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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):94-101
收稿日期 ：2015-07-10
基金项目 ：国家自然科学基金项目（41376152，40976098），浙江省自然科学基金项目（LY13C190006）
作者简介 ：徐晴，女，研究方向 ：甲壳动物内分泌学 ；E-mail ：634605585@qq.com
通讯作者 ：朱冬发，男，教授，研究方向 ：甲壳动物遗传育种 ；E-mail ：zhudongfa@nbu.edu.cn
三疣梭子蟹 nm23 基因克隆及在卵巢发育中的表达分析
徐晴  朱冬发  谢熙  邱锡尔  沈锡权 
（宁波大学海洋学院，宁波 315211）
摘 要： Nm23 基因编码的核苷二磷酸激酶（NDPK）参与调控生物体的多项生理功能，包括生长、发育、分化和肿瘤转移等。
根据三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转录组数据库中的 nm23 同源序列，利用 cDNA 末端快速扩增技术（RACE）首次克隆
获得了三疣梭子蟹 nm23 基因的全长 cDNA 序列（GenBank 登录号 ：KP027331）。该序列全长 777 bp，编码一个 151 个氨基酸的蛋
白，该蛋白包含一个典型的核苷二磷酸激酶（NDPK）区域，具有 NDPK 活性位点和多肽结合位点。推导的氨基酸序列与已知甲
壳动物的 nm23 一致性达到 90% 以上，与脊椎动物第一类 nm23 的一致性也达到 70% 以上。系统进化树分析发现第一类 nm23 与
第二类 nm23 分别聚为一支，甲壳动物 nm23 属于第一类，且与 nm23-1 和 nm23-2 亲缘关系较近。采用实时荧光定量 PCR（qPCR）
技术分析了三疣梭子蟹 nm23 的组织差异表达及其在卵巢发育过程中的表达水平变化，结果表明 nm23 在三疣梭子蟹各组织内均有
表达，其表达水平在眼柄、肌肉和 Y 器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，卵巢中 nm23 的表达水平在
Ⅰ期最高，之后随着卵巢发育的进行，其表达水平逐渐下降，并在成熟期降至最低，这表明 nm23 可能参与调控三疣梭子蟹的卵巢
发育。
关键词 ： 三疣梭子蟹 ；nm23 ；基因克隆 ；卵巢发育 ；基因表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.012
Cloning and Expression Analysis of Gene nm23 during Ovarian
Development of Portunus trituberculatus
XU Qing ZHU Dong-fa XIE Xi QIU Xi-er SHEN Xi-quan
（The School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）
Abstract: Nm23 is a family of genes encoding the nucleoside diphosphate（NDP）kinase，which functions in a wide variety of
biological processes，including growth，development，differentiation，and tumor metastasis. In this study，based on the nm23 homologous
sequence in the transcriptome dataset of Portunus trituberculatus，the full-length cDNA of P. trituberculatus nm23 was obtained using the rapid
amplification of cDNA ends（RACE）. The full-length cDNA（GenBank accession number KP027331）was 777 bp，encoding for a protein
of 151 amino acids with one typical NDP kinase domain that harbored all the crucial residues for nucleotide binding and enzymatic activity. The
deduced amino acid sequence of P. trituberculatus nm23 exhibited more than 90% identities with that of other crustaceans，and more than 70%
identities with the nm23 of group I of vertebrates. The phylogenic tree constructed based on nm23’s amino acid sequences indicated that the
crustacean nm23 belonged to the group I（nm23-1），which was separated from the nm23 of group II（nm23-2），moreover，the nm23-1 and
nm23-2 were close. The expression levels of P. trituberculatus nm23 in different tissues and during the ovarian development were detected by
quantitative real-time PCR（qPCR）. The results showed that nm23 was ubiquitously expressed in all tissues examined，its mRNA level was
the most abundant in eyestalk，muscle and Y-organs，and second in ovary and hepatopancreas. During the ovarian development，the nm23
was mostly expressed at stage I，then declined along with the development of ovaries，and to the minimum at stage V，suggesting that the
nm23 had the potential role in the ovarian development of P. trituberculatus.
