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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):161-167
收稿日期：2015-12-09
基金项目：国家自然科学基金青年项目（41306128），国家自然科学基金面上项目（30271017）
作者简介：孙文慧，女，硕士研究生，研究方向：牙鲆生殖与发育；E-mail ：whsunok@163.com
通讯作者：张俊玲，女，副教授，硕士生导师，研究方向：鱼类发育生物学；E-mail ：jlzhang@shou.edu.cn
牙鲆 emx1 基因的克隆及表达
孙文慧  张俊玲  施志仪  孙近近  向玉婷  陈晓武
（上海海洋大学水产与生命学院  农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海  201306）
摘 要 ： 为阐述空通气孔同源框 1（empty spiracles homeobox 1，emx1）基因在牙鲆发育中的作用，通过 PCR 技术克隆牙鲆
emx1 基因，运用 BioEdit、MEGA 等软件分析其序列结构特征，并采用荧光定量 PCR 技术分析其在牙鲆早期发育和组织分布中的
表达情况。结果成功获得一长度为 1 127 bp 的牙鲆 emx1 cDNA 序列，其中包括 708 bp 的开放阅读框，编码 235 个氨基酸。同源性
比对发现，牙鲆 emx1 基因的氨基酸序列与雀鲷和花鳉同源性最高，为 95%，与其它物种如斑马鱼、墨西哥脂鲤、原鸡、热带爪蟾、
小鼠和人的同源性分别为 87%、84%、83%、80%、72% 和 72%。系统进化树分析显示，牙鲆 Emx1 蛋白与鱼类 Emx1 紧密聚为一支。
荧光定量 PCR 显示，emx1 基因在牙鲆卵巢中的表达量丰富，精巢中次之，而在其他各组织的表达量则较低。emx1 在从原肠胚到
孵化后 10 d 的牙鲆早期发育中也发现了相对较高的表达，且在胚孔封闭和心跳期有最高的表达。结果表明 emx1 基因很可能在牙
鲆早期发育和生殖系统中发挥重要作用。
关键词 ： 空通气孔同源框 1（emx1）；牙鲆 ；cDNA 克隆 ；基因表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.023
Identification and Expression Analysis of emx1 from
Paralichthys olivaceus
SUN Wen-hui  ZHANG Jun-ling  SHI Zhi-yi  SUN Jin-jin  XIANG Yu-ting  CHEN Xiao-wu
（Key Laboratory of Genetic Resources Freshwater Aguaculture and Fisheries，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，
Shanghai 201306）
Abstract:  To explore the function of  the empty spiracles homeobox 1（emx1）gene in the development of Paralichthys olivaceus，the 
emx1 was cloned by PCR，the sequence feature was analyzed by BioEdit and MEGA software，and the expression in early development and 
adult tissues was detected by real-time quantitative PCR. The obtained emx1 cDNA was 1 127 bp，including a 708 bp open reading frame（ORF），
encoding a polypeptide of 235 amino acids. The alignment analysis of amino acid sequence discovered that the emx1 from P. olivaceus showed 
the highest 95% homology with that of Stegastes partitus and Poecilia formosa，the sequence similarities between P. olivaceus and Danio rerio，
Astyanax mexicanus，Xenopus tropicalis，Gallus gallus，Mus musculus and Homo sapiens，were 87%，84%，83%，80%，72% and 72%，
respectively. The Emx1 protein was highly homologous with that in other fish through phylogenic analysis. Real-time quantitative PCR revealed 
that the emx1 mRNA was expressed in all detected tissues of P. olivaceus. The expression of emx1 was the highest in the ovary and secondly 
highest in the testis，while relatively low in other tissues. In early development stage，i.e.，from gastrula to 10 d after hatching，a relatively 
high expression of the emx1 mRNA was also observed，and the highest expression occurred in the blastopore stage and heart-beating stage. The 
findings indicated that the emx1 played an important role in early development and gonad development stages of P. olivaceus.
