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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):100-108
收稿日期 ： 2015-07-23
基金项目 ：西北民族大学研究生科研创新项目（ycx14166），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2011-23）
作者简介 ：李明霞，女，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：1031082498@qq.com
通讯作者 ：潘和平，男，教授，硕士生导师，研究方向 ：动物遗传育种 ；E-mail ：panheping62@163.com
牦牛 GDF9 和 BMP15 基因的克隆、表达分析及
miRNA 研究
李明霞1，2，3  潘和平1  阎萍2，3  吴晓云2，3  王英杰1，2，3
（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730070 ；2. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050 ；
3. 甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州 730050）
摘 要 ： 以牦牛 GDF9 和 BMP15 基因为研究对象，采用 PCR 方法分别克隆出 GDF9 和 BMP15 的两个外显子片段，RT-PCR
方法分析了 GDF9 和 BMP15 及靶定 miRNA 在各组织中的表达情况。实验结果显示，克隆扩增获得外显子区进行生物信息学分析。
牦牛 GDF9 基因外显子片段长分别 411 bp 和 1 082 bp，编码 453 个氨基酸 ；BMP15 基因外显子片段长分别为 323 bp 和 802 bp，编
码 372 个氨基酸。GDF9 编码蛋白是亲水蛋白，含有一个信号肽和 15 个潜在磷酸化位点 ；BMP15 编码蛋白是亲水蛋白，不含信号
肽，有 6 个潜在磷酸化位点。通过实时荧光定量 PCR 方法分析牦牛 GDF9 和 BMP15 基因在不同组织中的表达量，结果表明 GDF9
在卵巢和子宫中表达相对较高，且卵巢表达显著高于其他组织，心、肾、胰和脾中无表达。BMP15 仅在卵巢中表达。TargetScan
预测靶定牦牛 GDF9 和 BMP15 基因的靶定 miRNA，分析 GDF9 靶基因 bta-miR-193a-3p 和 bta-miR-193b 在心、脾、肺、肾和子宫中
的表达量，结果显示 bta-miR-193a-3p 脾中表达量显著高于其他组织，但在心、肺和子宫中均不表达。bta-miR-193b 在心和肾中没
检测到表达，在肺中的表达量显著低于脾和子宫中。
关键词 ： 牦牛 ；GDF9 ；BMP15 ；miRNA
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.013
Cloning，Expression Analysis and miRNA Study of Gene GDF9 and
BMP15 in Yak
LI Ming-xia1，2，3 PAN He-ping1 YAN Ping2，3 WU Xiao-yun2，3 WANG Ying-jie1，2，3
（1. College of Life Science and Engineering of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730070 ；2. Lanzhou Institute of Husbandry
and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050 ；3. Key Laboratory of Yak Breeding Engineering，
Lanzhou 730050）
Abstract: Gene GDF9（growth differentiation factor 9）and BMP15（bone morphogenetic protein 15）of yak were used as research
subject ；then 2 exon fragments of GDF9 and BMP15 were cloned by PCR, and the expressions of GDF9 and BMP15 as well as targeted
miRNA were analyzed by RT-PCR. The results were as follows. The cloned and amplified exon fragments were analyzed by bioinformatics ；
the exons of yak gene GDF9 were 411 bp and 1 082 bp, encoding 453 amino acids ；the lengths of exons in yak gene BMP15 were 323 bp and
802 bp separately, encoding 372 amino acids. The protein encoded by GDF9 was hydrophilic, containing one signal peptide and 15 potential
phosphorylation sites ；the protein encoded by BMP15 was also hydrophilic, and owing no signal peptide and 6 potential phosphorylation sites.
The expressions of GDF9 and BMP15 in different tissues were examined by RT-PCR. The results showed that GDF9 expressed relatively high in
ovary and uterus, and higher in ovary than others tissues, and no expression in heart, kidney, pancreas, and spleen ；BMP15 was only detected
in ovary. With TargetScan, the target miRNA of yak gene GDF9 and BMP15 were predicted and the expressions of target gene bta-miR-193a-3p
and bta-miR-193b of GDF9 in heart, spleen, lung, kidney and uterus were analyzed. miRNAs genes were examined with RT-PCR ；the results
indicated that bta-miR-193a-3p in the spleen expressed significantly higher than in others tissues, and no expression in heart, lung and uterus ；
bta-miR-193b expressed lower in lung than spleen and uterus, and no expression was detected in heart and kidney.