Key words: Portunus trituberculatus ；nm23 ；gene cloning ；ovarian development ；gene expression
2016,32(4) 95徐晴等：三疣梭子蟹 nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析
Nm23 基因编码的核苷二磷酸激酶（nucleoside
diphosphate kinase，NDPK，EC 2.7.4.6）可以催化核
苷三磷酸发生磷基转移从而生成相应的核苷二磷酸
（NDP）［1］。研究表明，NDPK 不仅可以作为看家基
因维持生物体内核苷酸平衡，还参与调节细胞增殖、
细胞分化、细胞凋亡和细胞信息传递等多种生物学
功能［2-4］。Nm23 基因最早于 1988 年由美国国立癌
症研究所的 Steeg 等［5］ 应用差示杂交（differential
hybridization）等技术从小鼠黑色毒瘤 K-1735 细胞株
中分离获得，并证实其与肿瘤转移抑制有关。与此
同时，果蝇（Drosophila melanogaste）中也发现其同
源基因 awd（abnormal wing discs）参与调控昆虫的
正常发育［6，7］。之后，nm23 被发现广泛存在于从单
细胞生物到哺乳动物的多个物种中［1，8-13］，是一个
具有高度同源性的保守基因家族。
大 多 数 多 细 胞 生 物 中 都 发 现 了 nm23 亚 型 的
存在，其亚型的数量和多样性似乎与生物体结构
的复杂性正相关［14］。例如，单细胞生物大肠杆菌
（Escherichia coli）［15］ 和 啤 酒 酵 母（Saccharomyces
cerevisiae）［16］分别只有一个 nm23 亚型，而最原始
的多细胞生物盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）
中 则 存 在 两 种 nm23 亚 型［17］。 人 类 的 nm23 有 10
种亚型，根据蛋白序列结构组成和磷酸转移酶活性
又将其分为两大类［18，19］。第一类包括 nm23-H1 至
H4，它们的序列组成较为相似，均包含一个高度保
守的 NDPK 活性位点结构域，具有传统的 NDPK 活
性。第一类基因广泛表达于人体的各个组织，其中
nm23-H1 和 nm23-H2 一 致 性 最 高（88%）， 且 能 形
成同源或异源六聚体［1］。第二类 nm23 包括 H5 至
H10，与第一类基因相比，它们序列的差异较大，
且拥有延伸的 N 末端和 C 末端。NDPK 活性位点结
构域在第二类基因中并不保守，仅在 nm23-H6 中发
现了 NDPK 活性［20］。第二类基因一般具有组织表达
的特异性，nm23-H5、H6 和 H8 均主要在人类精巢
中表达［20-22］。
甲 壳 动 物 中 有 关 nm23 的 报 道 较 少， 在 已 知
nm23 物种中均只发现一个亚型。该亚型属于第一
类 nm23，拥有 NDPK 结构域，被认为参与甲壳动
物的应激和免疫反应［23，24］、配子发生［25］和性腺发
育［26］。开展甲壳动物 nm23 及其功能的研究，将有
助于加深人们对 NDPK 及其进化过程的理解。因此，
本研究利用三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转
录组文库，首次克隆获得了三疣梭子蟹的 nm23 基
因，并运用实时荧光定量 PCR（qPCR）分析其组织
分布特性以及在卵巢发育过程的表达水平变化，以
探究 nm23 在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实 验 材 料 2013 年 10 月 -2014 年 4 月， 分
多次从宁波市镇海区水产品市场购买处于第一次卵
巢发育的三疣梭子蟹（体重 90-335 g），根据卵巢外
观特征及性腺指数将三疣梭子蟹第一次卵巢发育划
分为Ⅰ-Ⅵ等 6 个时期［27］，采集Ⅰ-Ⅴ期蟹（每期 4
只）的卵巢用于检测 nm23 的相对表达水平。另采
集蜕皮间期蟹（雌、雄各 4 只）的表皮、精巢、卵巢、
肝胰腺、大颚器、肌肉、眼柄、Y 器、心脏、脑和
胸神经节用于组织表达差异性分析 ；组织解剖于冰
上进行，并将组织存放在 RNA 保存液中，-20℃保
存待用。
1.1.2 主 要 试 剂 RNA 保 存 液、Trizol 试 剂 盒 及
DNA 回 收 试 剂 盒 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公
司 ；DNase I、PrimeScript RT reagent Kit 及 SYBR®
Premix Ex TaqTM II kit 等 试 剂 盒 购 自 TaKaRa 公
司 ；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 购 自
Clontech 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取及反转录 将上述组织样品按照
Trizol 试剂盒说明书进行总 RNA 提取。总 RNA 经
DNase I 去除基因组 DNA 后，用 1% 琼脂糖凝胶电
泳检测其完整性，并用超微量分光光度计 Nanodrop
2000（Thermo scientific，USA） 进 行 纯 度 分 析。 用
PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒将总 RNA 进行反转
录得到 cDNA。
1.2.2 三疣梭子蟹 nm23 基因的克隆 从三疣梭子蟹
转录组数据库中检索获得一段 nm23 基因的同源序
列，设计引物 NM23-F 和 NM23-R（表 1），以卵巢
组织的 cDNA 为模板，进行 PCR 验证。根据该核心
序列设计基因特异性引物（表 1），利用 RACE 技术
分别对三疣梭子蟹 nm23 基因的 3 和 5 端进行巢式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.496
PCR 扩增。3 RACE-cDNA 将接头引物 AP 替换上述
试剂盒中的 Oligo dT primer 和 Random 6 mers 后用相
同的方法进行制备，5 RACE-cDNA 按照 SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 试 剂 盒（clontech） 进
行合成（表 1）。以上 PCR 均在 25 μL 体系下进行，
反应条件如下 ：94℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，56℃
30 s，72℃ 30 s，33 个循环 ；72℃延伸 10 min。所
有 PCR 产物经琼脂糖电泳后，用 DNA 回收试剂盒
（上海生工，上海）进行回收和连接，并转化至 E.
