全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):59-65
金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，能
引发许多严重感染。约有 30% 的正常人群长期携带
金黄色葡萄球菌，通常存在于鼻腔内或者皮肤上，
当非致病性的金黄色葡萄球菌侵染受伤的皮肤或黏
膜时，也可能引起伤口的化脓感染，甚至诱发更严
重的内脏器官感染，导致肺炎，心内膜炎及脓毒血
症等疾病［1-3］。
目前，医院主要通过使用抗生素来治疗由金黄
色葡萄球菌引起的感染，如青霉素、甲氧西林、万
古霉素、庆大霉素、左氧氟沙星及克林霉素等，但
金黄色葡萄球菌对环境的适应力极强，在短短的几
十年内先后出现了耐青霉素菌株，耐甲氧西林菌株
及耐万古霉素菌株等［4-9］。近期有文献［10］报道甲氧
西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）对青霉素的耐药
收稿日期 ：2015-10-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21272031），中央高校基本科研基金（DC201502020201）
作者简介 ：王路路，女，硕士研究生，研究方向 ：细菌双组份信号转导系统 ；E-mail ：wanglulu0813@126.com
通讯作者 ：权春善，女，博士，教授，研究方向 ：酶工程，生物化工及分子生物学 ；E-mail ：mikyeken@dlnu.edu.cn
跨膜蛋白 AgrCTM6-7C 分离纯化方法的优化
王路路1，2  权春善2  许永斌2  王冠天2  刘爽2  陈莹2
（1. 大连工业大学，大连 116000 ；2. 大连民族大学生命科学学院 大连民族大学生物技术与资源利用国家民委 - 教育部重点实验室，
大连 116605）
摘 要 ： 旨在通过优化 AgrCTM6-7C蛋白的纯化过程，获得高纯度的目的蛋白，为后续研究提供材料。详细探讨了金属离子螯
合层析缓冲液中咪唑浓度、离子交换层析缓冲液的 pH值对 AgrCTM6-7C蛋白纯化效果的影响，并研究了 β-巯基乙醇对 AgrCTM6-7C蛋
白聚集及其激酶活性的影响。经过优化后，在不影响 AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的前提下，AgrCTM6-7C蛋白在浓度和纯度上均有明显提
高，纯度可达 98%以上，产量可达 15 mg/L。
关键词 ： 金黄色葡萄球菌；AgrCTM6-7C ；纯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.009
Optimization of the Purification Method for Transmembrane Protein
AgrCTM6-7C
WANG Lu-lu1，2 QUAN Chun-shan2 XU Yong-bin2 WANG Guan-tian2 LIU Shuang2 CHEN Ying2
（1. School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116000 ；2. Key Laboratory of Biotechnology and Resource
Utilization，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Department of Life Science，Dalian Nationalities University，
Dalian 116605）
Abstract: The core objective of this paper is to obtain the protein of AgrCTM6-7C with high purity by optimizing the purification processes，
and provide the materials for further research. We investigated the influence of imidazole concentration in buffer used in the metal ion affinity
chromatography and buffer with different pH used in the ion exchange chromatography on the purification of AgrCTM6-7C. Moreover，we discussed
the effects of β-Mercaptoethanol on protein aggregation and kinase activity of AgrCTM6-7C. The optimized purification method resulted in the
obvious increase on the yield and purity of AgrCTM6-7C，producing 15 mg with about 98% purity from one-liter culture medium.
