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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
在哺乳动物中，甲状腺激素（thyroid hormone，
TH）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，
IGF）系统在功能上是紧密相关的，甲状腺激素
能 调 节 小 鼠 多 种 组 织 中 IGF-I、IGF-I 受 体（IGF-I
receptors，IGF-IRs） 和 IGF 结 合 蛋 白（IGF binding
proteins，IGFBPs）的表达［1-3］，且甲状腺激素作用
于动物机体的多种效应是通过 IGF 系统介导的［1］。
越来越多的研究表明，甲状腺激素在鱼类生长和变
态发育中起重要作用［4，5］。但有关甲状腺激素对鱼
类 IGF-I 及其受体基因表达调节的相关研究，目前
收稿日期 ：2013-05-16
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31172392，41306128），上海市重点学科海洋生物学建设项目（J50701），上海海洋大学博士启动基金
项目（B-8812-11-0194）
作者简介 ：张俊玲，女，博士，副教授，研究方向 ：鱼类发育生物学及遗传育种 ；E-mail ：jlzhang@shou.edu.cn
通讯作者 ：施志仪，男，博士，教授，研究方向 ：细胞及分子生物学 ；E-mail ：zyshi@shou.edu.cn
外源甲状腺激素对牙鲆 IGF-I 及其受体基因表达的影响
张俊玲  施志仪  程琦  付元帅
（上海海洋大学 农业部淡水渔业水产种质资源重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： 采用外源的甲状腺激素（thyroid hormone，TH）分别处理变态前牙鲆仔鱼和体外培养的牙鲆胚胎细胞，通过实时定
量 PCR 检测了 TH 处理前后牙鲆胰岛素样生长因子 I（insulin-like growth factor I，IGF-I）及其受体（IGF-I receptors，IGF-IRs）基
因的表达变化。在体和离体试验结果显示，过高浓度的 TH 会降低牙鲆仔鱼和胚胎细胞中 IGF-I mRNA 的表达，通过添加 TH 抑
制剂硫脲（thiourea，TU）使仔鱼体内 IGF-I mRNA 上调 ；两种不同的 IGF-IR 对 TH 的响应是不同的，外源的 TH 能促进 IGF-IR-1
mRNA 的表达，却使 IGF-IR-2 mRNA 的表达下调。结果表明在牙鲆的生长发育中 TH 和 IGF 系统是高度相关的。
关键词 ： 牙鲆 IGF-I IGF-I 受体 甲状腺激素
The Effects of Exogenous Thyroid Hormone on Gene Expression of
IGF-I and IGF-IRs in Paralichthys olivaceus
Zhang Junling Shi Zhiyi Cheng Qi Fu Yuanshuai
（Key laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Agriculture，Shanghai 201306）
Abstract:  In Paralichthys olivaceus, the gene expressions of insulin-like growth factor I（IGF-I）and its receptors after thyroid hormone
（TH）treatment were analyzed using real-time quantitative PCR, by administration of TH to premetamorphic larvae and cultured embryonic
cells. The results in vivo and in vitro showed that the level of IGF-I mRNA dropped significantly after TH treatment, and it was up-regulated
in thiourea（TU）treated premetamorphic larvae. The two IGF-IR mRNAs exhibited different expression patterns after TH treatment. The
exogenous TH stimulated the expression of IGF-IR-1 mRNA, but obviously decreased the levels of IGF-IR-2 mRNA. These results reveal that
TH and IGF systems are highly interrelated and provide the basic information to clarify the hormone regulation mechanisms of metamorphosis in
Paralichthys olivaceus.