Key words:  emx1 ；Paralichthys olivaceus ；cDNA cloning ；gene expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6162
空 通 气 孔 同 源 框（empty spiracleshomeobox，
emx）是人类与果蝇 ems（empty spiracles）的同源结
构域基因，含同源转录因子，在果蝇头部的早期发
育中发挥重要作用［1，2］。脊椎动物 emx 包括 emx1 和
emx2，位于同源盒基因（homeotic genes，hox）家族
的外侧，在脊椎动物发育中的大脑表达并对端脑背
侧、大脑皮层和中枢神经系统发育起关键作用［3，4］。 
在小鼠的成熟发育中，二者的表达时间与分布非常
相似，但并不完全同步。例如，Emx2 主要表达在
端脑的背侧、间脑的背侧和前侧，而 Emx1 仅在端
脑背侧表达。在小鼠胚胎中 Emx2 在 8.5 日龄就可
以检测到，而 Emx1 在 9.5 日龄的胚胎中才可以检
测到［5-8］。近年研究发现，哺乳动物 Emx2 基因在
发育中的泌尿生殖系统以及能形成排泄器官和生殖
系统的原基细胞中也有表达，并呈生殖周期性变 
化［9，10］；且在子宫内膜上皮细胞中是一种必不可少
的增殖抑制基因［11］。缺乏 Emx2 可使小鼠患特纳综
合症即性腺发育不完全［12］。这些研究表明 emx2 在
泌尿生殖系统的发育和分化过程发挥重要作用，而
对于 emx1 的研究目前仅限于大脑皮层及神经系统，
对生殖中的作用研究甚少。
牙鲆是一种重要的海水经济鱼类，雌性个体明
显大于雄性个体［13］，有关牙鲆性别决定和生殖调控
的分子调控机制研究备受重视。我们先前的研究鉴
定了牙鲆 emx2 基因并对其在牙鲆中的表达进行了研
究，发现 emx2 基因在牙鲆神经胚时期表达量最高，
而在随后的胚胎发育期和早期仔鱼中表达水平逐渐
降低，同时其在牙鲆成鱼的脑、性腺包括卵巢和精
巢中均有表达，尤其在卵巢中的表达量最高［14］，表
明 emx2 基因不仅在鱼类神经系统中发挥作用，也可
能在鱼类生殖中起重要作用。因此，本研究进一步
克隆牙鲆 emx1 基因，并分析其分子特性及在牙鲆各
组织和早期发育中的表达模式，以期为阐述 emx 基
因在牙鲆生殖调控中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1  材料 
1.1.1  实验用鱼  牙鲆成鱼采集于中国水产科学研
究院黄海水产研究所，随机选取 6 条成鱼（雌雄各
3条）进行解剖取组织，包括脑、鳃、肝脏、肾脏、
卵巢、精巢、心脏、肌肉、胃、肠，DEPC 水冲洗
干净后在液氮中速冻，然后置于 -80℃保存备用［15］。
牙鲆胚胎和仔鱼采集于中国水产科学研究院北戴河
中心实验站，在（16±1）℃的过滤海水中孵化和饲
养，分别采集未受精卵（0 h）、受精卵（0.5 h）、囊
胚期（9 h）、原肠胚期（26 h）、神经胚期（42.5 h）、
胚孔封闭期（48 h）、心跳期（71 h）、出膜前（75 h）
及刚出膜（78.5 h）、孵化后 3、7、9、10、14、17、
20、23、29、36 和 41 d 仔鱼，各期样品平行取样 3组，
每组 15-30 个体［16］。
1.1.2  菌株和质粒  pMD®19-T Vector 购自 TaKaRa
公司；大肠杆菌 DH5α 均由本实验室保存。
1.1.3  主要试剂  Trizol Reagent 试剂盒购自 Invitro-
gen 公司；DNase I、RNase Inhibitor、M-MLV Rtase 等 
反转录试剂购自 Promega 公司；Gel Extraction Kit 购
自天根生化科技（北京）有限公司；2×iQTM SYBR 
Green Supermix 购自 Bio-Rad 公司。
1.2  方法
1.2.1  总 RNA 的提取和反转录  将上述各牙鲆样
品依照 Trizol Reagent 试剂盒方法提取总 RNA。总
RNA 用 Agilent 2100 Bioanalyzer 测 定 OD260/OD280 值
及浓度，P 值均在 1.8-2.0 之间。用 2% 甲醛变性琼
脂糖凝胶电泳检测 RNA完整性，确认 28S 和 18S 条