Key words: Staphylococcus aureus ；AgrCTM6-7C ；purification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.760
率已达 80% 以上，对红霉素和克林霉素的耐药率约
为 50%。耐药性金黄色葡萄球菌引起的疾病感染是
一个全球性的问题，其致病率在许多国家均出现上
涨趋势［11］，在我国，耐药性金黄色葡萄球菌引起的
疾病治病率及死亡率均呈上升趋势［12-14］，因此开发
新的抗菌药物和抗菌靶点迫在眉睫。
金黄色葡萄球菌的致病机制与其能分泌多种
细胞外毒素及胞外酶密切相关，而这些毒力因子的
协同表达受多个基因组成的复杂网络调控，过程十
分 复 杂。 研 究 表 明，agr、srr、arl、sae、lyt 和 wal
等多个双组分信号转导系统（two component signal
transduction system，TCSTS）均参与了这些毒力因子
的调控过程，其中附属基因调节系统是最主要的调
控系统，agr 系统调控金黄色葡萄球菌多种毒力因子
的表达，它是一个全局调控因子，受群体感应机制
调节［15-18］。agr 系统由组氨酸蛋白激酶 AgrC 和反应
调节蛋白 AgrA 组成［19，20］，AgrC 是有 7 个跨膜片段
的膜蛋白，含有胞外感受域，负责识别胞外信号从
而开启信号转导通路，AgrA 通过改变相关基因的表
达引发相应的生物学反应［20-23］。
信号转导通路的基础是磷酰基的转移［24］，由于
金黄色葡萄球菌组氨酸蛋白激酶 AgrC 可以捕捉胞外
信号，并且能够发生磷酸化启动信号转导过程，因
此 AgrC 的胞内域和跨膜域均被认为是极具潜力的药
物靶点。其中通过设计和筛选阻断 AgrC 和 AgrA 之
间的信号通路的抑制剂成为研究热点。
为了建立药物筛选模型必需大量获得 AgrC 蛋
白。但是全长的 AgrC 表达量低且缺乏稳定性，而
AgrCTM6-7C（残基数 134-430）表达量相对较高，同
时 AgrCTM6-7C 包含两个跨膜域，一个胞外环和一个
细胞质域，含有磷酸化的位点并且保持着本身的激
酶活性，即 AgrCTM6-7C 蛋白可以磷酸化 AgrA 开启信
号转导通路，对蛋白胞内域的功能研究没有影响，
因此选用 AgrCTM6-7C 蛋白代替全长的 AgrC 蛋白进行
相关实验。本实验详细研究 AgrCTM6-7C 蛋白分离纯
化方法，优化金属离子螯合层析中缓冲液的咪唑浓
度，离子交换层析中缓冲液的 pH 值，研究 β-巯基
乙醇对 AgrCTM6-7C 蛋白聚集度及激酶活性的影响，旨
在不影响 AgrCTM6-7C 蛋白激酶活性的前提下，提高
AgrCTM6-7C 蛋白的纯度和得率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 含 pET-28a-AgrCTM6-7C 重组质粒的大肠
杆菌（Escherichia coli）C43（DE3）由本实验室前期
构建并保存。
1.1.2 培养基及缓冲液 32Y 培养基 ：3.2%（W/V）
酵 母 浸 粉，0.8%（W/V） 蛋 白 胨，0.58%（W/V）
NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4。 实 验 中 主 要 缓
冲液配方如下 ：PBS 缓冲液 ：137 mmol/L NaCl，2.7
mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，
pH7.4，0.22 μm 滤膜过滤 ；Washing buffer ：10% 甘
油，20 mmol/L 咪 唑，5×CMC 表 面 活 性 剂， 加 入
PBS 定容至 1 L，调节 pH 至 7.0，0.22 μm 滤膜过滤；
Elution buffer：10% 甘油，500 mmol/L 咪唑，5×CMC
表面活性剂，加入 PBS 定容至 1 L，调节 pH 至 7.0，
0.22 μm 滤 膜 过 滤 ；Buffer A ：20 mmol/L Tris-HCl，
