全 文 ：第 33卷 第 1期 生 态 科 学 33(1): 93−98
2014 年 1 月 Ecological Science Jan. 2014

收稿日期: 2013-03-17; 修订日期: 2013-04-08
基金项目: 海洋局海洋可再生能源专项资金项目“海洋微藻制备生物柴油耦合 CO2减排技术研究与示范”
作者简介: 何瑞(1987—), 男, 黑龙江哈尔滨人, 硕士研究生, 从事浮游植物生理生态方面研究
*通信作者: 徐宁, 博士, 副研究员, E-mail: txuning@163.com

何瑞, 徐宁, 段舜山. 九种海洋微藻总脂含量及脂肪酸组成分析[J]. 生态科学, 2014, 33(1): 93–98.
HE Rui, XU Ning, DUAN Shunshan. Total lipid content and fatty acid composition of 9 strains of marine microalgae[J]. Ecological
Science, 2014, 33(1): 93–98.

九种海洋微藻总脂含量及脂肪酸组成分析
何瑞, 徐宁*, 段舜山
暨南大学水生生物研究所, 广州 510632

【摘要】 从广东沿海分离出 9种海洋微藻(包括 6种绿藻, 2种金藻, 1种硅藻), 在低氮并持续通入二氧化碳(1% CO2)
条件下测试其总脂含量, 对其中总脂含量超过其干重 45%的海洋微藻进行脂肪酸组成分析并优化反应条件。结果表明,
9 种海洋微藻的总脂含量存在着明显差异, 介于 8.9%—55.77%之间。其中, 海洋小球藻 Chlorella sp.、眼点拟微绿球藻
Nannochloropsis oculata、绿色巴夫藻 Pavlova viridis和微拟球藻 Nannochloropsis sp.的总脂含量超过干重的 45%, 而且, 这
4 种富油海洋微藻的 C16和 C18脂肪酸含量丰富, C16:0、C16:1(n-7)、C18:1(n-9)含量较高, C14—C18长链脂肪酸的含
量超过总脂肪酸含量的 80%。4种高脂微藻在 30 ℃高温培养条件下比生长速率均超过 1.0 d−1。研究结果可为高温富
油海洋微藻的工业化培养提供参考依据。

关键词：海洋微藻, 总脂, 脂肪酸组成
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2014.01.015 中图分类号：Q178.53 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)01-093-06
Total lipid content and fatty acid composition of 9 strains of marine microalgae
HE Rui, XU Ning*, DUAN Shunshan
Research Center of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 501632, China
Abstract：Nine species of marine microalgae, including 6 species of green algae, 2 species of Chrysophyceae, 1 species of diatom,
were isolated and identified from Guangdong coastal waters. The contents of total lipid of the nine microalgae cultured under low
nitrogen and continuous aeration (1% CO2) were determined. The compositions of fatty acid of four microalgae in which the total
lipid contents were higher than 45% of the dry weight were also analysed. The results showed that there were significant
differences in the total fat contents of the nine species of marine microalgae among which total fat contents of Chlorella sp.,
Nannochloropsis oculata, Pavlova viridis and Nannochloropsis sp. were more than 45% of the dry weight with higher contents of
C16:0, C16:1 (n-7), C18:1(n-9), and long-chain fatty acids. C14-C18 fatty acids made up 80% of the total fatty acid content in the
four oil-rich marine microalgae. The growth rates of the four oil-rich marine microalgae were above 1.0 d−1 at 30 ℃, higher than
those at 20 and 25 ℃. This study can provide references for the industrialization of high-temperature oil-rich marine microalgae.
Key words: marine microalga, total lipid, fatty acid composition
1 前言
石化燃料是目前人类社会主要的能量来源。然
而, 由于不可再生, 而且燃烧时产生温室气体等有
害气体, 因此石化燃料是不可持续的能源[1]。为了减
少温室气体排放, 发展低碳燃料是当今社会面临的
最紧迫的挑战之一。然而, 为了实现环境和经济的
可持续发展, 燃料不仅要求可再生, 也要有耦合大
94 生 态 科 学 33卷