带清晰，无 RNA 降解，RNA 质量能够满足后续实
验要求，置于 -80℃保存备用。
所得总 RNA用 DNase I 处理后，按以下体系进
行反转录：在除酶离心管中加入 1 000 ng 总 RNA，
1 μL OligodT Primer（50 μmol/L），补充 DEPC 处理的
ddH2O 至 10 μL，70℃放置 10 min 后立即置于冰上
5 min ；然后加入以下试剂：5×M-MLV buffer 5 μL，
RNase Inhibitor（25 U）1 μL，M-MLV Rtase（200 U/μL）
1 μL，dNTP mixture（10 μmol/L）1 μL，补充 DEPC
处理的 ddH2O 至 20 μL ；在 PCR 仪上进行反转录，
反应条件为：42℃ 60 min，75℃ 15 min。反转录后
的 cDNA置于 -20℃保存。
1.2.2  牙鲆 emx1 的克隆  查询本实验室先前高通
量测序的牙鲆转录组文库，检索到一牙鲆 emx1 基
因的 EST 序列，根据该 EST 序列设计基因特异性
引物 emx1-F 和 emx1-R（表 1），用牙鲆各组织混
2016,32(6) 163孙文慧等：牙鲆 emx1基因的克隆及表达
合的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应条件
为：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，57℃退火 30 
s，72℃延伸 72 s，共 36 个循环；72℃延伸 10 min。
PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用 Gel 
Extraction Kit 纯化回收目的条带。将纯化产物连接
到 pMD®19-T Vector 上，16℃连接过夜后，转化到大
肠杆菌 DH5α 菌株中，经蓝白斑筛选，挑选阳性克
隆送上海生工生物工程有限公司测序。
1.2.3  序列和进化树分析  用 ORF Finder（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 预 测 牙 鲆 emx1
可能的开放阅读框，并推测编码的氨基酸序列。
用 BioEdit 软件将得到的牙鲆 Emx1 蛋白序列和
GenBank 数据库中其他生物同源蛋白的氨基酸序
列进行比对分析。运用 MEGA 5.2 软件，采用 NJ
（Neighbor-Joining）法构建进化树。其他脊椎动物的
EMX1 氨基酸序列均从 NCBI 中 GenBank 下载，登
录号如下：雀鲷（Stegastes partitus）（XP_008277178）；
斑 马 鱼（Danio rerio）（NP_937787.1）；半 滑 舌 鳎 
（Cynoglossus semilaevis）（XP_008314554.1）； 花 鳉 
（Poecilia formosa）（XP_007569597.1）；海龟（Chelo- 
nia mydas）（XP_007072072.1）；罗非鱼（Oreochro-
mis niloticus）（XM_003447768.2）； 牛（Bos taurus） 
（NP_001179152.1）；原鸡（Gallus gallus）（XP_001-
232151.2）；墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）（XP_ 
007236486.1）；热带爪蟾（Xenopus tropicalis）（NP_ 
001005459.1）；智人（Homo sapiens）（NP_004088.2）；
小鼠（Mus musculus）（NP_034261.1）。
1.2.4  定量 PCR  设计高效特异的引物（表 1），在
CFX96TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-
Rad，USA）上进行定量检测。首先制备目的基因和
内参基因（18S）的标准曲线。20 μL 的反应体系包
括了 1 μL cDNA（从 100 ng-0.1 ng，10 倍梯度稀释）， 
0.4 μL 的 特 异 性 引 物（qemx1-F 和 qemx1-R），10 