1×CMC 表面活性剂，定容至 1 L，调节 pH 至 8.0，
0.22 μm 滤膜过滤 ；Buffer B ：20 mmol/L Tris-HCl，1
mol/L NaCl，1×CMC 表面活性剂，调节 pH 至 8.0，0.22
μm 滤膜过滤 ；Brij-35 buffer ：10% 甘油，10 mmol/L
HEPES，80 mmol/L NaCl，3×CMC Brij-35（W/V），
用 1×PBS 溶解定容，0.22 μm 滤膜过滤，超声除气
泡 备 用 ；5×Protein loading buffer ：250 mmol/L Tris-
HCl，pH6.8，10%（W/V）SDS，0.5%（W/V）BPB，
甘油（体积分数 50%），5%（V/V）β-巯基乙醇。
1.1.3 试剂及材料 十二烷基二甲基氧化胺（LDAO）
购自 Affymetrix 公司；十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35）
购自 Amresco 公司 ；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）
购自 Sigma 公司 ；咪唑（超纯）购自 Sigma 公司 ；
异 丙 基 -β-D-硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（Isopropyl β-D-1-
Thiogalactopyranoside，IPTG）购自上海生工。
1.2 方法
1.2.1 AgrCTM6-7C 粗 提 液 的 制 备 AgrCTM6-7C 粗 提 液
的 制 备 过 程 如 下 ：将 含 有 pET-28a-AgrCTM6-7C 重 组
质粒的大肠杆菌 C43（DE3）以 2% 的接种量接种
于 32Y 培养基中，220 r/min，30℃培养 30 min，当
OD600 在 0.25-0.35 时，添加终浓度为 0.1 mmol/L 的
IPTG（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside），220
r/min，20℃诱导 24 h，6 300×g 离心 10 min 收集培
2016,32(7) 61王路路等：跨膜蛋白 AgrCTM6-7C 分离纯化方法的优化
养后的菌体。用 PBS 缓冲液对菌体进行重悬，使湿
菌体密度达到 100 mg/mL，添加终浓度为 1 mmol/L
MgCl2、20 mmol/L 咪唑，冰上孵育 2 h，在 800 bar
压力下，用高压细胞破碎仪（JN-3000，广州聚能生
物科技有限公司）破碎菌体，4℃，24 000×g 下离
心 30 min，收集上清，去掉沉淀中未破碎的细胞和
细胞碎片。将得到的上清液在 4℃，300 000×g 下
超高速离心 45 min，沉淀中加入 PBS 缓冲液使细
胞膜完全悬浮并向细胞膜悬浮液中加入 10× CMC
LDAO（lauryldimethylamine oxide） 进 行 过 夜 溶 解，
300 000×g 下超高速离心 35 min 得到粗提液，以备
后续实验使用。
1.2.2 金属离子螯合层析方法的优化 将 5 mL 已
处 理 好 的 填 料（Ni SepharoseTM High Performance，
GE HealthcareTM）灌入低压层析柱（Bio-Rad，型号
2.5×10 cm） 中， 先 用 Washing buffer 平 衡 10 min，
然后加入 10 mL 粗提液，在摇床上轻柔摇 5 min，使
目的蛋白与填料充分结合，然后用 4 倍柱体积（200
mL） 的 Washing buffer 对 杂 蛋 白 共 进 行 4 次 洗 脱，
最 终 用 Elution buffer 将 目 的 蛋 白 洗 脱 下 来， 收 集
用 Washing buffer 第 4 次洗脱的液体以及用 Elution
buffer 洗脱下来的目的蛋白，进行 SDS-PAGE 检测。
