electrophor鹪Isresul协of暑unableISSIkPCRreacnOn．
对每个处理进行赋值后再利用极差和方差分析法对
正交试验结果进行分析，从而使结果更加真实客观。
IssR．PCR扩增体系存在物种间差异。本研究表
明砌酶、M92+和引物浓度对反应体系的影响最大，而DNA模板和帅浓度的影响较小。但5因素不
同水平均对扩增结果产生极显著影响，与许多研究结
果相同【25瑚】，其中砌酶的研究结果表明在O．50～
1．50U·25心1范围内随酶用量增加扩增条带数增加，
再次证实了酶浓度对ISSR．PCR反应的巨大影响【25l。
考虑到砌酶价格较为昂贵，选择1．25U．25心1作
为獐ISSR．PCR的最佳丁幻酶浓度。关于DNA模板
量对ISSR．PCR反应的影响各个物种存在差异，冯富
娟等【30】在进行红松ISSR．PCR反应体系优化时证实
模板浓度在10～200n分心1之间扩增结果相同，周
凌瑜在小苍兰ISSR．PCR反应体系优化时证实模板
浓度1～6n分皿以对扩增结果影响不显著；但关桦楠
等【26】研究表明DNA模板浓度在25～250n分2 止J
时对异色瓢虫ISSR．PCR的扩增结果产生极显著
影响，雷雪峰等【z副研究表明DNA模板浓度在10～
70n分20此j1时对北美驼绒藜扩增结果产生极显著
影响，但两研究都证实相对于其它因素而言模板
DNA的影响较小，与本研究的结果一致。过高
或过低的模板DNA浓度都不利于扩增反应，故
而獐最佳ISSR．PCR体系的DNA模板浓度确定
为350ng·25此～。
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hui， XU Jing， SUN Bo
作者单位： 张龙龙,鲍毅新,许婧,孙波,ZHANG Long-long,BAO Yi-xin,XU Jing,SUN Bo(浙江师范大学生
态研究所,金华,321004)， 于华会,YU Hua-hui(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙
江,富阳,311400)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2009,28(4)

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