Key words:  Paralichthys olivaceus IGF-I IGF-I receptors Thyroid hormone
很少有报道。2003 年，Schmid 等［6］首次报道了 TH
能刺激罗非鱼肝细胞 IGF-I mRNA 表达 ；2005 年，
Pierce 等［7］却发现 TH 处理对体外培养的大麻哈鱼
肝细胞 IGF-I mRNA 表达无明显影响。
牙鲆（Paralichthys olivaceus）隶属鲽形目，是
我国重要的海水经济鱼类之一，也是变态发育、繁
殖及内分泌生理研究较为集中的鱼类物种。我们先
前的研究分析了 IGF-I 及 IGF-IRs 在牙鲆发育变态中
的时空表达谱，发现其 mRNAs 表达呈现明显的发育
性变化［8］；在变态的庸鲽（Hippoglossus hippoglossus）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期118
中也有类似的现象［9，10］；这些研究结果表明 IGF 系
统可能是鲽形目鱼类变态的重要调节因子。为更好
地理解激素调控鲽形目鱼类变态的机理，本研究采
用外源的 TH 处理牙鲆变态前仔鱼和体外培养的胚
胎细胞，应用高度灵敏的实时定量 PCR 方法通过在
体和离体试验分析甲状腺激素对 IGF-I 及其受体基
因表达的影响，旨在探讨TH与IGF系统的作用关系。
1 材料与方法
1.1 材料
牙鲆仔鱼购自中国水产科学研究院北戴河中心
实验站，胚胎细胞株由中国水产科学研究院黄海水
产研究所陈松林研究员惠赠。甲状腺激素和硫脲购
自 Sigma 公司 ；总 RNA 提取试剂盒购自 Invitrogen
公司，反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA
Synthesis kit）、实时定量 PCR 试剂盒（SYBR Premix
Ex Taq）购自 TaKaRa 公司，RNAstore 样品保存液、
DNA 分子 Marker 购自 Tiangen 公司，DNase I 购自
Qiagen 公司，DEPC 购自 Sigma 公司。DMEM 培养基、
胎 牛 血 清（FBS）、 双 抗（Penicillin，Treptonycin）、
Hepes、成纤维细胞生长因子（bFGF）购自 GIBCO
公司；0.25% 胰酶 -EDTA 购自 Invitrogen 公司；牙鲆 -
舌鳎血清自制。
1.2 方法
1.2.1 药物试验 孵化后仔鱼采用常规的轮虫 - 卤
虫喂养，整个养殖期间水温保持在 14-16℃，仔鱼
变态在孵化后 21 d 开始，36 d 结束。将上述孵化后
17 d 的牙鲆仔鱼分为 3 组 ：对照组 ；TH（0.1 mg/L）
处 理 组 ；硫 脲（thiourea，TU）（30 mg/L） 处 理 组。
药物处理期间，每天换水 2 次，每次换水 1/2，每次
换水后及时补充药物，以使整个处理过程中药物的
浓度保持不变。试验设 3 个平行组，分别在处理后
8 d 和 13 d 取样，对应于孵化后 24 d 和 29 d 仔鱼。
将取样的仔鱼先用 DEPC 水冲洗干净，在 RNAstore
中 4℃ 放置 2 d 以去除内源的 RNA 酶，然后于 -20℃
保存。
当胚胎细胞生长状态良好、铺满瓶底 90%-95%
左右时用 0.25% 的胰酶消化，传入 6 孔板中，待细
胞长满孔板时更换新鲜的培养基，同时加入 TH 溶液，
其终浓度分别为 0、50、75、100 和 200 nmol/L。试
验设 3 个平行组。药物处理 12 h 后收集细胞，PBS
清洗后迅速加入 TRizol 消化裂解，用于总 RNA 的
提取。
1.2.2 RNA 提取与反转录 取上述各样品，按照
Invitrogen 公司试剂盒方法提取总 RNA。所有 RNA
样品均用 DNase I 处理 30 min，以除去少量的基因
组 DNA 污染。然后进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检
测，28S 和 18S 两条带清晰可见 ；用紫外分光光度
法 测 RNA 样 品 的 OD 值 和 浓 度，OD260/280 值 均 在
1.90-2.05 之间。所有 RNA 样品各取 500 ng，按照
PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis kit 说 明 合 成