coli DH5α 感受态细胞进行培养，之后选取阳性克隆
菌落交由上海生工生物工程有限公司进行测序。
表 1 PCR 引物序列
引物 序列（5-3） 用途
NM23-F GAAGACCACCTGAAGAAGCAT RT-PCR
NM23-R GCCCCTTACTCATAAATCCAG RT-PCR
AP TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTC-
ACTATAG（T17）
3 RACE
NM23F1-3 AATCTGCCAACAAGGAGGTG 3 RACE
NM23F2-3 CCAACGAGACCTGGATTTATG 3 RACE
outer primer-3 TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3 RACE
inner primer-3 TCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3 RACE
NM23R1-5 CGACGAGTGGTCCAGATGA 5 RACE
NM23R2-5 GCTTCTTCAGGTGGTCTTCG 5 RACE
outer primer-5 CTAATACGACTCACTATAGGGC 5 RACE
inner primer-5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 5 RACE
NM23YG-F CGATTTCTGTATTGAGGTTGG qPCR
NM23YG-R TCATAAATCCAGGTCTCGTTG qPCR
actin-F CGAAACCTTCAACACTCCCG qPCR
actin-R GATAGCGTGAGGAAGGGCATA qPCR
1.2.3 序列分析 利用 Vector NTI 10.0 测序软件将
核心序列和 3 RACE、5 RACE 的测序结果进行拼
接，获得三疣梭子蟹 nm23 基因的 cDNA 全长。利
用 NCBI ORF Finder 在线工具确定 nm23 的 ORF 序列，
并翻译成氨基酸序列 ；利用 ClustalX 软件将该氨基
酸序列与已公布的 nm23 氨基酸序列进行同源性比
对 ；用 MEGA 4.0 软件的邻位法（Neighbor-Joining）
构建系统进化树 ；用 ExPASy Proteomics Server 所提
供的 ProtParam tool 蛋白质分析软件分析氨基酸序列；
使用 Signal 3.0 Server 预测信号肽，TMHMM 在线工
具预测氨基酸跨膜区域。
1.2.4 实 时 荧 光 定 量 PCR（qPCR） 分 析 利 用
qPCR 分析 nm23 在三疣梭子蟹不同组织及卵巢发
育 过 程 中 的 表 达 水 平 变 化。 根 据 克 隆 得 到 nm23
的 cDNA 全长设计一对荧光定量引物 NM23YG-F、
NM23YG-R 检测 nm23 基因表达水平，设计 actin-F
和 antin-R（表 1）用以扩增三疣梭子蟹 β-actin 基
因（FJ641977） 作 为 内 参。 制 作 标 准 曲 线 用 于 验
证 nm23 基因和 β-actin 基因引物的扩增效率。按照
SYBR® Premix Ex TaqTM II kit 使用说明进行 qPCR 反
应。反应条件为 ：95℃ 2 min ；95℃ 5 s，53.2℃ 20 s，
68℃ 30 s，共 40 个循环。设定熔解曲线用于保证产
物的特异性，条件如下 ：55-95℃，每秒上升 0.2℃。
每个 cDNA 重复 3 个平行。数据用 x
-
±s 方法表示。
采用 2- △△ Ct 方法［28］计算目的基因相对表达量。选
取实验组中的一个重复为 1，其他组的数值以该重
复的倍数来表示。用 SPSS Statistics 软件进行单因素
方 差（ANOVA，Duncan’ s test） 分 析， 利 用 Excel
对统计结果进行作图，P<0.05 表示显著性差异。
2 结果
2.1 三疣梭子蟹nm23基因的cDNA全长及序列分析
将 测 序 结 果 进 行 拼 接 得 到 777 bp 的 三 疣 梭
子 蟹 nm23 cDNA 全 长 序 列（GenBank 登 录 号 ：
KP027331）。 该 序 列 包 括 145 bp 的 5 端 非 编 码
区、176 bp 的 3 端非编码区和 456 bp 的开放阅读
框（ORF），编码 151 个氨基酸（图 1）。推导的氨
基酸经 ExPASy（http://ca.expasy.org/）网站在线 Prot
Param 预测其分子式为 C761H1184N204O220S10，分子量
大小约为 17 031.6 Da，预测等电点为 7.70，亲水性
总 和（Grand average of hydropathicity，GRAVY） 为