Key words: Yak ；GDF9 ；BMP15 ；miRNA
2016,32(2) 101李明霞等：牦牛 GDF9和 BMP15基因的克隆、表达分析及miRNA 研究
生长转化因子 9（Growth differentiation factor 9，
GDF9）和骨形态发生蛋白 15（Bone morphogenetic
protein 15，BMP15）都作为转化生长因子（TGF-β）
超家族的成员，参与早期卵泡的生长和分化。1978
年 TGF-β 由 Delarco 和 Todaro 在 研 究 病 毒 时 发 现，
它因具有促进单层培养的成纤维细胞转化并形成
克隆而得名，TGF-β 是目前发现最大的细胞内信号
蛋白家族［1］。其成员以自分泌和旁分泌的形式参
与细胞生物活性的调节［2，3］。GDF9 最早由 Lee 以
TGF-β 家族的保守区域为模板设计简并引物克隆
得到，采用 Northern blotting 在小鼠卵巢中检测到
mRNA 表达［4］。而 BMP15 最早是在绵羊中发现的，
Aaltonen［6］根据其基因的保守性首次克隆了小鼠的
BMP15 基因，后期以它为模板相继得到了人、大鼠
及羊的 BMP15 的序列［5］。Aaltonen 在卵母细胞中发
现 BMP15 的特异性表达。研究初期认为它们表达模
式相似且仅在动物卵巢组织特异性表达，后期经深
入研究发现不同物种表达定位存在不同。对牛羊的
研究发现 GDF9 在睾丸和下丘脑组织中也表达，同
时对人的研究显示在非性腺组织也检测到 GDF9 的
表达。表明 GDF9 不仅在卵母细胞的排卵过程中表
达［7，8］。后期有研究者对啮齿类动物研究发现 GDF9
在睾丸和下丘脑组织中也表达，同时对人的研究显
示在非性腺组织也检测到 GDF9 的表达。BMP15 也
不仅在卵巢中表达，在人［6］和牛［9］睾丸及小鼠［10］
垂体中均检测到微量表达。随着对 GDF9 和 BMP15
的深入研究表明这些生长因子可能潜在调节垂体和
睾丸的功能，参与调节动物生殖过程［11］。
miRNA 是一类非编码小分子 RNA，长约 20 nt，
通过结合靶 mRNA 的 3 UTR 导致其或抑制翻译，参
与调控转录后过程，进而参与生命进程。有研究表
明，miRNA 在卵巢及睾丸组织中参与调控。2007 年
Ro 等［12］小鼠卵巢中克隆得到 122 个 miRNA，并对
其进行半荧光定量 PCR 分析，发现其在卵巢和睾
丸组织中均表达，而后发现包含 miR-ov15 和 miR-
ov9 共 4 个 miRNA 在 卵 巢 中 特 异 性 表 达。2008 年
Otsuka［13］发现 Dicer（d/d）小鼠不育，将正常小鼠
卵巢移植到此小鼠上可得到后代，将 Dicer（d/d）小
鼠卵巢移植到正常小鼠中无怀孕现象，说明卵巢发
育是影响繁殖的关键因素。对 Dicer（d/d）小鼠研究
发现，miR-17-5p 和 let-7b 影响黄体血管长度和数量，
将其注射到 Dicer（d/d）小鼠中可恢复黄体血管生成，
但不能使胎儿发育，可能还有其他 miRNA 共同参与
调节。Tang 等［14］在 Dicer 基因敲除小鼠卵泡中检测
到有些 mRNA 和蛋白质高分度表达，说明敲除 Dicer
基因可减少成熟 miRNA 产生，可减少靶 mRNA 的
降解和翻译抑制作用。Byrne［15］研究发现 miR-125a
可靶调节 Ped 基因调控小鼠胚胎发育。
牦牛作为高寒地区的特有牛种，主要分布于青
海、西藏、四川、甘肃和云南等高寒草原区［16］。牦
牛具有适应能力强，耐粗饲，耐寒冷等特点，从而
可在含氧量低，牧草季节短，气候寒冷的条件下生
存繁衍，它也是一种经济价值很高的物种，可为当
地牧民提供肉、奶、皮及役力等生活生产资料。
牦牛属于单胎动物，一胎一犊且世代间隔较长
的特点极大地限制了牦牛的数量，以期采用常规的
遗传选择法进行优化提高双胎率进展缓慢。加大与
排卵数相关主效基因的研究，这是提高繁殖性能最
直接且有效的方法。目前关于 GDF9 和 BMP15 影响
动物繁殖力的研究逐渐增多，但关于 GDF9、BMP15
在牦牛生殖过程中的研究有限。因此，本研究对
牦牛 GDF9、BMP15 基因外显子区克隆并进行相关
生物信息学分析，旨在为进一步开展牦牛 GDF9、