cDNA 第一条链。
1.2.3 实时定量 PCR 首先制备目的基因和内参
基因的标准曲线。PCR 反应在 Bio-Rad 公司 iCycler
PCR 仪上执行，反应总体积为 25 μL，包括 10 倍
梯度稀释的样品 cDNA 2 μL，400 nmol/L 基因特异
性上下游引物，12.5 μL SYBR® Premix Ex TaqTM。其
中 IGF-I 和内参 β-actin 基因反应条件为 ：95℃预变
性 4 min ；95℃解链 10 s，60℃退火并延伸 30 s，共
40 个循环 ；随后进行融解曲线的扩增。IGF-IR-1 和
IGF-IR-2 基因采用 60℃退火 15 s，然后进行 72℃延
伸 30 s，其它步骤与上相同。标准曲线显示相关系
数均大于 0.99，相应的扩增效率（E）均高于 0.95，
并且目标基因和内参基因的 M 值相差小于 0.1。
随后进行不同样品中各目的基因和内参基因的
PCR 反应，反应体系和条件同上，试验设 3 次重复。
PCR 引物序列，见表 1。
表 1 实时定量 PCR 所用引物序列
引物 序列（5-3） 扩增片段大小（bp）
IGF-I-f TGTAAGCGAGTAAATGTATCTGTG 147
IGF-I-r GGCATAAGGGATCTATGTTGAG
IGF-IR-1-f TGGGTGAGGTAAGAAATGAC 123
IGF-IR-1-r CCAAATGCTTTAGCAGGTT
IGF-IR-2-f GAGGAACTGCCGCCGTAT 118
IGF-IR-2-r GAGGGTTTGCCGTCTGGT
β-actin-f GGAAATCGTGCGTGACATTAAG 155
β-actin-r CCTCTGGACAACGGAACCTCT
1.2.4 数据分析 牙鲆变态期间仔鱼不同处理组以
正常 24 d 仔鱼中的表达量为对照，胚胎细胞不同处
理组以未加 TH（0 nmol/L）组的表达量为对照，各
2013年第11期 119张俊玲等 ：外源甲状腺激素对牙鲆 IGF-I 及其受体基因表达的影响
目的基因的相对表达量采用 2-∆∆CT 法计算，其数值
用平均值 ± 标准误（x-±s）表示，n=3。统计分析
采 用 one-way ANOVA 方 差 分 析 法， 使 用 Duncan’s
Multiple Range Test（SAS）比较各基因在不同处理组
中的表达变化，当 P<0.05 时接受差异显著。
2 结果
2.1 外源TH对仔鱼变态的影响
生长状况（图 1）显示，对照组 24 d 仔鱼处于
变态的前期，仔鱼右眼已经开始向身体左侧迁移，
冠状幼鳍继续延长 ；至 29 d 时右眼超过仔鱼头顶，
已经在身体左侧明显可见，进入变态高峰期。采用 0.1
mg/L 的外源 TH 处理变态前仔鱼，明显加速了仔鱼
变态的进程，处理后 8 d 的牙鲆仔鱼右眼已迁移至
身体左侧，冠状幼鳍消失，体表色素细胞增多，至
处理后 13 d，仔鱼基本结束变态，游泳方式也发生
了改变。而其抑制剂 TU 处理的牙鲆仔鱼眼睛未发
生迁移，冠状幼鳍延长后也没有出现凋亡现象，仔
鱼变态处于停滞状态。
增加。与此相反，外源的 TH 使牙鲆仔鱼体内 IGF-
IR-1 mRNA 水平上调，在处理后 8 d 和 13 d 仔鱼中
分别达到对照组的 1.52 和 1.76 倍（P<0.05），而 TU
则显著降低了仔鱼体内 IGF-IR-1 mRNA 的水平。
24 DAH
Control TH TU
29 DAH
24 DAH，29 DAH 分别表示孵化后 24 d 和 29 d 仔鱼，即药物处理
后 8 d 和 13 d 仔鱼
图 1 对照组、TH 处理组 和 TU 处理组的牙鲆仔鱼
2.2 外源TH对仔鱼变态中IGF-I 及其受体基因表
达的影响
运用外源的 TH 及其抑制剂 TU 处理牙鲆变态
前仔鱼，结果（图 2）表明 IGF-I 及其受体基因的转
录明显受激素水平影响。与未处理的对照组相比，
在 TH 添加后 8 d 的仔鱼中 IGF-I 转录明显降低，在
TH 处理后 13 d 仔鱼中也有所减少，但与对照组差
异不是特别明显 ；而在添加 TU 后的 8 d 和 13 d 仔
鱼中其 mRNA 水平都显著升高，分别达到对照组
的 2.0 倍和 5.8 倍（P<0.05）。同样，外源的 TH 可
以使变态期间牙鲆仔鱼中的 IGF-IR-2 转录水平下调