对 Elution buffer 和 Washing buffer 中 咪 唑 浓 度 进 行
了优化，Washing buffer 中咪唑浓度分别为 10、20、
30、50 和 100 mmol/L，Elution buffer 中咪唑浓度分
别为 200、300、400、500 和 600 mmol/L，通过电泳
检测结果确定 Elution buffer 和 Washing buffer 中最适
的咪唑浓度。
1.2.3 离子交换层析缓冲液 pH 值的优化 用离子
交换层析对由金属离子螯合层析得到的 AgrCTM6-7C 蛋
白溶液进行进一步分离纯化。先用 50 mL Buffer B
清洗阴离子交换柱（Hi Trap Q，5 mL），继而用 200
mL Buffer A 平衡柱子后将 AgrCTM6-7C 蛋白溶液灌入离
子交换柱，用 Buffer B、Buffer A 的混合液对目的蛋
白进行梯度洗脱，缓冲液中 Buffer B 的含量由 0 至
100% 递增 ；在 280 nm 波长下监测蛋白含量并收集
目标样品。由于 pH 值是决定实验效果的重要因素，
因此对缓冲液的 pH 值进行了优化，分别考察了缓
冲液 pH 值为 6.0、7.0、8.0 和 9.0 时的纯化效果。
1.2.4 β-巯基乙醇对蛋白聚集度的影响 为考虑巯
基化合物对 AgrCTM6-7C 蛋白聚集的影响，用激光粒
度 分 析 仪（horiba scientific nano particle analyzer SZ-
100，HORIBA）对蛋白样品的粒径进行测量。在 5
mL 离心管中加入 200 ng 目的蛋白，以及终浓度分
别 为 0、0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 mmol/L 的 β-巯 基
乙醇，用 Brij-35 buffer 将反应体系补足至 3 mL，混
匀后于 37℃孵育 30 min 后测量蛋白粒径大小。
1.2.5 β-巯基乙醇对 AgrCTM6-7C 蛋白激酶活性的影响
AgrCTM6-7C 蛋白的激酶活性是通过检测反应体系
中剩余的 ATP 含量来间接测定的。底物在磷酸激
酶的作用下与 ATP 发生反应，反应结束后，在反
应体系中加入甲壳荧光素，使其反应体系中剩余
的 ATP 作用，形成氧化荧光素，进而发出荧光。实
验 中 AgrCTM6-7C 蛋 白 激 酶 活 性 的 测 定 采 用 Kinase-
Glo Luminescent Kinase Assay 方 法， 具 体 实 验 步 骤
参见试剂盒说明。实验在 96 孔板中进行，反应体
系为 50 μL，含有终浓度为 10 mmol/L 的 MgCl2 和 5
μmol/L 的 ATP，0-0.20 μg 的目的蛋白，反应缓冲液
为 Brij-35 buffer，将整个体系在 37℃孵育 10 min 后
加入 50 μL 发光试剂，37℃反应 10 min 后用多功能
酶标仪检测体系的发光强度。为验证 β-巯基乙醇对
AgrCTM6-7C 蛋白激酶活性的影响，在 50 μL 反应体系
中添加终浓度为 10 mmol/L 的 MgCl2 和 5 μmol/L 的
ATP，200 ng 的目的蛋白以及不同浓度梯度的 β-巯
基乙醇，测定方法同上。
2 结果
2.1 金属离子螯合层析缓冲液中咪唑浓度的优化
实验考察了不同咪唑浓度对杂蛋白洗脱效果的
影响。收集各咪唑浓度 Washing buffer 洗脱过程中，
最后一次洗脱液检测洗脱效果，根据电泳检测结果
确定 Washing buffer 中的最适咪唑浓度。纯化后检
测结果（图 1-A）显示，当 Washing buffer 中咪唑浓
度 为 10 mmol/L 和 20 mmol/L 时， 用 4 倍 柱 体 积 的
Washing buffer 对杂蛋白进行洗脱后，经检测洗脱液
中杂蛋白的含量仍旧相对较高，而 Washing buffer 中
咪唑浓度分别为 50 mmol/L 和 100 mmol/L 时，经检
测洗脱液中都不同程度的含有目的蛋白。由于膜蛋