BMP15 基因的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织样、细菌菌株和载体 用于本研究的牦
牛样品采自于甘肃省大通牦牛育种场。用常规的酚
氯仿提取法提取血样中基因组 DNA ；利用 TRizol 法
提取各组织中的总 RNA ；大肠杆菌 E.coli DH5α 购自
TIANGEN 公司 ；pGEM-T easy 克隆载体购自 Promega
公司。
1.1.2 分子生物学试剂 DNA 提取试剂盒、琼脂糖
凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq 酶、IPTG
和 Amp 均 购 于 TIANGEN 公 司 ；TRizol Reagent 购
自 Invitrogen 公司 ；荧光定量试剂盒 SYBR Premix Ex
TaqTM II 购自 TaKaRa。
1.1.3 引物设计与合成 根据 GenBank 已知的牦牛
GDF9（NW_005393189）和 BMP15（NW_005393997）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2102
基 因 序 列 分 别 设 计 克 隆 引 物、 表 达 引 物。 根 据
TargetScan 预 测 得 到 miRNA 设 计 表 达 引 物， 引 物
（表 1）由英潍捷基贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 牦牛总 DNA 提取 健康成年牦牛血液组织为
材料，使用 DNA 提取试剂盒提取牦牛总 DNA，利
用紫外分光光度计测定 260 nm 波长下 OD 值，检测
浓度和纯度。
1.2.2 RNA 的提取 组织样品采自 3 头青海牦牛
均为雌性，根据厂商说明利用 TRizol 法提取各组
织中的总 RNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测其质量，
Thermo 公司的 NanoDrop 2000 检测其浓度及纯度。
1.2.3 反 转 录 根 据 TaKaRa 反 转 录 试 剂 盒
PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 说明依
次进行，但 miRNA 实时荧光定量表达研究所用反转
录引物采用反转录引物混合液，各取 1 μL RT primer
加到 78 μL ddH2O 中均匀混合用作反转录引物混合
液。GDF9 和 BMP15 基因在各组织中的表达以 β-actin
为内参，扩增条件 ：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，
65℃ 5 s，72℃ 45 s，40 个循环。bta-miR-193a-3p 和
bta-miR-193b 表 达 以 U6 为 内 参 基 因， 扩 增 条 件 ：
95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，45 个循环。
1.2.4 GDF9 和 BMP15 基因的克隆 琼脂糖凝胶电
泳检测 PCR 产物，利用 DNA 凝胶回收试剂盒回收，
琼脂糖凝胶电泳检测回收物质量。再将回收产物连
接 pGEM-T easy 载体，T4 连接酶 16℃过夜连接，以
此构建重组质粒。将重组质粒转化感受态细胞 E.coli
DH5α，37℃震荡培养 60 min 后，涂布于含有 Amp
和 IPTG 等成分的 LB 固体培养基，培养基 37℃过夜
培养。挑取白色阳性菌落接种于 LB 液体培养基过
夜培养。提取质粒双酶切鉴定，将鉴定为阳性的菌
落送至公司测序。
1.2.5 GDF9 和 BMP15 基因序列的生物信息学分析
1.2.5.1 理化性质分析 采用 ExPASy（http://www.
expasy.org/）等软件进行生物信息学分析，包括开放
阅读框，氨基酸组成，等电点，疏水性质等理化性
质，信号肽，跨膜区，磷酸化位点 ；运用 SOPMA
（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/
Expasy/Expasy8.htm） 和 SWISS-MODEL（http://www.
