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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):203-209
环 己 胺（cyclohexylamine， 化 学 式 C6H13N） 又
称六氢苯胺，是一种重要的精细化工中间体，用于
生产金属缓蚀剂、杀菌杀虫剂、橡胶硫化促进剂和
防老剂等。在生产和使用过程中，环己胺被释放到
环境中，可通过呼吸和皮肤进入人体，实验已证实
该化合物有致癌性［1］。由于环己胺在工业生产上的
广泛应用和对人体的明显危害性，研究对环己胺有
降解作用的微生物并了解其分子机制，是消除环己
胺对环境污染和残留的有效途径之一。
目前报道的以环己胺为碳氮源生长的纯培养物
仅有两株，一株是 Iwaki 等［2］分离筛选到的革兰氏
阳性菌 Brevibacterium oxydans IH-35A，另一株是由
收稿日期 ： 2015-08-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270112），微生物代谢国家重点实验室（上海交通大学）开放课题（MMLKF14-06）
作者简介 ：毛灵琪，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：qzjsmlq@163.com
通讯作者 ：闫达中，男，博士，副教授，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：yandz6808@163.com
Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 基因无痕敲除方法
的建立
毛灵琪  李存治  闫达中
（武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023）
摘 要 ： 旨在建立一种适合环己胺降解菌 NyZ12 基因无痕敲除的可靠方法。通过 overlapping PCR 技术将目的基因上下游
同源臂融合并克隆到自杀载体 pEX18km 上，将重组质粒转化到大肠杆菌 S17 pir 中，再通过接合转移到假单胞菌 NyZ12 菌株内，
经 pEX18km 质粒上 sacB 基因的反向筛选得到突变株并通过 PCR 方法和测序鉴定。结果显示，成功构建了假单胞菌 NyZ12 菌株
orf4637 的基因突变株（NyZ12Δ4637）。通过自杀载体同源重组可以成功获得敲除的无痕突变株，且突变株基因组上没有任何抗性
筛选标记残留，为环己胺降解菌 NyZ12 基因功能研究提供了可靠的基因敲除技术。
关键词 ： 基因敲除 ；自杀载体 ；同源重组 ；结合转移
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.027
A Method for Constructing Unmarked Deletion Mutants of
Pseudomonas plecoglossicida NyZ12
MAO Ling-qi LI Cun-zhi YAN Da-zhong
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023）
Abstract: This study aims to establish a practical method for an unmarked gene knockout of Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 that
degrades cyclohexylamine，which is significant for further studying the molecular mechanism of it degrading cyclohexylamine. The upstream
and downstream flanking DNA fragments of the target gene were fused by overlapping PCR，and then cloned into the suicide vector pEx18km.
The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain S17 pir and then transferred into NyZ12 by conjugation. The mutants by
inverse screening sacB gene in pEx18km was identified by PCR and sequencing. The mutant NyZ12Δ4637 from NyZ12 strain orf4637 were
successfully constructed. In conclusion，the unmarked gene-knockout mutant was acquired using homologous recombination of suicide vector，
