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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):38-43
植物在生长发育过程中常受细菌、真菌、病毒
等病原物的危害，以及温度、湿度等不利环境因子
的胁迫，从而使得植株的细胞及亚细胞结构发生变
化，进而造成植株生长发育变缓甚至死亡。电镜技
术是研究这一病变过程，以及病原物形态和结构的
重要工具。本文就当前主要的电镜类型及其在植物
病害研究中的应用进行概述，以期为更好的运用电
镜技术提供借鉴。
1 透射电子显微镜
透射电镜（transmission electron microscope，TE-
M）的原理是电子束照射样本后，用电磁透镜收集
穿透样本的电子，并放大成像，进而显示物体内部
的超微结构。其放大倍数为 40-100 万倍，分辨率达 0.2
nm。因样品类别和研究内容不同，透射电镜需辅以
负染、超薄切片和免疫电镜技术。
1.1 负染技术
负染技术（negative staining）最早由 Brenner 和
Home 在研究番茄丛矮病毒（tomato bushy stunt virus，
TBSV）时所提出［1］。其原理是将标本包埋在染色物
质里，借助染色剂增强背景对电子的散射作用而使
收稿日期 ：2015-05-18
基金项目 ：国家公益性行业（农业）科研专项（201203076），国家科技支撑子课题（2012BAD19B06），重庆市两江学者项目，中央高校基
本科研业务费（XDJK2014A001）
作者简介 ：马丹丹，女，硕士研究生，研究方向 ：细胞生物学 ；E-mail ：dandanmxz@163.com
通讯作者 ：李中安，男，研究员，研究方向 ：分子植物病理学，细胞生物学 ；E-mail ：zhongan@cric.cn
电镜技术在植物病害研究中的应用
马丹丹  邓雨青  周彦  周常勇  李中安
（西南大学柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要 ： 电子显微镜（electron microscopy，EM）是 20 世纪最重要的发明之一，其特有的高分辨率，在植物病害检测、超微
结构及形态观察中发挥了重要作用。对目前常用的透射电子显微镜，扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜及
原子力显微镜等新型电镜的原理及其在植物病害研究中的应用作一介绍，旨在为更好的运用电镜技术提供参考。
关键词 ： 超微结构 ；电子显微镜 ；植物病害
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.007
Application of Electron Microscopy Technology in the Research of
Plant Diseases
MA Dan-dan DENG Yu-qing ZHOU Yan ZHOU Chang-yong LI Zhong-an
（Citrus Research Institute，Southwest University，Chongqing 400712）
Abstract: Electron microscopy（EM）is the most important invention in the 20th century. The EM plays a great role in detection of the
plant disease and observation of ultrastructure and morphology because of its high resolution. The principles of electron microscopes commonly
used at present and their applications in the plant disease research were introduced in this article，including transmission electron microscope
（TEM），scanning electron microscope（SEM），environmental scanning electron microscope（ESEM），scanning tunneling microscope（STM）
and atomic force microscope（AFM）. This article is aimed to provide reference for the better utilization of electron microscopy.