μL 的 2×iQTM SYBR Green Supermix 和 8.2 μL 的
ddH2O。反应条件为：95℃ 1 min ；95℃ 10 s，61℃ 
15 s，并随之采集荧光 40 次，然后进行熔解曲线的
扩增。标准曲线结果显示目的基因和内参基因的 R
值均大于 0.99，相应的扩增效率（E）均介于 95%-
100%之间。随后对所有样品进行定量检测，PCR反
应体系和条件同上，实验设 3个重复。
1.2.5  统计分析  牙鲆 emx1 mRNA的表达水平采用
2-ΔΔCt 法计算，其数值用平均值 ± 标准误（x
-
±s）
表示，n=3。牙鲆各发育时期以未受精卵中的相对 
mRNA 量为对照，牙鲆不同组织以肝脏中的相对
mRNA量为对照。统计分析采用 SPSS 17.0 软件中的
单因素方差分析（one-way ANOVA），使用 Dunnetts 
T3 test 进行比较，当 P<0.05 时表示差异显著。
表 1 用于 PCR 扩增的引物序列
引物名称 序列（5-3）
emx1-F  GCACTGTTGAGTTCTGTAGCA
emx1-R GATGGAGGTTGACGTTGTTTC
qemx1-F TGATGTTTTCGTCTGCGGGGA
qemx1-R ACGGTGAGGGAGGGGTGGTTC
q18s-F CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG
q18s-R CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG
2 结果
2.1  牙鲆emx1的克隆及结构分析
以牙鲆总 RNA 为模板，通过 PCR 克隆得到一
段长 1 127 bp 的 cDNA 序列，与目的序列大小一致。
经生物信息学分析，该序列包括长 708 bp 的开放阅
读框（Open reading frame，ORF），编码 235 个氨基
酸，含 278 bp 的 3 非翻译区（3 untranslated region，
3-UTR）和 141 bp 的 5-UTR（图 1）。编码的蛋白
质分子量和等电点分别为 26.9 kD 和 9.74。ORF 区
的 135-195 个氨基酸是一个保守的同源蛋白结构域。
在 3-UTR 区，发现 2 个 mRNA 快速降解信号（AT-
TTA）和 1个聚腺苷酸化信号（ATTAA）。
2.2  牙鲆与其他物种之间emx1序列比对及进化树
构建
通过多物种的 emx1 氨基酸序列比较（图 2）显
示，牙鲆 Emx1 蛋白与雀鲷和花鱂的同源性最高，
均为 95%；其次是罗非鱼（90%）、斑马鱼（87%）、
墨西哥脂鲤（84%）、半滑舌鳎（79%），而与两栖
动物热带爪蟾同源性为 80%，与爬行动物海龟的同
源性为 81%，与哺乳动物人、小鼠、牛的同源性也
较高，分别为 72%、72% 和 73%。同时，Emx1 同
源结构域在脊椎动物中是高度保守的，且在所有鱼
类中达到 100%一致性。经 NJ 系统进化树分析，牙
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1
1
91
14
181
44
271
74
361
104
451
134
541
164
631
194
721
224
811
901
991
1081
* 表示终止密码子；..... 表示 mRNA快速降解信号；—表示聚腺苷酸化信号；方框中为保守的同源蛋白结构域
图 1 牙鲆 emx1 cDNA 序列及推导出的氨基酸序列
P. olivaceus
Clustal Consensus
P. olivaceus
Clustal Consensus
P. olivaceus
Clustal Consensus
P. olivaceus
Clustal Consensus
亮灰色显示的是一些物种间的不同氨基酸，方框中为保守的同源蛋白结构域
图 2 牙鲆 emx1 与其他物种的氨基酸序列比对
2016,32(6) 165孙文慧等：牙鲆 emx1基因的克隆及表达
鲆 Emx1 与所有鱼类聚为一支（图 3）。
2.3  牙鲆emx1在早期发育和成体组织中的表达
定量 PCR 结果（图 4）显示，emx1 基因在牙鲆
早期发育的各个阶段均有表达，并且多个发育时间
点差异表达显著（P<0.05）。在未受精卵、受精卵、