swissmodel.expasy.org/）软件预测蛋白质的二级和三
级结构。
1.2.5.2 进化分析 运用 Clust W 软件进行多序列同
源性比对，NCBI 数据库分别下载 GDF9 和 BMP15
基因编码蛋白的序列，其中包括人（NP_005251.1 ；
表 1 GDF9 和 BMP15 基因引物序列
引物名称 用途 序列（5-3） 扩增片段大小 /bp
GDF9-1 基因克隆 F ：GTTCCTTGCTAATTCTTCCA 600
R ：AGGGCCAACTCCTTTATGTA
GDF9-2 F ：TAACTCCTATCCCACCCT 1265
R ：GATGCCACAGAATACACTAA
BMP15-1 F ：CAAGATGGTCCTTCTGAGCA 550
R ：CACCCACCCTGTAGGCAATG
BMP15-2 F ：CATAAGGCTATTGTGGATTC 1055
R ：TCACCTGCATGTACAGGACT
GDF9 组织表达 F ：ACCTCTACAACACTGTTCGGCTCTT 126
R ：CCACAACAGTAACACGATCCAGGT
BMP15 F ：TGAGGCCGCTGGCTAGTGTA 117
R ；AAACCACAGTGGCTCTGACTAGTTG
bta-miR-193a miRNA 表达 RT ：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGGG
F ：GTCTGGTGGAACTGGCCTAC
R ：CGCAGGGTCCGAGGTATTC
RT ：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGCG
bta-miR-193b F ：GTCAGGAGTAACTGGCCCAC
R ：CGCAGGGTCCGAGGTATTC
2016,32(2) 103李明霞等：牦牛 GDF9和 BMP15基因的克隆、表达分析及miRNA 研究
NP_005439.2）， 小 鼠（XP_006532283.1 ；NP_0338-
87.1），猪（NP_001001909.1 ；NP_001005155.1），山
羊（NP_001272637.1 ；NP_001272517.1）， 狗（XP_
005626415.1 ；XP_003640322.1）， 骆 驼（XP_01097-
9701.1 ；XP_010996367.1），黄牛（XP_010805521.1 ；
NP_001026922.1），水牛（XP_006050617.1 ；XP_00-
6059547.1）， 熊 猫（XP_002912947.1 ；XP_0029305-
52.1），狒狒（NP_001162234.1；XP_003917771.1）和
牦牛共 11 个物种，运用 MEGA5.10 软件基于邻位归
并法（NJ 法）构建系统发生树。
1.2.6 GDF9 和 BMP15 基 因 靶 标 miRNA 预 测 运
用 TargetScan 在 线 预 测 软 件（http://www.targetscan.
org/），以 GDF9 和 BMP15 基因作为靶基因，参数为
系统默认，预测靶定此基因的 miRNA。
2 结果
2.1 牦牛GDF9和BMP15基因的序列分析
以大通牦牛血液总 DNA 为模板扩增 GDF9 基
因两个外显子区，PCR 产物电泳结果（图 1）显示，
得到两条清晰的条带，大小分别是 500 bp 和 1 265
bp，与预期目的条带相符，测序后得到长度分别为
411 bp（位于 1-411 bp 处）和 1 082 bp（位于 410-
1 491 bp 处）的两条核苷酸序列，拼接后得到完整
外显子区序列（图 2）。运用在线 BLAST 比对测序
得到序列与公布的 GDF9 mRNA 序列只有 1 个碱基
（位于 112 位）的差异，相似性达 99%，具有较高的
同源性，初步认为得到序列是牦牛 GDF9 外显子区
序列。
1500
bp
1000
800
600
400
200
M 1 2 3 4
M：DNA 分子质量标准；1：GDF9-1 PCR 扩增产物；2：GDF9-2 PCR 扩增产物；
3 ：BMP15-1 PCR 扩增产物 ；4 ：BMP15-2 PCR 扩增产物
图 1 牦牛 GDF9 和 BMP15 基因 PCR 扩增产物的电泳图
1
14
104
194
284
374
464
554
644
734
824
914
1004
1094
1184
1274
1364
1454
13
103
193
283
373
463
553
643
733
823
913
1003
1093
1183
1273
1363
1453
1491
图 2 牦牛 GDF9 基因编码蛋白序列
以大通牦牛血液总 DNA 为模板扩增 BMP15 基
因外显子区，PCR 产物电泳结果（图 1）显示，得
到两条清晰大小分别是 450 bp 和 1 055 bp 的片段，
结果与预期相似，测序得到长度分别为 323 bp（位
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2104
1
49
139
229
319
409
499
589
679
769
859
949
1039
48
138
228
318
408
498
588
678
768
858
948
1038
1122
图 3 牦牛 BMP15 基因编码蛋白质序列
于 1-323 bp 处）和 802 bp（位于 321-1 122 bp 处）
的两条核苷酸序列，拼接后得到外显子区序列如图
3。运用在线 BLAST 比对得到序列与公布的 BMP15
mRNA 序列相似性高达 100%，初步认为得到序列是
牦牛 BMP15 外显子区序列。
2.2 牦牛GDF9和BMP15蛋白的生物信息学分析
2.2.1 牦牛 GDF9 和 BMP15 基因编码蛋白一级结
构 序 列 分 析 运 用 在 线 ExPASy 软 件（http://www.