白本身表达量就不高，而提纯过程中的损失将使目
的蛋白的得率进一步下降，这不利于后续的精制，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.762
综合考虑确定 Washing buffer 中的最适咪唑浓度为
30 mmol/L。对 Elution buffer 中咪唑浓度进行优化，
如图 1-B 所示，图中泳道 2、3、4 分别代表 Elution
buffer 中的咪唑浓度为 400、500 和 600 mmol/L，此
时 Elution buffer 将目的蛋白洗脱下来的同时也将洗
脱下来大量的杂蛋白，严重影响目的蛋白的纯度。
Elution buffer 中的咪唑浓度为 200 mmol/L 时（泳道
1），因咪唑浓度较低，不能将目的蛋白完全洗脱下
来。Elution buffer 中的咪唑浓度为 300 mmol/L（泳道
5）时，可以将大多数目的蛋白洗脱下来，但并未发
现有明显的杂蛋白被洗脱下来。因此综合以上因素
选定 Elution buffer 中最适咪唑浓度为 300 mmol/L。
kD
70
50
35
25
20
MA 1 2 3 4 5
kD
70
50
35
25
20
MB 1 2 3 4 5
（A）1-5 ：用 200 mL 咪唑浓度分别为 10、20、30、40、50 mmol/L 的 Wash-
ing buffer 对样品中杂蛋白进行洗脱 ；M ：Protein marker。（B）1-5 ：咪唑浓
度分别为 200、400、500、600 和 300 mmol/L 的 Elution buffer 对目的蛋白进
行洗脱 ；M ：Protein marker
图 1 Washing buffer（A）和 Elution buffer（B）缓冲液
咪唑浓度对蛋白分离效果的影响
M 1 2
80
kD
60
50
40
30
1 ：缓冲液中咪唑浓度优化之前 AgrCTM6-7C 的纯化结果 ；2 ：优化缓冲液中咪
唑浓度后 AgrCTM6-7C 的纯化结果 ；M ：蛋白 marker
图 2 咪唑浓度优化前后的 AgrCTM6-7C 蛋白分离效果图
白进行进一步的分离纯化。
2.2 离子交换层析缓冲液pH值的优化
分别利用 pH 值为 6.0、7.0、8.0 和 9.0 的缓冲
液对蛋白进行分离纯化，不同 pH 值的缓冲液纯化
结果如图 3-A 所示。对出峰部分的样品进行 SDS-
PAGE 检测，并浓缩收集，通过蛋白的纯度和得率
等因素的综合考虑，发现当缓冲液中 pH 值为 8.0 时，
蛋白的得率最高，纯度也相对较好，因此选定缓冲
液的最适 pH 值为 8.0。离子交换层析缓冲液 pH 值
为 8.0 时根据峰谱图，取吸收值较高的样品 1、2 进
行电泳检测，结果如图 3-B 所示，纯化后的蛋白条
带单一杂蛋白较少，但分子量为 70 kD 的位置始终
出现明显的条带，分析可能是目的蛋白 AgrCTM6-7C 的
二聚体，而蛋白二聚体的存在对其结晶等后续实验
的影响较大。β-巯基乙醇是一种常见的还原剂，用
于保护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会形成
错误的二硫键，推测 β-巯基乙醇可能会抑制蛋白二
聚体的形成，因此在纯化过程中添加 β-巯基乙醇以
试图解决该问题。
2.3 β-巯基乙醇对蛋白聚集的影响
在蛋白溶液中添加不同浓度的 β-巯基乙醇，孵
育后对目的蛋白的粒径大小进行测量，结果（图
4） 显 示， 随 着 β-巯 基 乙 醇 浓 度 的 增 加， 目 的 蛋
白的粒径逐渐降低，当 β-巯基乙醇的浓度大于 1.5
mmol/L 后蛋白粒径大小趋于平稳无明显变化。在
纯化 AgrCTM6-7C 蛋白的过程中一组添加终浓度为 1.5
mmol/L 的 β-巯基乙醇，另一组对照实验不添加 β-巯
基乙醇，经金属离子螯合层析和离子交换层析分离
对金属离子螯合层析缓冲液优化前后的分离效
果（图 2）显示，优化后的溶液中杂蛋白的含量明
显降低，蛋白的纯度得到了一定程度的提高，但该
纯度还不能满足后续实验要求，因此还需对目的蛋