气中二氧化碳的能力[2]。正因为如此, 寻找绿色、可
再生能源已经成为世界各国以及民众广泛关注的科
学和社会问题[3]。
微藻作为最具开发潜力的生物质能之一, 与
传统的石化燃料相比具有很多优势。它有较高的光
合效率, 可全年分批收获, 并且在生长过程中可以
吸收二氧化碳同时产生无毒的、高度可降解的生物
燃料[4], 它也可能是唯一的一种能够满足全球运输
燃料需求的新型能源[2]。特别是海洋微藻, 由于其物
种多样性高(约 5000 种), 其中不乏高油脂含量的种
类, 而且其生长利用海水, 可在盐碱地建厂养殖,
因此开发海洋微藻生物能源在不与人争粮的同时,
不与人争水、不与人争地。但是, 微藻产油也存在
着一些问题。例如生物量低, 资金成本高[1]。为了解
决这两个问题, 前人做了大量的研究。研究显示, 氮
限制可显著地影响藻类脂肪含量的积累[1], 不同氮
浓度供应对微藻脂类和叶绿素含量产生影响[5]。除
了营养条件以外, 海洋微藻的脂肪酸含量和脂肪酸
组成因藻种不同而异, 不同的培养条件也会对其产
生影响[6]。Chiu等研究发现 CO2的通入对 Nannochl-
oropsis oculata生长和油脂积累有很大的影响[7]。Yun
研究发现, 逐步增加进气中 CO2的浓度, 小球藻的生
长情况要好于直接在高浓度 CO2下的生长状况[8]。微
藻对 CO2的利用使其产生新的生物质能的同时还实
现了 CO2的减排。
生物柴油生产的成套技术涵盖多个技术环节,
是个复杂的系统工程, 主要包括: 筛选和培育生长
快、含油率高的优良藻株; 大规模培养获得可观的
微藻生物量; 将采收的微藻制成微藻生物柴油及其
它产品以实现综合利用等[9]。其中高含油率海洋微
藻的筛选是上游技术的关键步骤。因此, 本实验选
取了 9 种海洋微藻, 测定了总脂含量和脂肪酸组成,
并对其培养条件进行优化, 研究结果有望为海洋微
藻进一步开发与利用提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 藻种
从广东沿海分离了 9 种海洋微藻, 包括 6 种绿
藻: 海洋小球藻(Chlorella sp. HB1)、眼点拟微绿球藻
(Nannochloropsis oculata HB2)、杜氏盐藻(Dunaliella
salina HB5)、扁藻(Platymonas sp. HB10)、微绿球藻
(Picochlorum sp. UI)、微拟球藻(Nannochloropsis sp.
PL); 2种金藻: 叉鞭金藻(Dicrateria inornata HB11)、
绿色巴夫藻(Pavlova viridis HB3); 1 种硅藻角毛藻