and there was no resistance residual of screening marker on the genome of the mutant. This study provides a reliable gene-knockout technology
for investigating the genetic functions of NyZ12.
Key words: gene knockout ；suicide vector ；homologous recombination ；conjugative transfer
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4204
中国科学院武汉病毒研究所周宁一［3］研究组分离的
革兰氏阴性菌 Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。
NyZ12 是一株能够利用环己胺作为唯一碳源、
氮源生长的革兰氏阴性菌株，根据其 16S rRNA 基
因序列分析为假单胞菌属，鉴定为变形假单胞菌
Pseudomonas plecoglossicida NyZ12。 这 与 Iwaki 等 分
离筛选到能降解环己胺的革兰氏阳性短杆菌 Breviba-
cterium oxydans IH-35A 不同，也是目前为止国内第
一次报道能降解环己胺的细菌。
本实验室对该菌株进行全基因组测序，获得全
基因组信息［4］。通过对比分析，预测 orf4637 基因
可能与环己胺降解过程有关。研究基因功能的重要
方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化，
以推测某个基因在生长过程中起到何种作用。其中
最直接的方法是将目的基因敲除，这样可以保证被
研究的基因完全失活［5］。因此，为了进一步研究基
因 orf4637 的功能，本研究采用无痕敲除技术构建
Δ4637 基因敲除体系。通过 overlapping PCR 技术［6］
将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体上，
再将构建的敲除载体转移至受体菌，利用同源重组
原理取代基因组上序列相同或非常相近的基因并使
后者完全丧失功能［7］。旨在为后期对敲除突变体
NyZ12Δ4637 进行表型研究，确定其在生长中是否起
关键作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 假单胞菌 NyZ12（AmpR）；E.coli
S17 pir 菌株（StrR）；pGEM-T Easy 载体（AmpR）；自
杀质粒 pEX18km（KanR），所用抗生素浓度为氨苄
青霉素 Amp（100 g/mL），链霉素 Str（10 g/L），卡
那霉素 Kan（50 g/L）。
1.1.2 主要试剂 5×TransStart FastPfu buffer、Tra-
nsStart FastPfu DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs、
限制性内切酶 EcoR I 和 Sal I，T4 DNA Ligase 均购自
TaKaRa 公司 ；质粒快速提取试剂盒、PCR 产物凝胶
回收试剂盒（离心柱型）、基因组提取试剂盒均购自
上海捷瑞生物工程有限公司。
CCMB80 溶 液 ：KAc（1 mol/L pH8.0）1 mL，
0.891 g NaCl，Glycerol 10 mL，MnCl2·4H2O（1 mol/L）
1 mL，MgCl2·6H2O（1 mol/L）1 mL， 定 容 至 100
mL，过滤除菌，冰上储存备用。
LB 培养基 ：NaCl 1 g，Tryptone 1 g，Yeast Ext-
ract 0.5 g，加水定容至 100 mL，121℃下高温灭菌
20 min。
环己胺无机盐培养基 ：KH2PO4 1.5 g，Na2HPO4·
12H2O 3.8 g，定容至 1 L，121℃高温灭菌 ；再依次
加入高温灭菌的 10 mL 1 g/L CaCl2·2H2O ；10 mL 过
滤除菌的 5 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L MnSO4·4H2O
及 0.5 g/L FeSO4·7H2O 的混合体系，10 mL 过滤除
菌 1 mol/L 的环己胺盐酸盐溶液（pH7）。
RGMC ：1% Tryptone ；0.1% Yeast extract ；0.8%
NaCl ；0.1% glucose ；5 mmol/L MgCl2 ；5 mmol/L
CaCl2 。其他生化试剂均从国药集团化学试剂有限公
司购买的分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 同源臂扩增 设计两对引物分别扩增 orf4637
基因上游约 700 bp 及下游约 900 bp 大小同源臂，引
物序列见表 1。以环己胺降解菌 NyZ12 基因组 DNA
作为模板，引物对分别为 P1/P2 和 P3/P4 进行 PCR
反 应，PCR 体 系 如 下 ：模 板 0.3 μL，FastPfu 酶 1
μL，5×FastPfu buffer 10 μL， 上 下 游 引 物 各 1 μL，