2016,32(7) 63王路路等：跨膜蛋白 AgrCTM6-7C 分离纯化方法的优化
纯化，用 SDS-PAGE 对纯化后的蛋白进行检测，结
果如图 5 所示。图中可见，泳道 2 中目的条带单一，
杂蛋白含量极低，纯化效果很好，而泳道 1 中在二
倍分子量的位置仍有明显的条带，由此可证明 β-巯
基乙醇可抑制二聚体的形成，在纯化过程中添加适
量的 β-巯基乙醇可以防止二聚体的形成，纯度得到
了很大提高，可达 98% 以上，产量可达到 15 mg/L。
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 20 40
1
2
60փ〟mL੨᭦٬A 280/mAU 80 100A
kD
M 1 2
80
60
40
30
20
B
A ：利用不同 pH 值的缓冲液对 AgrCTM6-7C 蛋进行的离子交换层析的结果图。
黑色 ：pH 6.0，红色 ：pH 7.0，蓝色 ：pH 8.0，绿色 ：pH 9.0。B ：经离子交
换层析纯化后 AgrCTM6-7C 蛋白的电泳检测结果图
图 3 AgrCTM6-7C 蛋白的离子交换层析图（A）及纯化 SDS-
PAGE 电泳图（B）
140
120
100
80
60
40
20
0
0.0 0.5 1.5 2.5 3.02.01.0
β-ᐟส҉䞷mmol·L-1㋂ᖴnm
图 4 β-巯基乙醇对 AgrCTM6-7C 蛋白粒径大小的影响
kD
M 1 2
80
60
40
30
1 ：分离过程未添加 β-巯基乙醇 AgrCTM6-7C 蛋白的纯化结果 ；2 ：分离过程中
添加 β-巯基乙醇 AgrCTM6-7C 蛋白的纯化结果 ；M ：Protein marker
图 5 β-巯基乙醇对 AgrCTM6-7C 蛋白纯化效果的影响
2.4 β-巯基乙醇对AgrCTM6-7C蛋白酶活性的影响
为了检测目的蛋白是否具有激酶活性，在反应
体 系 中 分 别 添 加 了 0、0.05、0.10、0.15 和 0.20 μg
的目的蛋白，并进行激酶活性的检测。检测结果（图
6）显示，随着蛋白含量的增多，荧光值呈下降的趋
势，这表明反应体系中剩余的 ATP 含量逐渐降低，
即随着蛋白含量的增加蛋白的激酶活性逐渐增大，
因此可以证明目的蛋白具有激酶活性。为考察 β-巯
基乙醇对 AgrCTM6-7C 激酶活性的影响，向反应体系中
分别添加 200 ng AgrCTM6-7C 蛋白，以及终浓度分别为
0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 mmol/L 的 β-巯基乙醇，反
应完全后检测激酶活性。结果显示，随着 β-巯基乙
醇浓度的增加，蛋白的激酶活性呈微弱的先增加后
降低的趋势，当浓度为 1.5 mmol/L 时，蛋白的激酶
活性最高，但数据整体浮动较小，故 β-巯基乙醇对
蛋白激酶活性的影响并不显著。综上可知，在分离
纯化的过程中添加终浓度为 1.5 mmol/L 的 β-巯基乙
醇对蛋白的激酶活性无明显影响，但是却可以明显
抑制二聚体的形成。
3 讨论
金黄色葡萄球菌其耐药性菌株的出现也为抗生
素用药带来了较大困难，进而导致病死率的升高。
为了降低耐药性菌株的增长率以及延长抗生素的使
用寿命，在合理使用抗生素的同时，急需研发新的
抗菌药物及药物靶点［12-14］。金黄色葡萄球菌 agr 系
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.764
统与其致病性、耐药性和细胞的基本生理功能等密
切相关，若能探明 agr 系统的信号转导机理，将对
金黄色葡萄球菌的耐药性研究产生重大影响。而金
黄色葡萄球菌组氨酸蛋白激酶 AgrC 作为 agr 系统的
重要组成部分，在该双组分信号转导系统中发挥着
重要的作用。目前组氨酸激酶 AgrC 正成为药物靶点
研究的热点，但是进展相对缓慢，原因是 AgrC 稳定
性太低，使 AgrC 蛋白的分离纯化相对困难，从而导
致其三维结构至今仍未能确定，对组氨酸激酶 AgrC
结构功能研究带来了较大难度。本实验以 AgrCTM6-7C