(Chaetoceros sp. HB9)(表 1)。
2.2 富油海洋微藻的筛选
选用 f/2培养基, 盐度为 30。先将 9种海洋微藻
在柱状光生物反应器(Φ3)培养 15天至稳定期, 然后
转接到缺氮的 f/2 培养基, 选用柱状光生物反应器
(Φ6)培养 8 天至指数生长末期, 采用单侧日光灯提
供 24 h连续光照, 光照强度约为 200 μE⋅m−2⋅s−1 持
续通入加富二氧化碳(1% CO2)的空气, 培养温度为
约为 30 ℃。在实验周期内每天测定 OD680, 在实验
的第 0、第 7 d取藻液 1 mL , 在光学显微镜下计数。
指数生长末期的藻液经 3500 r⋅min−1离心 10分
钟收集藻细胞 , 用蒸馏水洗涤后 , 采用 ALPHR
2-4(德国)冷冻干燥机冻干获得藻粉。–20 ℃冰箱冷
冻保存, 用于测定总脂和脂肪酸组成。
2.3 富油微藻培养条件的优化
选取 4种富油微藻海洋小球藻(Chlorella sp. HB1)、
眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata HB2)、绿
色巴夫藻(Pavlova viridis HB3)、微拟球藻(Nannoch-
loropsis sp. PL), 采用 f/2培养基接种指数期微藻, 分装
于玻璃试管中(体积为 35 mL), 分别置于 20、25、30 ℃
光照培养箱中, 采用连续光照(光照约为 80 μE⋅m−2⋅s−1)
培养至指数末期。初始接种密度分别为 1.2×105、
1.3×105、8.0×104、9.7×104 个⋅mL−1。每个温度设置
三个平行。
每日测定 4种富油海洋微藻的叶绿素 a含量(活
体叶绿素荧光单位), 实验结束时取 1 mL 藻液, 在
光学显微镜下计数, 得到最大生物量。
2.4 主要测试指标
2.4.1 总脂的测定[10]
准确称取 50—100 mg 的冻干藻粉放入具
Telfnon螺口瓶盖的体积为 15—20 mL的玻璃离心管
中, 再放置一小磁力棒, 加入 2 mL 10%的二甲基亚
砜-甲醇溶液, 50 ℃水浴30 min;冰浴下磁力搅拌抽提
30 min, 3500 r⋅min−1 离心, 转移上清液到另一小瓶
中。剩余藻渣加入乙醚-正己烷(1:1, V:V)混合液 4 mL,
于冰浴下磁力搅拌抽提1小时, 3500 r⋅min−1离心, 转
移上清液到上述小瓶中。重复上述过程直到藻渣变
白。在上述合并抽提液中加入纯水, 震荡分相, 移取
有机相至另一玻璃瓶中, 用氮气吹至较小体积再移至
1期 何瑞, 等. 九种海洋微藻总脂含量及脂肪酸组成分析 95