expasy.org/）分析牦牛 GDF9 基因编码蛋白理化性质，
此蛋白分子量为 51.947 6 kD，理论等电点 pI=8.99。
含有 20 种氨基酸，其中 Leu 以 11.3% 最多且远高于
其他氨基酸，Trp 以 1.5% 最少。通过 ORF Finder 软
件对所得序列进行开放阅读框分析，得到长为 1 362
bp 的开放阅读框，编码 453 个氨基酸，编码蛋白为
亲水性蛋白。SignalP 4.1 预测信号肽表明，该基因
编码蛋白质含有一个信号肽，切割位点位于 25 和
26 位氨基酸之间。TMHMM 预测无跨膜区，非跨膜
蛋白。GDF9 基因编码蛋白 15 个潜在磷酸化位点。
运用在线 ExPASy 软件分析牦牛 BMP15 基因编
码蛋白理化性质，此蛋白分子量为 40.838 9 kD，理
论等电点 pI=9.62。含有 20 种氨基酸，其中 Leu 以
11.7% 最多远高于其他氨基酸，Cys 和 Met 以 1.7%
最少。有长为 1 119 bp 的开放阅读框，编码 372 个
氨基酸。无信号肽、跨膜区，为非跨膜蛋白。磷酸
化位点预测显示，BMP15 基因编码蛋白共有 6 个潜
在磷酸化位点。
2.2.2 牦牛 GDF9 和 BMP15 基因编码蛋白二级和三
级结构序列分析 运用 SOPMA 在线软件预测 GDF9
二级结构。结果（图 4）显示，该基因编码蛋白二
级结构中无规则卷曲占据最多，而 β 转角最少，其
10 20 30 40 50 60 70
h 代表 α 螺旋 ；e 代表延伸连 ；t 代表 β 转角 ；c 代表无规则卷曲
图 4 牦牛 GDF9 基因编码蛋白二级结构分析
2016,32(2) 105李明霞等：牦牛 GDF9和 BMP15基因的克隆、表达分析及miRNA 研究
中 α 螺旋区为 138 个氨基酸，延伸链为 76 个氨基酸，
β 转角为 23 个氨基酸，无规则卷曲为 216 个氨基酸，
分 别 占 30.36%、16.78%、5.08% 和 47.68%。 利 用
SwissModel 进行同源建模预测牦牛 GDF9 基因编码
蛋白三级结构，结果如图 5 所示。
运用 SOPMA 在线软件预测 BMP15 二级结构结
果（图 6）显示，该基因编码蛋白二级结构与 GDF9
相似，其中 α 螺旋区为 99 个氨基酸占 27.65%，延
伸链为 67 个氨基酸占 18.72%，β 转角为 29 个氨基
酸占 8.10%，无规则卷曲为 163 个氨基酸占 45.53%。
同源建模预测牦牛 BMP15 基因编码蛋白三级结构，
结果如图 7 所示。
育树分析 运用 MEGA5.10 软件基于 NJ 法分别构建
GDF9 和 BMP15 基因系统发生树，结果（图 8，图
9）表明，牦牛 GDF9 和 BMP15 基因均与黄牛亲缘
关系最近，与水牛次之。
图 5 牦牛 GDF9 基因编码蛋白三级结构预测
10 20 30 40 50 60 70
h 代表 α 螺旋 ；e 代表延伸链，t 代表 β 转角 ；c 代表无规则卷曲
图 6 牦牛 BMP15 基因编码蛋白二级结构分析
2.2.3 牦牛 GDF9 和 BMP15 基因编码蛋白的系统发
图 7 牦牛 BMP15 基因编码蛋白三级结构预测
2.3 牦牛GDF9和BMP15组织表达分析
采用 RT-PCR 技术分别对心、肾、肝、肌肉、胰、
脾、卵巢和子宫等八种组织进行差异表达分析（图
10）。以 GDF9 在肌肉中的表达量为内对照，GDF9
Bos taurus
Bos mutus
Bubalus bubalis
Capra hircus
Sus scrofa
Canis lupus familiaris
Camelus dromedarius
Mus musculus
Homo sapiens
Papio anubis
0.05
图 8 牦牛 GDF9 基因编码蛋白系统发育树（NJ 法）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2106
在卵巢和子宫中表达相对较高，在胰和脾中不表达，
BMP15 仅在卵巢中表达。
的两个 miRNA 在心、脾、肺、肾和子宫 5 种组织
进行差异表达分析，以 bta-miR-193a-3p 在脾中的表
