全 文 ：第 33卷 第 5期 生 态 科 学 33(5): 915−919
2014 年 9 月 Ecological Science Sep. 2014

收稿日期: 2013-10-18; 修订日期: 2013-12-19
基金项目: 上海市教育委员会科研创新项目(14YZ122)
作者简介: 胡乐琴(1966—), 女, 江西九江人, 博士, 副教授, 主要藻类毒素、藻类资源化利用和微生物研究, E-mail: yqhu@shou.edu.cn
*通信作者: 何培民, 男, 博士, 教授, 主要从事海洋藻类研究, E-mail: pmhe@shou.edu.cn

胡乐琴, 吴春燕, 张洋, 等. 抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 生态科学, 2014, 33(5): 915−919.
HU Leqin, WU Cunyan, ZHANG Yang, et al. Preparation and identification of monoclonal antibody against microcystin[J]. Ecological
Science, 2014, 33(5): 915−919.

抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定
胡乐琴, 吴春燕, 张洋, 何培民*
上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306

【摘要】 构建了微囊藻毒素(Microcystin-LR , MC-LR)完全免疫原 MCLR-KLH, 免疫 BALB／c 小鼠, 采用杂交瘤技术
制备抗 MCLR 单克隆抗体, 用间接竞争 ELISA 方法筛选抗体。经过 3 次克隆, 获得 2 株可稳定分泌抗 MCLR 单克隆
抗体的杂交瘤细胞株, 腹水效价达 1:8×104; IC50 为 0.81 ng⋅mL−1, 最低检测限 0.10 ng⋅mL−1, 亲和常数 3.8×108 L⋅mol−1,
电泳结果显示抗体由 1 条重链和 1 条轻链组成, 与 MC-LR 同系物 MC-RR、MC-YR 有较强的交叉反应, 与 MC-LW 有
弱交叉性反应, 与河豚毒素无交叉反应。实验结果表明该抗体质量较好, 将在微囊藻毒素的快速检测、产生机理等方
面具有较大的科研和应用价值。