1.5 mL塑料离心管中吹至恒重。塑料离心管恒重前
后重量之差即为总脂重量, 用以下公式计算总脂百
分含量:
总脂百分含量=(总脂重量/藻粉重量)×100%
2.4.2 脂肪酸组成分析[11]
称取 25 mg冻干藻粉放置在具 Telfnon螺口瓶
盖的体积为 15—20 mL的玻璃离心管中, 再放置一
小磁力棒, 加入 2 mL 2% H2SO4 无水甲醇: 甲苯
(90:10, V/V), 同时加入 25 μL 1% 的十七烷酸
(C17:0), 充氩气后, 再将小玻璃瓶放置于 80 ℃的
水浴加热搅拌 1.5 h, 最后分别加入 1 mL 的纯水和
正己烷, 震荡后 3500 r⋅min−1离心 3 min, 将上层有
机相转移到另一小玻璃瓶, 氮气吹干后加入 100 μL
n-hexane密封, 存留上样。样品经气相色谱-质谱联
用仪分析。
TRACE DSQ 气相色谱-质谱联用仪, AI/AS3000
自动进样器(THERMO FISHER公司), DB-5 MS30 m×
0.25 mm×0. 25 µm 毛细管柱(Agilent 公司)。
GC条件: 进样口温度250 ℃, 检测器温度250 ℃,
载气为高纯氦气(99.999%), 柱流速每分钟 1.2 mL,
进样时间 0.1 min,溶剂延迟 4 min, 柱起始温度 75 ℃,
保持 1 min, 以每分钟 30 ℃升温至 150 ℃, 然后以每
分钟 1.5 ℃升温至 250 ℃, 保持 1 min, 采用不分流
进样模式, 进样量 1 μL。
MS 条件: 电子轰击(EI)离子源, 电子能量 70 ev,
离子源温度 250 ℃, 接口温度 250 ℃, 选取全程离子
碎片扫描(SCAN)模式, 质量扫描范围为 50—500 m/z。
2.4.3 比生长速率(μ)
每日测定海洋微藻的叶绿素 a含量(活体叶绿素
荧光单位), 根据以下公式计算比生长速率:
μ=(lnFt−lnF0)/T
其中, Ft和 F0分别为经过 T天培养后的叶绿素
荧光单位和初始叶绿素荧光单位。
3 结果与讨论
3.1 9种微藻的总脂含量
9种海洋微藻收获时的细胞密度、比生长速率、
样品干重、总脂含量如表 1所示, 由表 1可知, 不同
的微藻在相同培养条件下干重、油脂的积累量具有
明显的差异, 9种微藻最高干重为微拟球藻 0.27 g⋅L−1，
最低为眼点拟微绿球藻 0.09 g⋅L−1, 总脂含量在 8.9%
—55.77%之间, 有四种绿藻总脂含量超过 45% dw（干
质量）, 其中海洋小球藻和眼点拟微绿球藻的总脂含
量最高, 分别位 55.35% dw和 55.77% dw, 扁藻的总
脂含量最低, 仅为 8.9% dw。预实验用全氮的 f/2培
养基在不通气的条件下, 其它培养条件不变对海洋
小球藻、绿色巴夫藻、微拟球藻培养 15天至稳定期,
测定总脂含量, 分别占其干重的 27.49%、18.26%、
22.43%。
由此可知, 通气与低氮培养明显提高了海洋微
藻的总脂含量。但是干重相对较低, 可能是由于接
种浓度低, 培养时间短所致。小球藻、微绿球藻、
叉鞭金藻和绿色巴夫藻的总脂含量均高于蒋霞敏[12]
所测的, 可知缺氮和通气培养对于藻类积累油脂有
显著促进作用。杜氏盐藻高于陈昱[13]测的 7株杜氏
藻, 但是干重却低于这 7 株杜氏藻, 可能是不同藻
株之间的差异所导致。
表 1 9种海洋微藻的总脂含量
Tab. 1 The total lipid contents of 9 strains of marine microalgae
藻种 比生长速率/ d−1 收获时密度/(×106 个·mL−1) 总脂含量占干重的/%
海洋小球藻(Chlorella sp.) 0.63 16.1 55.35
眼点拟微绿球藻(N. oculata) 0.68 6.0 55.77
绿色巴夫藻(P. viridis) 0.67 21.3 46.08
杜氏盐藻(D. salina) 0.62 2.6 19.51
角毛藻(Chaetoceros sp.) 0.41 4.16 22.24
扁藻(Platymonas sp.) 0.44 0.47 8.90
叉边金藻(D. inornata) 0.44 3.9 35.97
微绿球藻(Picochlorum sp.) 0.52 29.3 27.35
微拟球藻(Nannochloropsis sp.) 0.48 24.0 49.75