达量为内对照，结果见图 11。bta-miR-193a-3p 整体
表达量低于 bta-miR-193b，但脾中表达量相对较高，
且显著高于其他组织，在心、肺和子宫中均不表达。
bta-miR-193b 在心和肾中未检测到表达，在肺中的
表达量显著低于脾和子宫中。
Bos taurus
Bos mutus
Bubalus bubalis
Capra hircus
Sus scrofa
Canis lupus familiaris
Ailuropoda melanoleuca
0.05
Camelus dromedarius
Mus musculus
Homo sapiens
Papio anubis
图 9 牦牛 BMP15 基因编码蛋白系统发育树（NJ 法）
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5A
B
Tissue
R
el
at
iv
e
m
R
N
A
le
ve
l
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Tissue
R
el
at
iv
e
m
R
N
A
le
ve
l
heart kidney liver muscle ovary pancreas spleen uterus
heart kidney liver muscle ovary pancreas spleen uterus
图 10 牦牛 GDF9（A）和 BMP15（B）基因在各组织
表达量
2.4 牦牛GDF9和BMP15靶定miRNA的预测筛选与
表达分析
运用 TargetScan 在线软件预测，GDF9 共预测
得到 28 个 miRNA，BMP15 无结果。本研究选择属
于 microRNA-193 家族的 bta-miR-193a-3p 和 bta-miR-
193b 进行研究，采用 RT-PCR 技术分别对筛选得到
2.0
1.6
1.2
0.8
0.15
0.10
0.05
0
22
18
14
10
6
4
2
0
R
el
at
iv
e
m
iR
N
A
le
ve
l
R
el
at
iv
e
m
iR
N
A
le
ve
l
heart spleen lung
Tissue
kidney uterus
heart spleen lung kidney uterus
heart spleen lung
Tissue
*
*
kidney uterus
heart spleen lung kidney uterus
A
B
* 表示差异显著（P<0.05）
图 11 bta-miR-193a-3p（A）和 bta-miR-193b（B）牦牛各组
织中表达量
3 讨论
近年来，对于 GDF9 和 BMP15 基因的研究备受
关注，已有研究证明 GDF9 和 BMP15 影响羊繁殖力，
其中 GDF9 通过旁分泌的方式影响卵泡的生长分化，
而 BMP15 则是主要借助卵泡发育过程中抑制 FSH
受体在颗粒细胞中的表达来发挥调节作用，它们之
间同源性较高且结构相似，功能上表现出协同效应。
本研究运用生物信息学方法预测了牦牛 GDF9
和 BMP15 基因编码蛋白的结构和功能。通过对其
二级结构预测可知 GDF9 的 α 螺旋占 30.36%、延
伸链 16.78%、β 转角 5.08%，无规则卷曲 47.68%，
BMP15 的 α 螺 旋 占 27.65%， 延 伸 链 18.72%，β 转
角 8.10%，无规则卷曲 45.53%，从而形成高级结构
2016,32(2) 107李明霞等：牦牛 GDF9和 BMP15基因的克隆、表达分析及miRNA 研究
发挥其特定功能，均完成了三维建模。它们分别作
为 TGF-β 家族中 GDF 和 BMP 亚家族成员参与细胞
生物活性的调节，因其一级和二级结构相似于家族
成员，其功能也具有相似性。有研究表明转录起始
位点二级结构稳定性决定翻译起始效率，稳定性越
高表达率越低［17］。而对绵羊的研究发现 GDF9 突变
形成突变杂合体，使其表达量降低致使卵巢排卵数
增加引起多胎现象［18］。原因之一可能是牦牛二级
结构不如绵羊稳定使其多胎现象少于绵羊。但牦牛