Key words: ultrastructure ；electron microscope ；plant diseases
2016,32(3) 39马丹丹等：电镜技术在植物病害研究中的应用
标本在荧光屏上形成暗背景下的亮像。常用的负染
色剂有磷钨酸、醋酸铀、甲酸铀和钼酸铵等。
由于负染技术可显示生物大分子、细菌、病毒、
分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、结构特
征，且样品制备简单，只需用载膜铜网或镍网直接
蘸取组织汁液，负染，晾干后便可用于电镜观察，
因此该技术被广泛运用于莴笋（图 1-A）、柑橘、烟草、
甘薯（图 1-B）等寄主中病原的检测［2-5］。此外，由
于病毒在寄主中分布不均，且含量低，因此为提高
检测的准确性，常将病毒颗粒经超离富集后再进行
负染观察。该方法已成功应用于柑橘黄脉病毒（cit-
rus yellow vein clearing virus，CYVCV）、烟草花叶病毒
（tobacco mosaic virus，TMV）等的研究［6，7］。
chip disease，ZP）这种新发病害的系统发育提供了
帮助［11］。超薄切片的 TEM 图片以黄龙病菌侵染的
柑橘样品组织为例［12］，如图 2 所示。
A B
V
10 nm 10 nm
A ：感病甘薯叶片中的线状病毒粒子［2］；B ：感病莴笋中的番茄环纹斑点病
毒（tomato zonate spotvirus，TZSV）［5］；V ：病毒粒子
图 1 电镜负染图片
1.2 超薄切片技术
负染技术虽可以通过观察病原粒子形态快速诊
断病原，但无法观察病株超微结构的变化及病原在
组织中的分布。超薄切片技术可解决这一难题。通
过将样品固定、脱水、树脂渗透、包埋、聚合后，
制备成 50-80 nm 的超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸
铅双重染色，便可在电镜下进行观察。
研究人员借助超薄切片技术研究寄主感病后
超微结构的变化，从而揭示了粗柠檬对柑橘黄龙病
（citrus huanglongbing，HLB）具有较强耐性的原因［8］，
明确了苜蓿属中不同皂苷提高白杨抗病能力的机
理［9］，以及植物先天免疫反应中细胞自噬调控细胞
程序性死亡的过程［10］。同时，运用超薄切片技术对
病原在组织的分布进行定位，在马铃薯的韧皮部中
发现存在一种与柑橘黄龙病菌十分相似的新型病原
细菌，从而为研究马铃薯斑马片病（potatoes zebra
A B
C D
E F
20 μm 20 μm
20 μm 20 μm
20 μm 20 μm
A ：感病组织，筛管周围细胞有大量淀粉积累 ；B ：感病组织，淀粉粒充满
整个细胞，叶绿体片层膜结构模糊及叶绿体扭曲变形，且有大量嗜锇颗粒
积累 ；C ：健康组织，叶绿体片层膜结构清晰可见 ；D ：感病组织，筛管和
伴胞中大量泡状结构产生 ；E ：感病组织，筛管细胞中有病原菌的积累 ；F ：
感病组织，韧皮部邻近组织科观察到异形晶体细胞 ；SE ：筛管
图 2 电镜观察柑橘黄龙病组织结构［12］
1.3 免疫电镜技术
免疫电镜技术（immune electron microscopy，IE-
M）又称为免疫细胞化学技术（immunocy tochemis-
try），其原理是通过将免疫学与超微结构形态学相结
合，利用抗原 - 抗体的特异性结合对抗原或抗体进
行精确定位［13］。
根据标记方法的不同，免疫电镜技术又分为免
疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。
但免疫铁蛋白技术存在 Fe 原子的分子量太大，难
以透过细胞膜和组织，只适用于细胞表面抗原定位
等缺点。早期，朱培坤［14］和吕文渊［15］分别将免疫
酶标技术应用于长叶车前花叶病毒（ribgrass mosaic
virus，RMV） 和 水 仙 花 叶 病 毒（natcissus mosaic
virus，NMV）在植物组织细胞内的分布，该技术
虽可实现对细胞内外的抗原进行定位，但因酶反应
产物比较弥散而分辨率较低。因此，这两种标记方
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法在植物病害研究中应用较少。免疫胶体金技术因
其具有较高灵敏度而被广泛运用于番茄不孕病毒
（tomato aspermy virus，TAV）、黄瓜花叶病毒（cucumber