加无菌去离子水至 50 μL。扩增程序为 ：98℃ 2 min，
98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，30 个循环 ；72℃ 5
min。凝胶电泳回收 PCR 产物。
表 1 用于 4637 突变株构建及鉴定的引物
引物名称 序列（5-3） 扩增产物
P1 AGAATTCAATCACAAGGGTGATCGGC 上游同源臂
P2 ACACGTCGCCTGAAATCCGGGCCGAAGATG
P3 TCGGCCCGGATTTCAGGCGACGTGTTCGACG 下游同源臂
P4 AGTCGACTCAGCCTTTACGCAGGTGCA
E1 AGAATTCCATGAACAAGAAAAACCGCCA 扩 orf4637
E2 CAAGCTTATGCTGCCTCCTTGTCTCAGT 基因引物
1.2.2 融合 PCR 反应 纯化后的同源臂片段 1∶1
混合，将混合 DNA 片段作为模板进行融合 PCR，引
物对为 P1/P4。PCR 体系和扩增程序同上，延伸时
间延长至 1 min，将纯化 PCR 产物加“A”后克隆到
pGEM-T Easy 载体上，酶切鉴定连接正确大小片段
的克隆并测序。
2016,32(4) 205毛灵琪等 ：Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 基因无痕敲除方法的建立
1.2.3 缺失突变载体的构建 分别以 EcoR I 和 Sal I
对 pEX18km 质粒和连有目的片段的 pGEM-T Easy 载
体进行双酶切并经过凝胶电泳回收。将酶切后的质
粒和目的片段按适当的比例混合，加入 T4 连接酶在
16℃连接过夜，再将连接产物转化到 E.coli S17 pir
感受态细胞中，转化产物在 37℃，180 r/min 的 LB
培养基中活化 1 h 后，取 100 μL 涂布于 LB 平板上
（Str R，Kan R），37℃培养至出现单菌落。通过酶切
鉴定筛选出含有融合片段的重组质粒。
1.2.4 结合转移［8］和单交换 将含重组质粒的 E.coil
S17 pir 接种在 LB 培养基中，环己胺降解菌 NyZ12
接种在无机盐培养基中。分别在 37℃和 28℃，170
r/min 培养至 OD600=0.5-0.8。随后以供体菌（含有重
组 质 粒 E.coil S17 pir） 与 受 体 菌（NyZ12）1∶2 和
1∶5 的比例混合菌液，6 000 r/min 离心 30 s 收集菌
体，用 100 μL RGMC 将菌体洗涤两遍，最后 50 μL
重新悬浮并滴加在滤膜上。待菌液被滤膜充分吸收
后，将其案贴在 RGMC 平板上，28℃培养 8-12 h。
之后用 100 μL 无菌水洗涤滤膜，洗下的菌液涂布在
含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗 LB 平板上，28℃
培养至长出单克隆菌落。根据抗性筛选和 PCR 鉴定，
找到发生单交换菌株。
1.2.5 双交换 挑单交换菌株接种于 LB 培养基中
（AmpR），28℃，170 r/min 多次传代培养。传至第 4
代将菌液稀释 100 倍后取 100 μL 涂布于 10％蔗糖
的 LB 平板上，28℃培养至出现单菌落。挑取单克
隆接种于含有 Amp 的 LB 培养基中培养，再将过夜
培养的菌液取 4 μL 分别接种于含有 Amp 或者含有
Kan 和 Amp 双抗 LB 培养基中，28℃培养。挑选能
在 Amp 培养基中生长但不能在双抗培养基中生长的
单克隆进行 PCR 鉴定，鉴定引物 P1/P4 和 E1/E2。
将本实验中突变载体的构建和交换过程分别总
结为图 1、图 2。
1.2.6 测序验证 煮沸法［9］提取敲除菌的基因组，
并以敲除菌基因组 DNA 作为模板，引物对分别为
P1/E2 进行 PCR 反应，PCR 体系如下 ：模板 4 μL，
FastPfu 酶 1 μL，5×FastPfu buffer 10 μL， 引 物 各 1
μL，加无菌去离子水至 50 μL。扩增程序为 ：98℃ 2
min ；98℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，30 个循环 ；
72℃ 5 min。凝胶电泳回收 PCR 产物并送至生工测
序部测序。
1.2.7 生长实验 将敲除菌与野生菌按 0.5% 的接
种量接种于装有 50 mL 无机盐培养基的三角瓶（250
mL）中，从 12 h 开始取样，然后每隔 1 h 测定菌液
OD 值，绘制敲除菌与野生菌的生长曲线，比较生长
状况。
2 结果
2.1 同源臂与融合PCR
扩增引物对 P1/P2 扩增 orf4637 上游同源臂（约
P1 P3
P2 P4
E2਼Ⓚᴮᢙ໎㶽ਸPCR㕪ཡ४㕪ਈ䖭փᶴᔪ
pEX18km-Ƹ4637
E1
ORF4637 ORF4638ORF4636
ORF4638ORF4636
㕪ཡ४ ORF4638ORF4636
图 1 Δ4637 突变载体构建步骤流程图
Orf4637 Orf4638Orf4636
㕪ཡ४ ORF4638ORF4636㕪ཡ४ ORF4638ORF4636 ORF4638ORF4637ORF4636
pEX18km-Ƹ4637sacB oriori T