关键词：微囊藻毒素; 单克隆抗体; 间接竞争 ELISA(ciELISA)
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2014.05.015 中图分类号：Q14 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)05-915-05
Preparation and identification of monoclonal antibody against microcystin
HU Leqin, WU Cunyan, ZHANG Yang, HE Peimin
Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: A hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against Microcystin-LR(MC-LR) was established after immuniz-
ation of BALB/c mice with artificially synthesized MC-LR-KLH as antigen. The stimulated splenocytes were fused with
SP2/0 myeloma cells to produce hybridomas. Two hybridoma cell lines were identified that secretes monoclonal antibody
against Microcystin, after being subcloned for 3 cycles by indirect ELISA, which had an ascitic ELISA titre up to 640000.
And the 50% inhibitory concentration of detection of was (0.81±0.05) μg·L− 1 as measured by the competitive inhibition
enzyme-linked immunosorbent assay (ciELISA). The McAb will be quite useful for the determination of MC-LR residues.
Key words: microcystin; monoclonal antibody; ciELISA
1 前言
我国是世界上藻灾最为严重的国家之一[1–3], 藻
毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要
的淡水藻毒素是微囊藻毒素(Microcystin, MC)[4–5],
微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质,
能够对人体多个器官产生危害, 危害最严重的靶器
官是肝脏, 长时间低剂量接触 MCs 会导致肝损伤和
诱发癌症[6–7], 有研究表明, 我国肝癌多发区与当地
水中高含量的微囊毒素有关[8–9]; MCs 引发的急性肝
中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血[10]。目前已经
分离出 80 多种 MCs 的异构体, 其中 Microcystin-LR
(MC-LR)是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多
的一种, 也是我国最常见的微囊藻毒素种类。目前
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MC-LR 被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降
低 MCs 对人和水生动物的毒性及潜在危害性, 世界
卫生组织(WHO)推荐水中微囊藻毒素的安全指导值
MC-LR 是 1000 ng·L–1。我国淡水微囊藻毒素污染严
重, 但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻
毒素检测方法, 因此研制我国自主知识产权的检测
淡水中微囊藻毒素的方法已成为当务之急。传统的
藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检
测[11–14], 这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是
需要较长的检测时间、或是准确率不够, 不能满足
现场快速检测要求, 而免疫学技术特异性强、敏度
高、不需要复杂仪器, 便于制成试剂盒或试剂条, 使
用更方便, 便于推广, 经济有效, 因此是毒素检测
研究的热点[15–16] 。本研究运用 B 淋巴细胞杂交瘤技
术, 制备了优质的抗 MC-LR 的单克隆抗体(McAb),
并对其进行了纯化和特性研究, 为建立以单克隆抗
体为基础的免疫学检测方法及检测试剂盒、试剂条
的研制与应用奠定了基础。
2 材料与方法
2.1 实验动物
BALB/c健康小鼠(8周龄和12周龄以上, 分别用
于免疫和腹水制备)购自中国科学院实验动物中心
研究所。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存。
2.2 完全抗原制备与鉴定
3 mg 微囊藻毒素溶于 1.2 mL DMF 中, 加入 100
mL 活化液(12 mg EDC, HCL 和 7 mg NHS 溶于 1 mL
DMF 中), 4 ℃活化反应过夜。
取20 mg KLH于5 mL pH9.6的碳酸缓冲液, 搅
拌并置于冰水浴中, 将上述活化后的微囊藻毒素逐
滴加入, 加完后继续搅拌1 h, 然后4 ℃放置过夜。用
0.01 M PBS透析3天, 离心取上清, 用lorry法测定浓
度为1.4 mg·mL–1, –20 ℃保存, 用作免疫抗原。
以OVA代替KHL偶联MCLR建立MCLR-OVA作
为检测原。
2.3 动物免疫试验
适量MCLR-KLH与等体积完全福氏佐剂混合,
完全孵化, 取5只8周龄雌性BALB/C小鼠, 颈背部皮
下3点, 四肢腋(腘)皮下, 以及腹腔注射, 每只小鼠
注射孵化后抗原500 Μl(相当于每只小鼠免疫抗原
100 μg)。14天后, 适量MCLR-KLH与等体积不完全