作为模式蛋白，对 AgrCTM6-7C 蛋白的分离纯化过程进
行了多方面的优化，为后续实验研究奠定了基础。
目 的 蛋 白 AgrCTM6-7C 在 C 末 端 带 有 组 氨 酸 标
签，可与过渡金属离子 Ni2+ 形成配位相互作用，进
而实现蛋白的分离纯化。本实验选用 Ni-NTA 作为
介质纯化蛋白。金属离子螯合层析是蛋白纯化过程
中较为常用的方法，有研究表明咪唑的浓度对蛋白
纯化效果影响很大，洗脱杂蛋白时咪唑浓度过低会
导致纯化后杂蛋白含量过高，蛋白纯度降低，收集
目的蛋白时，咪唑浓度过低会导致目的蛋白不能完
全被收集，而咪唑浓度过高又容易带入过多的杂蛋
白［25，26］， 因 此 有 必 要 对 Washing buffer 和 Elution
buffer 中咪唑的浓度进行优化，以提高目的蛋白的
纯度及得率。通过对实验结果的综合分析，最终选
定 Washing buffer 中咪唑的最适浓度为 30 mmol/L，
Elution buffer 中最适咪唑浓度为 300 mmol/L。金属
离子螯合层析的缓冲液经优化后，目的蛋白 AgrCTM6-
7C 的纯化效果有了明显提高，杂蛋白大大减少，但
仍有部分杂蛋白未被分离出去，因此利用离子交换
层析技术对目的蛋白进行进一步的分离纯化。
离 子 交 换 层 析 是 一 种 用 不 同 离 子 浓 度 梯 度
的盐溶液对目的蛋白进行洗脱的分离技术。根据
AgrCTM6-7C 氨基酸序列，通过 ExPASy Param tool 软件
在线分析表明，AgrCTM6-7C 的等电点 pI 约为 5.0，理
论上当缓冲液的 pH 值大于蛋白等电点时，蛋白带
负电，可与阴离子交换柱中的填料结合，从而与杂
蛋白分离开来，实现目的蛋白的分离纯化。缓冲液
中盐离子浓度和 pH 值是影响纯化效果的主要因素，
由于过高的盐离子浓度不利于后续实验，因此盐离
子浓度最终选定可以将目的蛋白置换出来的最低浓
度。通过对纯化效果的分析，优化后选定缓冲液的
最适 pH 值为 8.0。
AgrCTM6-7C 蛋白经过金属离子螯合层析和离子
交换层析后得到的目的蛋白中杂蛋白含量很低，但
在二倍分子量的位置始终有一条明显的杂带，且含
量相对较多，根据分子量大小分析可能为 AgrCTM6-7C
蛋白的二聚体。疏水作用的存在及二硫键的形成是
导致蛋白形成二聚体的主要原因，破坏疏水作用常
用的方法是使用尿素等强变性剂，但尿素引起的蛋
白质变性有时很难完全复性。有文献［27-29］报道，在
现代生物技术里，在下游产品的分离、纯化过程中 β-
巯基乙醇的应用均十分广泛。断裂二硫键常用的方
法主要是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法，目前
普遍使用的方法是用 β-巯基乙醇处理蛋白样品，以
抑制二硫键的形成，防止蛋白形成多聚体。为避免
目的蛋白形成二聚体，在实验过程中的缓冲液中添
加了一定量的 β-巯基乙醇。结果表明当 β-巯基乙醇
浓度达到 1.5 mmol/L 时，目的蛋白的粒径最小，因
此在纯化蛋白的过程中添加终浓度为 1.5 mmol/L 的
β-巯基乙醇，经电泳结果分析可有效抑制目的蛋白
二聚体的形成。激酶活性测定结果证明，1.5 mmol/L
的 β-巯基乙醇并不影响 AgrCTM6-7C 蛋白的激酶活性。
4 结论
本研究优化了 AgrCTM6-7C 蛋白的分离纯化方法，
最终在不影响 AgrCTM6-7C 蛋白激酶活性的前提下，显
著提高 AgrCTM6-7C 蛋白的纯度和得率，纯度可达 98%
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
㦗ݹᕪᓖ
0 0.05 0.15 0.200.10
AgrCTMC-TC㳻ⲭਜ਼䟿/μg
图 6 AgrCTM6-7C 蛋白激酶活性的测定结果
2016,32(7) 65王路路等：跨膜蛋白 AgrCTM6-7C 分离纯化方法的优化
以上，产量可达 15 mg/L。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）