ori TsacB
অӔᦒৼӔᦒkanori
kan
图 2 单交换和双交换过程
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4206
663 bp），引物对 P3/P4 扩增 orf4637 下游同源臂（约
863 bp），成功融合的片段大小为 1 526 bp。1％琼脂
糖电泳结果（图 3、图 4）显示，PCR 产物大小与预
期相符，通过凝胶电泳回收得到高纯度的目的片段。
2.2 重组质粒的构建
将融合片段加 A 后连接到 pGEM-T Easy 载体上，
抽取质粒并酶切鉴定，确定目的片段连接 T 载体上
的阳性克隆测序。提取质粒 pEX18km 并用 EcoR I
和 Sal I 进行酶切，酶切后的 DNA 片段进行琼指糖
电泳，结果（图 5）显示，大小约为 6 100 bp，与
标准序列大小相符。再用 EcoR I 和 Sal I 对连接目
的片段的 T 载体片段进行双酶切，将两个片段分别
回收后连接构建重组质粒 pEx18km-△4637，转化至
E.coli S17 pir 菌株中，抽取质粒酶切鉴定，鉴定结果
见图 6。
2.3 单交换突变体的鉴定
E.coli S17 pir 与环己胺降解菌通过微孔滤膜进
750
1 2 3
500
250
100
1000
2000
bp
1 ：DNA Marker 2000 ；2 ：上游同源臂片段 ；3 ：下游同源臂片段
图 3 PCR 扩增同源臂
bp
1000
2000
1 2
750
500
250
100
1 ：融合 PCR 片段 ；2 ：DNA Marker
图 4 PCR 扩增融合片段产物
bp
21
10000
7500
5000
2500
1000
250
15000
1 ：pEx18km 经过 EcoR I 和 Sal I 酶切 ；2 ：DNA Marker
图 5 pEx18km 酶切后电泳图
行结合转移的效率比较高，重复性好。一般能在卡
那霉素和氨苄青霉素抗性平板上生长的单克隆都是
发生了单交换的阳性重组克隆。再挑取单菌落进一
步鉴定，分别用扩目的基因 orf4637 的引物对 E1/E2
和基因敲除引物对 P1/P4 进行 PCR 鉴定。用引物
E1/E2 扩 增 有 1 600 bp 和 120 bp 左 右 两 条 DNA 片
段（图 7，1、2 泳道），以 P1/P4 扩增有 3 000 bp 和
1 600 bp 左右两条片段（图 8，2、3 泳道）的克隆
就是发生单交换的突变株。
2.4 双交换与突变株鉴定
单交换菌株在 LB 培养基中传 4 代，稀释后涂
布于含有 Amp 和 10％蔗糖的 LB 平板上。由于自杀
质粒 pEx18km 上 sacB 基因突变率高，在平板上长出
的单克隆也可能是单交换菌。但是双交换菌不具备
Kan 抗性，单交换菌具有 Kan 抗性，所以利用抗性
筛选，找到可能的双交换突变体。再以该菌基因组
为模板，分别用扩目的基因 orf4637 的引物对 E1/E2
和基因敲除引物对 P1/P4 进行 PCR 鉴定，鉴定结果
15000
21
bp
10000
7500
5000
2500
1000
250
1 ：pEx18km-△4637 经 EcoR I 和 Sal I 双酶切 ；2 ：DNA Marker
图 6 重组质粒 pEx18km-△4637 酶切鉴定图
2016,32(4) 207毛灵琪等 ：Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 基因无痕敲除方法的建立
如图 9 和图 10 所示。以引物 E1/E2 扩增只有 120 bp
大小片段（图 9，1 泳道），而外侧引物对 P1/P4 扩
增只有 1 600 bp 左右片段的克隆即为发生双交换的
阳性克隆，相对于单交换，无 3 000 bp 左右的扩增
产物（图 10，1 泳道），其扩增产物比以野生株为
模板的扩增产物小了约 1 400 bp，即缺失了基因编
码区。
100
250
500
750
1000
2000
bp
2 31
1，2 ：E1/E2 引物对扩增 ；3 ：DNA Marker
图 7 E1/E2 引物对鉴定单交换
250
1000
2000
4000
10000
bp
1 2 3
7000
500
1 ：DNA Marker ；2，3 ：P1/P4 引物对扩增
图 8 P1/P4 引物对鉴定单交换
4000
250
500
1000
2000
bp
1 2
10000
7000
1 ：E1/E2 引物对扩增 ；2 ：DNA Marker
图 9 E1/E2 引物对鉴定双交换
500
bp
1000
10000
2000
1 2
7000
4000
250
1 ：P1/P4 引物对扩增 ；2 ：DNA Marker
图 10 P1/P4 引物对鉴定双交换
2.5 敲除菌株测序结果
煮沸法提取敲除菌株基因组并利用引物 P1/E2
扩增缺失区得到约 750 bp 大小片段，如图 11 所示。
将目的片段凝胶电泳回收并送至生工测序部测
序，结果如图 12 所示。
bp
15000
5000
2500
1 2
1000
250
7500
10000
1 ：DNA Marker ；2 ：敲除片段
图 11 P1/E2 引物扩敲除片段
由于这段序列靠近测序 3 端，有几个碱基突变