调，在处理后 8 d 和 13 d 仔鱼中仅达对照组的 28%
和 40%（P<0.05），而 TU 则使 IGF-IR-2 mRNA 水平
3.5
2.5
1.5
0.5
b
c
a
0.0
24 DAH 29 DAH
1.0
2.0
3.0
IGF-I Control
TH
TU
R
el
at
iv
e
ge
ne
e
xp
re
ss
io
n
le
ve
ls
b b
a
1.5
0.5
b
a
c
0.0
24 DAH 29 DAH
1.0
2.0
IGF-IR-1 Control
TH
TU
R
el
at
iv
e
ge
ne
e
xp
re
ss
io
n
le
ve
ls
b
a
c
2.5
1.5
0.5
a
c
b
0.0
24 DAH 29 DAH
1.0
2.0
3.0
A
B
C
IGF-IR-2 Control
TH
TU
R
el
at
iv
e
ge
ne
e
xp
re
ss
io
n
le
ve
ls
b
c
a
24 DAH，29 DAH 分别表示孵化后 24 d 和 29 d 仔鱼，即药物处理
后 8 d 和 13 d 仔鱼 ；不同字母表示差异显著（P<0.05），下同
图 2 TH 和 TU 处理后牙鲆仔鱼中 IGF-I 及其受体基因的
表达
2.3 外源TH对胚胎细胞中IGF-I 及其受体基因表
达的影响
图 3 显示，在外源的 TH 浓度 0-200 nmol/L 范
围 内， 低 浓 度 时， 与 正 常 组 比 较 IGF-I mRNA 表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期120
达 量 无 明 显 变 化 ；当 TH 浓 度 为 100 nmol/L 时，
IGF-I mRNA 表达量明显下调，仅为对照组的 57%
（P<0.05）；TH 浓 度 为 150 和 200 nmol/L 时，IGF-I
mRNA 表达量不再减少，与 TH 浓度为 100 nmol/L
时无明显差异。两种 IGF-IR mRNAs 则展现了不同
的表达图式。IGF-IR-1 mRNA 随着添加的 TH 浓度
增加其表达量逐渐升高，当添加的 TH 浓度上升至
200 nmol/L 时，其表达水平不再继续上升。相反，
当 TH 浓度为 50 nmol/L 时，IGF-IR-2 mRNA 表达水
平明显下调，仅为对照组的 57%（P<0.05），但继续
增加 TH 的浓度至 75、100 和 150 nmol/L 时，其水
平变化不是很明显，至 200 nmol/L 时，其表达又继
续下调，仅为对照组的 46%。
3 讨论
在生物体内，除甲状腺激素外，还有多种其他
激素的合成与分泌，并且激素间通常会相互影响，
往往会很难把握甲状腺激素单独对 IGF 表达的效应。
因此，本研究采用在体和离体试验相结合的方法分
析了外源的 TH 对 IGF-I 及其受体基因表达的影响。
此外，用作本研究实时定量 PCR 的内参基因 β-actin
在 TH 处理前后的稳定性也经过了验证，适合作为
参照基因。本研究结果表明牙鲆仔鱼和胚胎细胞
IGF-I 及两种受体基因的表达是受外源的甲状腺激素
调节的，IGF 系统很可能是牙鲆变态过程中 TH 作用
的靶系统之一。
本研究在体试验结果显示，当甲状腺激素处理
8 d 时，牙鲆仔鱼变态进入变态高峰期，此时仔鱼体
内 IGF-I mRNA 表达水平低于未处理组，至 13 d 时
仔鱼基本结束变态，外源添加的 TH 对 IGF-I mRNA
表达影响不再明显 ；但添加 TU 抑制仔鱼内源 TH 的
合成却上调了 IGF-I mRNA 的表达。先前的研究表
明在牙鲆变态期间肌质中 TH 水平迅速上升，至变
态高峰期达到最高［11，12］，而本研究在此时加入外源
的 TH，过高的 TH 水平可能是导致 IGF-I 表达降低
的原因。相反，抑制内源过高的甲状腺激素水平反
而诱导了 IGF-I mRNA 的表达。与在体试验结果较为
一致，本研究的离体试验也表明较高浓度的 TH 能
抑制体外培养的牙鲆胚胎细胞 IGF-I mRNA 的表达。
目前有关甲状腺激素对 IGF-I 表达的影响主要采用
肝细胞进行。在罗非鱼中，外源的 TH 能刺激体外
培养的肝细胞 IGF-I mRNA 的表达［6］。相反，在大
麻哈鱼［7］和银鲷［13］肝细胞中，TH 处理对 IGF-I 表
达没有明显的影响。同样，在哺乳动物中，TH 对小