96 生 态 科 学 33卷

3.2 脂肪酸组成分析
适宜用作生物柴油的油脂的脂肪酸组成, 以直
连的 C16或 C18饱和或单不饱和脂肪酸为最佳。通
过对 9种产油微藻的脂肪酸组成(表 2)进行分析, 可
以看出 C16:1(n-7), C16:0, C18:1(n-9)为它们的主要
脂肪酸成分, 其中 C14-18长链脂肪酸的含量分别占
总脂肪酸的 91.79%, 86.39%, 83.26%, 83.58%。4种
海洋微藻都含有一定量的 EPA(C20:5), 但是 DHA
(C22:6)的含量都很少甚至没有。
从所测的 4 种高脂绿藻的脂肪酸组成上看, 与
蒋霞敏和王明清[14]所测的结果基本一致, 4 种绿藻
的脂肪酸中含有丰富的 16:0, 16:1(n-7), 18:1(n-7),
这一点与卢丽娜[15]所测的含有很高 17:0, 22:1n9, 24:1,
18:2n6t:18:3n6, 20:2, 20:4n6, 20:5n3, 22:6n3不一致。
这 4 种高脂绿藻都含有极少量的 20:5(n-3), 与俞
建江 [16]所测的小球藻的 20:5(n-3)含量丰富不符,
然而 22:6(n-3)和他测的结果相似, 没有或者含量
很少。
表 2 海洋微藻的脂肪酸组成(占总脂肪酸含量的百分比)
Tab. 2 Fatty acid composition of marine microalgae (% of total fatty acids)
脂肪酸
饱和饱和脂肪酸
海洋小球藻 眼点拟微绿球藻 绿色巴夫藻 微拟球藻
C10:0 0.1 0.03 — 0.05
C12:0 0.24 0.07 0.2 0.14
C14:0 6.79 2.49 6.4 5.12
C15:0 0.4 0.17 0.37 0.31
C16:0 43.07 33.55 41.4 39.25
C17:0 0.65 0.45 0.64 —
C18:0 1.53 3.36 1.73 1.64
C19:0 — 0.03 — —
C20:0 0.11 0.56 — 0.12
C23:0 — — 0.01 —
C24:0 0.01 — 0.01 —
C26:0 0.02 0.19 0.04 —
合计/% 52.92 40.9 50.8 46.63
单一不饱和脂肪酸
C16:1(n-7) 25.42 17.06 25.24 23.03
C17:1(n-7) 0.08 — 0.08 0.91
C18:1(n-9) 12.23 17.34 12.66 12.79
C20:1(n-9) 0.04 0.1 0.04 0.03
C23:1(n-9) — — 0.01 —
合计/% 37.77 34.5
38.03

36.76

多不饱和脂肪酸
C16:2(n-4) 0.08 — 0.08 —
C16:3(n-3) — 1.84 — 0.01
C18:2(n-6) 1.02 6.27 1.06 0.99
C20:2(n-6) — — 0.03 0.02
C20:3(n-7) 0.24 0.21 0.27 0.26
C20:4(n-6) 2.9 1.4 3.3 2.66
EPA 2.87 2.2 3.49 3.35
DHA — — 0.45 —
合计/% 7.11 11.92 8.68 7.29
C14-18(%) 91.79 86.36 83.26 83.58
1期 何瑞, 等. 九种海洋微藻总脂含量及脂肪酸组成分析 97


注: 小写英文字母不同者表示 0.05水平差异显著(LSD法)
图 1 不同温度对四种富油海洋微藻生长的影响
Fig. 1 Effects of different temperature on the growth of 4 oil-rich species marine microalgae

3.3 不同温度对四种富油海洋微藻生长的影响
温度对海洋微藻的生长和发育有着调节作用[17],
并且温度变化会导致微藻脂肪酸组成的变化[18]。温
度对四种高脂微藻生长的影响见下图。在 20—30 ℃
之间, 随着温度的上升四种高脂微藻的最大比生长
速率都显著增加。在 30 ℃下, 4种高脂微藻的最大
比生长速率都可以达到 1.0 d−1以上。但是在第 9天
实验结束的时候除了 Chlorella sp.外, 其他 3种微藻
的细胞密度都是 30 ℃实验组略高于 20 ℃和 25 ℃
实验组, 但是却没有显著差异。
研究结果显示, 不同种海洋微藻的总脂含量和
脂肪酸组成有较大差异。在总脂含量方面, 绿藻的
总脂含量相对较高。在脂肪酸组成方面, 4种富油海
洋微藻的饱和脂肪酸都占总各自脂肪酸总量的一半
左右, 并且以 C16:0(软脂酸又称棕榈酸)为主。四种
高脂微藻的单不饱和脂肪酸都占各自脂肪酸的 35%
左右, 以 C16:1和 C18:1为主, 并且还含有一定量的
EPA和 DHA, 有一定的营养价值。温度对海洋微藻
的生长有显著影响, 在30 ℃高温条件下 4种富油微
藻比生长速率均超过 1.0 d−1。研究结果有望为海洋
微藻的进一步开发与利用提供理论依据。
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