囊胚期 emx1 表达量很低，在原肠胚、神经胚期逐渐
升高，而在胚孔封闭和心跳期达到顶峰，在出膜和
出膜后其表达逐渐降低，但直至孵化后 10 d 仍保持
较高的表达水平；而在孵化后 14-41 d 的仔鱼中降
至很低的水平。
S. partitus
O. niloticus
P. olivaceus
P. formosa
C. semilaevis
D. rerio
A. mexicanus
H. sapiens
B. taurus
M. musculus
G. gallus
X. tropicalis
C. mydas
98
100
99
59
33
99
78
72
100
47
0.02
图 3 基于 NJ 法构建的 emx1 氨基酸序列系统进化树
字母相同表示差异不显著，字母不相同表示差异显著（P<0.05），下同
图 4 牙鲆 emx1 在早期发育中的相对表达
图 5 牙鲆 emx1 在成体组织中的相对表达
图 5显示，牙鲆 emx1 基因在所检测的组织中广
泛表达，并且不同组织中的表达差异显著（P<0.05）。
emx1 基因在卵巢中表达最高，约为肝脏中的 97 倍
（P<0.01）；其次，emx1 在精巢中也有较高的表达，
而在包括脑在内的其他各组织中的表达均较低。
3 讨论
本研究克隆得到了牙鲆 emx1 基因的 cDNA序列
并分析了其序列特征。系统进化和氨基酸同源比对
分析都表明牙鲆 emx1 基因与脊椎动物各物种均具有
较高的同源性（72%-95%），且与其他脊椎动物一
样，在牙鲆 emx1 基因中有一个高度保守的同源结构
域，该同源保守域在牙鲆和其他硬骨鱼类保持 100%
一致。这说明 emx1 在脊椎动物的系统进化过程中是
高度保守的。研究发现，该同源域参与调控众多基
因的表达，通过影响大脑皮层神经纤维的发育和成
熟来调控神经系统的发育［17］，同时也是生殖系统重
要的增殖抑制因子［18，19］。
在牙鲆早期发育中，emx1 基因从神经胚期开始
表达量急剧升高，在胚孔封闭和心跳期达到最高水
平，而在随后的胚胎期和孵化后仔鱼中其表达量逐
渐降低。从神经胚期开始的早期发育阶段是鱼类神
经系统产生、发育和完善的重要时期，此时 emx1 基
因的高表达表明其与其他脊椎动物 emx1 基因一样，
可能在神经系统的发育中具有重要作用。有较多的
研究已表明，Emx1 基因在哺乳动物发育中的大脑中
大量表达［4，5，20-22］，Emx1 和 Emx2 双重缺失的小鼠
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6166
大脑皮层会造成早期发育模式的缺陷，如海马体和
齿状回缺失，嗅球增长和纹理缺陷［23-25］。此外，与
牙鲆 emx2 在神经胚期即达到最高表达水平［14］相比，
牙鲆 emx1 的表达要相对滞后，在胚孔封闭和心跳期
才出现表达高峰，这与 Simeone 等［4］发现 Emx2 比
Emx1 在小鼠胚胎中的表达要更早更快的结果是一 
致的。
在牙鲆组织分布上，emx1 基因与先前鉴定的
牙鲆 emx2［14］相似，二者均在成体性腺中比在脑中
具有更为丰富的表达，且在卵巢中的表达量高于精
巢。Pellegrini 等［26］和 Miyamoto 等［27］报道，Emx2
基因在哺乳动物尤其是小鼠性腺包括精巢和卵巢
中均有表达，且在卵巢中表达水平相对偏高。研
究表明 Emx2 对哺乳动物的泌尿生殖系统有重要影
响，在敲除 Emx2 的小鼠中，肾脏、输尿管、性腺
和生殖道完全消失，而肾上腺和膀胱正常发育［28］，
Emx2 通过改变子宫内膜细胞的增殖以调控哺乳动物
生殖，组成型 Emx2 表达量升高会导致平均着床率
下降 40%［29］。目前有关 Emx1 基因表达的报道主要
集中在哺乳动物的神经系统和泌尿系统相关的组织
中［30］，而缺乏关于其在脊椎动物性腺中的表达及在
生殖系统中的功能研究，本研究结果提示 emx1 基因
在鱼类生殖中可能发挥着重要作用。
4 结论
本研究克隆了牙鲆 emx1 cDNA 序列，并利用定
量 PCR 技术检测了其在牙鲆早期不同发育阶段和成
鱼不同组织中的表达，结果表明 emx1 在牙鲆早期的
胚孔封闭期、心跳期及成体卵巢中表达丰富。
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（责任编辑  马鑫）