福氏佐剂混合, 完全孵化后皮下多点及腹腔注射抗
原, 按此法每14天免疫一次。第三次基础免疫7天后,
尾静脉采血间接ELISA方法测效价, MC-LR-KLH
为包被原, 小鼠血清梯度稀释, 空白BALB/C小鼠
血清做阴性对照。取效价高的加强免疫, 尾静脉注
射100 μg MC-LR-KLH, 3 d后取脾脏融合。
2.4 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选
无菌取免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的
SP2/0骨髓瘤细胞以5︰1体积比混合, 按常规方法进
行融合, 融合剂为50%的PEG2000。离心收集融合细
胞, 用含HAT的IMDM培养基(含15%胎牛血清)重悬
细胞。将新鲜的饲养细胞同融合细胞充分混匀后,
加到96孔细胞培养板内, 37 , 5%℃ CO2培养。待融合
细胞生长到培养孔面积的1/3—1/2时 , 采用间接
ELISA方法分步筛选杂交瘤细胞, 以1 μg·mL–1MC-
LR-KLH包被酶标板孔, 加入被测孔的培养上清液,
筛选阳性孔(P/N>2.1), 然后对阳性孔的上清液作做
特异性筛选。强阳性孔上清液做1/3, 1/9, 1/37稀释,
弱阳性孔不稀释, MC-LR-KLH浓度10 ng·mL–1, 判
断50 ng·mL–1MC-LR对OD值的影响。经2—3次检测
抑制率均高的孔, 用有限稀释法进行克隆化。经过
三次亚克隆后全部纯化, 建株液氮保存。
2.5 单抗的生产与纯化
取3只12周龄雄性BALB/C小鼠, 腹腔注射灭菌
降植烷0.5 mL, 每只腹腔注射0.5 mL细胞液。7 d后
腹腔接种对数生长期的杂交瘤细胞,每鼠1×106个细
胞, 待小鼠腹部膨大, 频临死亡时, 采集腹水, 离心
取上清, 分别用硫酸铵沉淀法和亲和层析柱纯化腹
水, 进行SDS-PAGE电泳,并用间接ELISA测定效价。
2.6 抗体评估
2.6.1 抗体效价测定
将抗体浓度调整到1 mg·mL–1, 再用PBS做倍比
稀释, 采取间接ELISA方法测定其效价。倍比稀释的
细胞上清液及腹水为一抗, 辣根过氧化物酶标记的
羊抗鼠IgG为二抗。同时设阴性、空白和阳性对照
2.6.2 抗体灵敏度检测
将MC-LR标准品分别稀释为30、20、10、5、1、
0 µg·L–1, 分别取各浓度标准品溶液50 μL和血清稀
释液50 μL加入酶标板孔内, 竞争反应2 h。其余步骤
与间接ELISA法相同, 测定OD值, 计算达到50%抑
制率时的MC-LR质量浓度值(IC50值), 确定单抗对
5 期 胡乐琴, 等. 抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定 917
MC- LR的亲和性。抑制率的计算公式如下: 抑制率
=(1−OD450SAM/OD450MAX)×100%, 其中, OD450SAM 表
示竞争性孔的OD值, OD450MAX表示未加MC-LR抑制
的孔的OD值。
2.6.3 抗体亲和常数的测定
用间接ELISA来测定抗体的功能性亲和常数K。
将包被抗原按2倍稀释成2、1、0.5、0.25 μg·mL–1 4
个浓度梯度, 包被酶标板, 每孔100μL; 将抗体稀释
成1︰2000, 再作2倍梯度稀释, 共12个梯度, 每孔
100 μL。利用间接ELISA测定各个包被浓度下的结
合反应曲线, 利用曲线计算抗体的亲和常数。亲和
常数计算公式如下: Ka = (n–1) /2 (n[Ab’]t-[Ab]t), 其
中, n=[Ag’]t /[Ag]t , [Ag’]t 和[Ag]t为不同包被抗原的
浓度, [Ab’]t 和[Ab]t是对应不同包被抗原的浓度下,
将抗体梯度稀释得到最大吸光度一半处的抗体浓度
(mol·L–1)。
2.6.4 抗体交叉反应率
实验方法同2.6.2, 用MC-LR的同系物Microcystin-
RR (MC-RR)、Microcystin-YR (MC-YR)、Microcystin-
LW (MC-LW)以及河豚毒素代替MC-LR测定四种毒
素的IC50, 然后根据以下公式计算交叉反应率:
CR=( IC50, MC-LR)/(IC50, X), 其中, X为四种毒素
2.6.5 单抗亚型分析
采用Invitrogen公司小鼠单克隆抗体亚型快速鉴
定试剂盒, 按说明书方法操作
3 结果与分析
3.1 免疫鼠多抗血清效价和特异性分析
3.1.1 免疫鼠多抗血清效价
三次免疫后, 用间接 ELISA 方法对免疫小鼠产
生的抗体进行了效价检测, 5 只小鼠效价均达到 1:
16000 以上, 可以进行融合实验。取效价最高的 2 号
鼠加强免疫, 三天后融合
3.1.2 阳性杂交细胞的筛选及特异性分析
融合7天后, 取上清液间接ELISA检测效价及特
异性。结果, 融合率100%, 得到强阳性孔26个, 弱阳
性孔138个。经特异性检测后, 4个孔有明显抑制, 编
号分别为4D3、3A3、8A9、6E12。对4个孔进行亚
克隆及复检, 经4次亚克隆及复检后, 8A9、6E12完全
纯化, 100%阳性。对8A9、6E12多次传代、冻存及复
苏, 杂交瘤细胞分泌抗体仍然稳定。
3.2 抗体性质分析与评估
3.2.1 抗体效价测定
将8A9 、6E12培养后注射小鼠生产抗体, 纯化
后间接ELISA测定抗体效, 测定方法同。将抗体浓度调
整到1 mg·mL–1, 再用PBS按1:10000, 1:20000……做2
倍稀释, 检测结果两细胞株抗体效价均达1:8×104。
3.2.2 灵敏度检测
以吸光率 B/B0(B 是 MC-LR 不同标准浓度的
OD 值, B0 是 MC-LR 标准浓度的 OD 值)为纵坐标,
以 MC-LR 不同浓度×10 的对数值为横坐标, 绘制标
准抑制曲线, 见图 1, 误差线为 n=3 次平行实验的标
准偏差, 实验重复性良好, 相对标准偏差(变异系数)
均在 10%以内, 曲线呈现明显的反 S 型。曲线采用四
参数的 Logistic 模型拟合, 软件采用 Origin 7.0, 由拟
合参数可以分析: 半抑制浓度 IC50=(0.81±0.05) μg·L–1;
检测限 LOD=0.10—8.00 μg·L–1; 定量检测区间: LQD
为 0.20—4.00 μg·L–1。
3.2.3 亲和常数的测定
本研究采用间接ELISA来测定抗体的功能性亲
和常数 K。结果如图 2 所示。横坐标为经过纯化的