GDF9 和 BMP15 基因编码蛋白质真正的生物学功能
有待于进一步研究。利用编码氨基酸序列同其他 10
个物种进行聚类分析并构建系统发育树，从物种之
间的进化关系可看出牦牛 GDF9 和 BMP15 基因编码
蛋白与黄牛最为接近，符合动物之间的分类地位。
GDF9 和 BMP15 表达模式相似，研究初认为两
者仅在卵巢中表达，经过深入研究发现不同物种之
间有所区别。Fitzpatrick［19］在对大鼠和小鼠的研究
中发现 GDF9 仅在卵巢、睾丸和下丘脑中表达，子
宫中未检测到表达，而后期在对人的研究中发现，
在性腺和非性腺组织，如垂体、子宫和骨髓中也检
测到 GDF9 的表达。Elis［20］ 发现鸡 BMP15 在卵巢
和其他组织中均有表达。Clelland［21］对斑马鱼的研
究发现，BMP15 在卵巢和睾丸中高表达，而在心脏、
肝脏、肌肉、肠道和脑组织中也表达。本研究检测
牦牛 GDF9 和 BMP15 在各组织中表达情况，发现
GDF9 基因不仅在卵巢和子宫中表达，在肝脏和肌
肉中也检测到表达，而 BMP15 仅在卵巢中表达 ；但
GDF9 和 BMP15 均主要在性腺组织中高表达。
miRNA 在卵泡生成、排卵、卵母细胞成熟和黄
体功能等方面起到重要作用［13］。目前对于 miRNA
影响繁殖力的研究主要集中于对卵巢周期排卵影响。
Fiedle 等［22］研究发现经过 hCG 处理前后的颗粒细
胞， 有 13 个 miRNA 差 异 表 达， 其 中 miR-132 和
miR-212 经处理后表达量明显上调，后经研究确定
miR-132 和 miR-212 可通过结合寡核苷酸阻碍 cAMP
介导的成熟 miRNA 表达与功能。2010 年 Yao［23］曾
用 TFG-β1 处理小鼠腔前颗粒细胞后发现 miR-224 表
达量明显上调，后经 TFG-β 超家族Ⅰ型受体抑制剂
阻断效应物 Smad2/3 磷酸化处理后，发现上调作用
减弱，表明 TFG-β1/Smads 通路可调节 miR-224 的表
达，发现 miR-224 可通过靶定 Smad4 增加颗粒细胞
增生和细胞雌二醇释放，而内源性 miR-224 的抑制
能够阻碍由 TFG-β1 介导的颗粒细胞增生。Yao［24］
研究发现孕酮分泌过程中，经 FSH 处理 12 h 后，
miR-29a 和 miR-30d 表达量明显下降，处理 48 h 后
表达量又显著增加。有研究表明 micro-193 家族成
员 miR-193b 可通过靶定 GRB7 蛋白，侵袭人子宫内
膜腺癌细胞系 HEC-1B，抑制 GRB7 蛋白表达从而参
与子宫内部调节［25］。通过对 micro-193 家族的 bta-
miR-193a-3p 和 bta-miR-193b 进 行 表 达 量 分 析， 发
现子宫作为影响产仔数的关键因素之一，bta-miR-
193a-3p 在子宫中无表达，在脾和肾中表达量相对
较高，而 bta-miR-193b 在子宫中表达量较高，推测
bta-miR-193b 可能总用于靶定 GDF9 基因，为调控牦
牛多胎性的 miRNA。
4 结论
牦牛 GDF9 基因克隆得到两个片段长分别 411
bp 和 1 082 bp， 共 编 码 453 个 氨 基 酸 ；BMP15 基
因克隆得到片段长分别为 323 bp 和 802 bp，共编
码 372 个氨基酸，系统进化分析表明牦牛 GDF9 和
BMP15 均和黄牛亲缘关系最近，结果符合理论。
GDF9 在卵巢和子宫中表达相对较高，BMP15
仅 在 卵 巢 中 表 达。 预 测 GDF9 和 BMP15 的 靶 定
miRNA，对 micro-193 家族的 bta-miR-193a-3p 和 bta-
miR-193b 进行表达量分析发现 bta-miR-193a-3p 整体
表达量低于 bta-miR-193b，但脾中表达量相对较高，
显著高于其他组织。bta-miR-193b 在心和肾中未检
测到表达，在肺中的表达量显著低于脾和子宫中。
推测 bta-miR-193b 可能作用于靶定 GDF9 基因，参
与牦牛多胎性的调控。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）