和缺失，可能是测序误差。这段序列已经跨过敲除
区域，可以从两段序列的对比发现 orf4637 基因中间
缺失，说明的确发生了双交换，orf4637 成功敲除。
2.6 敲除菌生长实验
通过对敲除菌的生长实验的研究，绘制了敲
除菌与野生菌的生长曲线（图 13），比较发现敲除
orf4637 突变体相对野生型在环己胺的无机盐培养基
中的生长变慢，但不是很明显。
3 讨论
目前国际上对环己胺的微生物降解研究并不多，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4208
微生物代谢环己胺的分子机理尚未揭示，因此以环
己胺降解菌 NyZ12 为实验对象，构建一种可行的无
痕敲除体系，成功敲除野生菌中的目的基因，对后
续研究该菌的环己胺降解分子机制至关重要。利用
同源重组技术敲除目的基因是目前研究基因功能最
常用的定点突变手段，无痕敲除的主要优势是不需
3 ˃GCCCGGCTAAAGCAGCTTGTGCAGCGGACTTTAGGCCCGGCTTCTACCACTGCCCAAAAAATGGTAGCCGCCCCACCGCCAAAAAGAACAAGTA 5 ˃
5 ˃CGGGCCGATTTCGTCGAACACGTCGCCTG AAATCCGGGCCGAAGATGGTGACGGGTTTTTTACCATCGGCGGGGTGGCGGTTTTTCTTGTTCAT 3 ˃৏࿻ᒿࡇ
5 C˃GGGgCGgTTTCGTCGAA –ACGTCGCCTG AAATCCGGGCCG-tGATGGTGACGGGTTTTT-ACC-TCGGCGGGGTGGCGGTTTTTCTTGTTC-T 3 ˃⍻ᒿ㔃᷌
C C C C C C C C C C C C CAAAAAAAAA C C C C C C TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G GC
20 30 40 50 60 70 80 90 100ሿ߉㺘⽪ケਈˈ㺘⽪㕪ཡ
蓝色和橙色表示左右臂
图 12 测序鉴定双交换突变体
要在同源序列中插入抗性标记基因，这样不仅简化
了敲除载体的构建，而且减少了插入抗生素基因产
生极性效应对菌株生长产生的不良影响。同时构建
敲除载体时，SacB 基因的引入使得无痕敲除效率大
大提高。SacB 基因来源于枯草芽孢杆菌，编码分泌
性的蔗糖 -6-果糖基转移酶，该酶催化蔗糖的水解和
果聚糖的合成。在革兰氏阴性菌中，在有蔗糖存在
的情况下，基因的表达对细菌来说是致死性的［10］。
自 杀 载 体 pEx18km［11］ 不 仅 有 反 向 筛 选 基 因
sacB 还 有 Kan 标 记 抗 性， 因 此 发 生 第 一 次 交 换
后，将突变株涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗
性的 LB 平板，因为野生菌本身具有 Amp 抗性而
E.coli S17 不含 Amp 抗性，因此能在平板上生长的
单克隆，应该是整合了 pEx18km 的环己胺降解菌，
也就是发生了单交换，再利用 PCR 方法确定，可以
找到发生单交换的阳性克隆。此方法大大加快了构
建缺失株的步伐，成为整个构建无痕突变株过程的
关键步骤。再将多次传代的单交换菌株，涂布于高
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
O
D
60
0
0 2 4
mutant NyZ12△4637
wild type NyZ12
6 8 10ᰦ䰤h 12 14 16 18 20
图 13 敲除菌的生长曲线
2016,32(4) 209毛灵琪等 ：Pseudomonas plecoglossicida NyZ12 基因无痕敲除方法的建立
蔗糖浓度的 LB 平板。利用蔗糖的选择性压力和细
菌染色体复制过程中发生的自由重组去除载体序列，
产生无标记突变株［12，13］。在整合了 pEx18km 的环
己胺降解菌中只有发生第二次交换的突变株才能在
含有蔗糖的培养基中生长。抗生素抗性和 sacB 基因
表达可作为正和负选择标记，但是自发的抗生素抗
性、高异常重组率和基因突变可能会导致较高的假
阳性，所以最后应对大量突变株进行鉴定［14］。
我们完成了环己胺降解菌 NyZ12 的基因组测
序，预测基因组有 5 个胺氧化酶基因，最直接验证
基因功能的方法是克隆表达基因，测定是否有酶活
力。初步实验结果表明 orf4637 对底物环己胺有酶活
力。通过基因敲除，观察突变体的生长情况，从另
一个角度回答 orf4637 是否参与环己胺的代谢。对
NyZ12Δ4637 敲除菌株进行了生长实验，与野生菌对
比，发现基本生长情况变化不明显，所以推断环己
胺代谢途径中催化其第一步的环己胺氧化酶可能有
多个，orf4637 不是主效基因。这为后续逐一敲除其
他胺氧化酶基因，研究突变体的表型奠定了基础。
4 结论
本研究选择可能与环己胺降解有关的 orf4637 作
为目的基因，选用自杀质粒 pEx18km 作为载体，建
立了成熟的环己胺降解菌 NyZ12 基因无痕敲除方法，
成功构建了假单胞菌 NyZ12Δ4637 基因突变株。
参 考 文 献
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（责任编辑　李楠）