鼠肝细胞 IGF-I 表达有促进作用［14］；但 TH 对猪肝
细胞 IGF-I 表达无影响［15］。本研究以及上述先前的
报道结果表明，在不同物种及不同组织细胞中 TH
对 IGF-I 表达的效应可能不同。
在基因敲除的小鼠中，敲除 TH 受体 α（TRα）
后 发 现 IGF-IR 表 达 明 显 降 低， 而 敲 除 TRβ 则 使
IGF-IR 表达增加［16］。与 IGF-I 一样，TH 发挥作用
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
a
R
el
at
iv
e
ge
ne
e
xp
re
ss
io
n
0.0 0 50
Concentrations of T3nmol/L
75 100 150 200
a
a
IGF-I
IGF-IR-I
IGF-IR-2
b b b
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
d
R
el
at
iv
e
ge
ne
e
xp
re
ss
io
n
0.0 0 50
Concentrations of T3nmol/L
75 100 150 200
c
b b
a a
1.2
A
B
C
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
a
R
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ss
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n
0.0 0 50
Concentrations of T3nmol/L
75 100 150 200
b
b b b
c
图 3 不同浓度 TH 处理后牙鲆胚胎细胞中 IGF-I 及其受体
基因的表达
2013年第11期 121张俊玲等 ：外源甲状腺激素对牙鲆 IGF-I 及其受体基因表达的影响
主要是通过与 TR 结合作用于靶基因转录而实现的。
在 牙 鲆 中 有 多 种 TH 受 体， 包 括 TRαA、TRαB 及
TRβ1 和 TRβ2，本实验室先前的研究发现这些受体
在牙鲆仔鱼变态期间的表达具有明显的时期特异性，
且其表达水平受 TH 激素的调节。在本研究中，在
体和离体试验均表明两种不同的 IGF-IR 对 TH 的响
应是不同的，外源的 TH 能促进 IGF-IR-1 mRNA 的
表达，却使 IGF-IR-2 mRNA 的表达水平降低。结合
上述小鼠基因敲除的结果，TH 对牙鲆两种不同受体
基因表达的差异性调节似乎有可能是通过与不同的
甲状腺激素受体结合而起作用的，在牙鲆变态期间
由于各种类型的 TR 及 IGF-IR 均具有时期特异性和
组织丰度不同的差异表达，进而造成了不同组织器
官对 TH 或 IGF-I 的响应不同。
目前认为，在哺乳动物中甲状腺激素对骨细胞
的作用部分是由 IGF-I/IGF-IR 信号介导［17］。IGF-I
对骨的作用是多方面的，它主要是刺激成骨祖细胞
的出现，促进成骨细胞的分化和增殖，从而促进骨
的生长发育。TH 能刺激骨细胞分泌 IGF-I，有文献
报道在甲状腺激素作用下，IGF- I mRNA 在 MC3TH-
E1 成骨细胞系的表达上升。牙鲆变态最为典型的特
征是右眼迁移，伴随着眼睛的移动，仔鱼头部脑颅
很多骨骼发生变形或重建。在两栖类变态中，TH 处
理能改变软骨和硬骨形成的次序［18，19］。Takagi 等［20］
报道，在虹鳟中 TH 参与了软骨和硬骨的生长。这
样，牙鲆变态过程中众多软骨和硬骨的生长、延长
及部分骨骼的变形与凋亡很可能也是由 TH 调控的，
TH 浓度分布具有明显的组织及时间特异性，且不同
骨骼对 TH 的敏感性也不同［21，22］。因而，我们推测
TH 对牙鲆变态期间某些骨骼的分化形成与重建极有
可能是部分通过调节 IGF-I 及其受体的表达而发挥
作用的。
4 结论
过高浓度的甲状腺激素（TH）使变态前牙鲆
仔鱼和体外培养的胚胎细胞中 IGF-I mRNA 的表达
均降低 ；且两种不同的 IGF-IR 对 TH 的响应是不同
的，外源的 TH 能促进 IGF-IR-1 mRNA 的表达，却
使 IGF-IR-2 mRNA 的表达下调。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）