mosaic virus，CMV）、柑橘鳞皮病毒（citrus psorosis
virus，CPsV）、 番 茄 环 纹 斑 点 病 毒（tomato zonate
spotvirus，TZSV）（图 3）等病害的检测［5，16，17］。同
时，由于免疫胶体金能够检测到亚细胞水平，因此
也将该技术结合超薄切片技术被用于大麦条纹花叶
病毒（barly strip mosaic virus，BSMV）、广藿香病毒
X（patchouli virus X，PatVX）、甜菜坏死黄脉病毒（beet
necrotic yellow vein virus，BNYVV）等病原在寄主细
胞中的定位［18-20］。此外，免疫电镜技术还被用于揭
示病毒编码的蛋白在病毒的复制、症状表达、移动
及传播过程中所发挥的作用［21］。
进而明确其杀菌机理。此外，该技术还应用于研究
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株 THJ609-3
（图 4）、链霉菌（Streptomyces aureus）和蓝藻细菌
（Cyanobacteria）等生防菌的抗病机理［24-26］。
V
100 nm
V ：病毒粒子
图 3 胶体金免疫电镜观察到的 TZSV 病毒粒子［5］
2 电子显微镜的类型
2.1 扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，
SEM）是继透射电镜之后发展起来的一种电子显微
镜。其原理是利用高能电子束在涂有导电材料的样
本上扫描，通过电子与样本元素互作，产生包含样
本形态学、结晶学等信息的图像。
扫描电镜与光学显微镜观察相比，具有分辨率
高、立体感强、图像直观等优点，更适于观察样品
表面的微小形态特征。Motamedi［22］和 Sadeghi［23］分
别通过 SEM 技术，观察到异株荨麻（Urtica dioica）
提取物和银纳米粒子（Ag-NPs）可分别使表皮葡萄
球 菌（Staphylococcus epidermidis） 和 金 黄 色 葡 萄 球
菌（Staphylococcus aureus）的大小、结构发生变化，
A B
5 μm 5 μm
A ：H2O 处理的柑橘叶片 ；B ：恶臭假单胞菌菌株 THJ609-3 处理的柑橘叶片 ；
C ：分生孢子 ；Bt ：细菌细胞 ；Gt ：萌发管
图 4 柑橘黑变病菌孢子的扫描电镜图片［24］
2.2 其他电子显微镜类型
除 TEM 和 SEM 这两种使用最为广泛的电子显
微镜外，高压电子显微镜（high-voltage electron mic-
roscope，HVEM），以及环境扫描电子显微镜（envi-
ronmental scanning electron microscope，ESEM）、扫描
隧 道 显 微 镜（scanning tunneling microscope，STM）、
原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）等新
型电镜技术也是植物病害研究的重要手段。
2.2.1 高压电子显微镜 HVEM 的原理与 TEM 基本
相同，但前者的加速电压为 200-1 000 kV，远高于
后者的 50-100 kV，因此所检测的切片厚度最大可
达 1 μm，制片过程较 TEM 简单［27］。该技术不仅用
于观察细菌的形态结构，还因其强穿透能力、高分
辨率、低损伤和占用空间小等优点，被用于研究植
物中亚细胞器的结构差异［28］。
2.2.2 环境扫描电子显微镜 ESEM 是一种扫描式
电子光学仪器，其样品室压力为 10-2 700 Pa 的高气
压低真空环境［29］。生物样品可不经脱水、干燥、导
电等处理而直接观察，避免了操作过程中样本的损
伤，实现了样本结构的活体观察［30］。Fan 等［31］运
用该技术研究水稻稻曲病菌（Ustilaginoidea virens，
Uv）时发现，Uv 菌丝可穿透拟南芥和烟草表皮的
角质层，并观察到其分生孢子到厚壁孢子的转变。
而 D’Aquino 等［32］ 在 柑 橘 绿 霉 病 菌（Penicillium
digitatum）的研究中，利用该技术观察经噻苯咪唑
2016,32(3) 41马丹丹等：电镜技术在植物病害研究中的应用
（thiabendazole，TBZ）处理的柑橘表皮的结构变化。
此外，Zankel 等［33］通过该技术对天竺葵叶片表皮