图 1 间接竞争 ELISA 标准曲线
Fig. 1 Indirect competitive ELISA standard curve

图 2 抗体亲和常数曲线
Fig. 2 Curve for antibodies affinity constant
918 生 态 科 学 33 卷
抗 MC-LR 单克隆抗体的稀释倍数, 纵坐标为吸光
度, 各曲线表示不同浓度包被抗原。按 1.6.3 公式计
算, 计算出每个浓度对应的亲和常数, 其平均值即
为抗体的亲和常数, 根据计算, 亲和常数为 3.8×
108 L·mol –1。
3.2.4 亚型分析
采用小鼠单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒分析,
抗体亚型为 IgG3。
3.2.5 交叉性反应
分别测试了抗体与微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-
YR、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-LW 以及河豚毒
素的交叉反应性, 半抑制浓度结果列于表 1, 结果表
明, 所获得的单克隆抗体对第四位氨基酸为精氨酸
的微囊藻毒素(如 MC-YR 和 MC-RR)有较强的交叉
反应性; 并且与第四位氨基酸为非精氨酸的微囊藻
毒素(如 MC-LW)也有较弱的交叉反应, 交叉反应率
大于 10%; 与河豚毒素没有反应。图 3 为交叉性反
应图。
4 讨论
酶免疫测定技术具有高度特异性和高灵敏度性,
并且可以被开发成简便实用的试剂盒和试剂条, 成
为药物检测和毒素检测中具有研究和开发前景的热

表 1 交叉反应
Tab. 1 Cross reaction
MCs 类似物 IC50±s/(μg·L–1) 交叉反应率 摩尔交叉反应率
MC–LR 0.81 100 100
MC-RR 1.73 46.80 44.90
MC–YR 0.93 87.10 82.90
MC-LW 6.57 12.30 12.00
河豚毒素 >50000 <0.002 <0.003

图 3 交叉反应
Fig. 3 Cross reaction
点, 而获得高质量的抗体是实现免疫分析检测的核
心和基础。
通常相对分子质量小于 1000 的物质是不具有
免疫原性的, 需要与载体蛋白偶联形成结合物后才
具有免疫原性。MC-LR 为 7 肽小分子化合物, 不具
有免疫原性, 而需要偶联到大分子的载体上。目前,
常用来作为小分子人工抗原的载体蛋白有牛血清蛋
白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、
人 IgG 及人工合成的多聚赖氨酸(PLL) 等。盛建武
等[17]2006 年将 MC 与 BSA 偶联制备免疫原 MC-
LR-BSA, 用其研制的抗体建立的 ELISA, 最低的检
测限为 10 ng·L–1。赵晓联[18]] 2006 年采用人 KLH 作
为载体制备免疫原 MC-LR-KHL, 其抗体建立的
ELISA, 最低的检测限为 0.01 ng·mL–1。本文采用
MC-LR 与 KLH 偶联制备免疫原, 用其研制的单抗,
经间接 ELISA 鉴定, OA 50%抑制的质量浓度为
(0.81±0.05) μg·L–1, 抗体质量非常好。
在单抗细胞株筛选过程中, 本实验参照文献报
道的方法[16]首先用 MC-LR-OVA 包被酶标板进行广
泛筛选, 然后包被 MCLR-OVA、OVA 和 KLH 进行
第二轮筛选, 再选择仅对MCLR-OVA显阳性的孔进
行药物抑制实验, 最后选择药物半数抑制率高的孔
进行克隆。这种筛选方法直观、简便, 可以尽量避
免包被原阳性而药物抑制阴性的现象。
细胞融合后进行初次阳性抗体孔筛选时, 有时
可见在同一阳性孔内生长着 2 个以上细胞克隆, 由
于不分泌抗体的杂交瘤细胞往往生长更为旺盛, 因
此应及时进行亚克隆, 分离出分泌特异抗体的杂交
瘤细胞株, 本实验对准一个克隆化群落吸出一部分
细胞, 在 96 孔细胞培养板孔中逐渐稀释至一个孔中
大约 100 个细胞, 最后将该孔中细胞转到 10 mL 培
养基中, 混匀后滴入 96 孔细胞培养板中。该方法能
够使阳性孔中不同克隆群落有效分离, 大大提高了
每个培养孔中出现单个克隆的机率。
本试验获得2株稳定分泌抗MC-LR抗体的杂交
瘤细胞株 8A9、6E12, 经间接 ELISA 法测定, 腹水
效价可达到 640000; 抗 MC-LR 抗体平均亲和常数:
(3.8×108) L·mol–1, 表明抗原抗体结合稳定较好; 抗
体半抑制浓度 IC50=(0.81±0.05) μg·L–1, 定量检测区间
LQD 0.20—4.00 μg·L–1; 最低检测限 LOD=0.10 μg·L–1,
最高检测限HOD=8.00 μg·L–1, 表明制备的抗体特异
性强, 检测灵敏度较高; 抗 MC-LR 抗体与 MC-LR
5 期 胡乐琴, 等. 抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定 919
的同系物 MC-YR、MC-RR、MC-LW 以及与河豚毒
素进行了交叉反应测试, 交叉反应率分别 82.9%、
44.9%、12%,与河豚毒素没有交叉反应现象, 表明在
MC 结构中精氨酸可能与抗原决定簇有一定关系。
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