细胞上腺毛的顶端细胞进行观察发现，在代谢非常
活跃的细胞中内含大量的细胞器和小液泡，这为今
后深入研究植物内部生理代谢活动及植株抗病性等
都有重要意义。
2.2.3 扫描隧道电子显微镜 STM 是 IBM 苏黎世
实验室于 1981 年发明的，其主要原理是利用电子
隧道效应，在分子、甚至原子水平上观察物体表面
结构［34］。该技术可用于明确生物分子的结构特征，
从而为研究病原菌的侵染机理，以及植株的抗性提
供技术支持。如张玉忠等［35］将该技术应用于棉花
纤维的研究中，因其高分辨率可清晰地观察到纤丝
的超微结构。而 Masai 等［36］ 在研究嗜热细菌 H+-
ATPase 亚基复合物时发现，利用 STM 比 TEM 等更
适于观察 H+-ATPase 分子的结构。
2.2.4 原子力显微镜 AFM 是在 STM 的基础上发展
起来的一种新型电镜技术，与 STM 最大的差别在于
利用原子间的范德华力作用，而非量子力学隧道效
应来呈现样品的表面特征，其优势在于样品不受导
电性质的影响，且具有高分辨率，可对感染病毒后
的细胞表面形态的改变进行研究［37］。Imai 等［38］利
用 AFM 直接对 TMV 的二维成核生长过程进行了研
究，避免了 STM 样本电涂层对内部细微结构观察的
影响。而 Drygin 等［39］利用 AFM 对 TMV 高分子量
的 RNA 分子和核糖核蛋白进行研究发现，TMV 中
存在因 RNA 分子突起造成的局部裸露结构。
3 不足与改进
电镜技术在植物病害研究中发挥越来越重要的
作用。虽然各类电镜具有其特有的技术优势（表 1），
但仍面临如下问题。
表 1 电镜在植物病害研究中的应用
电镜类型 应用方向 主要优势
TEM 病原形态观察、分类和组织定位 ；观察植物超微病理结构变化 分辨率达 0.2 μm，可直接观察植物病毒
SEM 研究病原表面形态 立体感强，图像直观
HVEM 观察病原形态结构及植物亚细胞结构 与 TEM 相比，样品制备简单且损伤小
ESEM 研究病原表面形态 样品可不经处理直接观察
STM 研究病原分子的结构特征 实现分子甚至原子水平上的观察
AFM 研究病原分子的结构特征 与 STM 相比，样品材料不受导电性质的影响
3.1 负染色灵敏度问题
负染色检测技术虽可快速检测病原，但其灵敏
度受载网支持膜上病原数量和分布的影响。尤其是
在植物病原含量低时，如果直接粗提取负染则不易
检出。为此，宋敬东等［40］提出利用超速离心浓度
样本、提高载网吸附病原能力及改变病原在载网支
持膜上分布均匀度等改进方法。
3.2 TEM中样品制备问题
TEM 样品制作步骤环环相扣，任何一个环节的
失误，均会影响电镜照片的质量，即无法客观真实
的观察植物病害诱发的寄主超微结构病理变化及病
原的组织定位。为此，李博［41］针对载网支持膜污染、
切片污染及染色污染等环节提出了相应的改进措施。
而 Neweomb 等和 Kuntsche 等［42，43］建立的超低温快
速冷冻技术可有效解决常规化学固定因其作用时间
长导致的生物组织结构发生变化，从而影响超微结
构分析的难题。此外，杨瑞等［44］还根据材料的渗
透性差异，比较了不同的树脂类型，并对样品的包
埋方法进行了改进，以便获得高质量的包埋块。
3.3 免疫标记问题
胶体金标记技术在操作过程中仍存在标记效
率不高和特异性不强等问题，严重影响植物病原诊
断的准确性。为此，Roberts 等［45］对预处理条件进
行了探索，提出样品使用戊二醛单独固定、玻片用
Decon75 预处理等改进方法。
3.4 SEM的成像问题
SEM 通常捕获的是灰色图像，缺乏视觉感染
力，且图像信息贫乏。Sim 等［46，47］通过将 Canny 边
缘检测技术和现有的优化着色技术相结合，发展出
的 Canny 自适应优化技术不仅可提供彩色图像，还
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提高了图像的质量。此外，新近出现的伪映射技术，
进一步提高了 SEM 图像输出格式转换的灵活性［48］。
4 小结
自世界上第一台电镜问世至今，经过半个多世
纪的发展，电镜技术已取得了重大的突破。今后随
着多种技术的相互协作，尤其计算机技术的不断融
合，将使电镜技术得到不断的完善，同时随着电镜
样品制备技术的不断发展，电镜技术将在植物病害
研究中发挥更为重要的作用。
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（责任编辑 狄艳红）