-0.353，属于亲水性蛋白 ；利用 Signal 3.0 Server 和
TMHMM 在线分析发现该氨基酸序列不含信号肽，
且无跨膜结构域。
Blast 结果显示，推导的氨基酸序列与拟穴青蟹
（Scylla paramamosain）的 nm23 一致性最高（99%）；
其次为中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），达到 98% ；
与 凡 纳 滨 对 虾（Litopenaeus vannamei）、 斑 节 对 虾
（Penaeus monodon） 和 罗 氏 沼 虾（Macrobrachium
rosenbergii）nm23 的一致性均为 90%。该氨基酸序
列由一个 NDPK 结构域组成，包含 11 个 NDPK 活
性 位 点（Lys-11、Tyr-51、Phe-59、Arg-87、Thr-93、
2016,32(4) 97徐晴等：三疣梭子蟹 nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析
Arg-104、Asn-114、His-117、Ser-119、Asp-120 和
Glu-128） 和 9 个 多 肽 结 合 位 点（Val-15、Ile-20、
Gly-21、Glu-22、Lys-25、Glu-28、Met-37、Lys-38
和 Tyr-39）， 其 活 性 位 点 结 构 域 为 NXXH［G］SD
（图 2）。根据三疣梭子蟹 nm23 及其他物种的 nm23
氨 基 酸 序 列， 利 用 MEGA 4.0 软 件 的 邻 接 距 离
（Neighbor-joining）法构建进化树，结果（图 3）显示，
所有物种的第一类 nm23 和第二类 nm23 分别聚为一
支 ；三疣梭子蟹 nm23 与其他甲壳动物 nm23 聚在一
起，均属于第一类 nm23，且与脊椎动物的 nm23 的
1 和 2 亚型亲缘关系较近。
2.2 三疣梭子蟹nm23在不同组织中的表达差异
实 时 荧 光 定 量 PCR（qPCR） 结 果（ 图 4） 显
示，nm23 在三疣梭子蟹各组织中均有表达，其表达
水平在眼柄（Es）、肌肉（Ms）和 Y 器（Yo）中最
高，卵巢（Ov）和肝胰腺（Hp）次之，其他组织中
1
73
145
1
217
25
289
49
361
73
433
97
505
121
577
145
649
721
图 1 三疣梭子蟹 nm23 全长 cDNA 核苷酸序列和编码区氨基酸序列
-20 -10 0 10
70 80 90 100 110 120 130 140 150
20 30 40 50 60
Portunus trituberculatus. nm23
Scylla paramamosain. nm23
Eriocheir sinensis. nm23
Litopenaeus vannamei. nm23
Penaeus monodon. nm23
Macrobrachium rosenbergii. nm23
Dania rerio. nm23-Z1
Dania rerio. nm23-Z2
Mus musculus. nm23-M1
Mus musculus. nm23-M2
Homo sapiens. nm23-H1
Homo sapiens. nm23-H2
Portunus trituberculatus. nm23
Scylla paramamosain. nm23
Eriocheir sinensis. nm23
Litopenaeus vannamei. nm23
Penaeus monodon. nm23
Macrobrachium rosenbergii. nm23
Dania rerio. nm23-Z1
Dania rerio. nm23-Z2
Mus musculus. nm23-M1
Mus musculus. nm23-M2
Homo sapiens. nm23-H1
Homo sapiens. nm23-H2
保守的 NDPK 活性位点用▲标出，多肽结合位点用 * 标出，黑色方框中为 NDPK 活性位点结构域（NXXH［G］SD）
图 2 三疣梭子蟹 nm23 与其他物种 nm23-1/2 同源序列的氨基酸序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.498
nm23 表达水平均较低。
2.3 三疣梭子蟹nm23在卵巢发育中的表达水平
变化
为了研究 nm23 在三疣梭子蟹卵巢发育过程中
的作用，采集各发育期卵巢检测其中 nm23 的相对
表达水平。结果（图 5）显示，在三疣梭子蟹卵巢
发育过程中，nm23 在 I 期表达水平最高，显著高于
其他各期（P<0.05）；随后其表达量开始逐渐下降，
至 V 期降至最低。
3 讨论
本研究根据三疣梭子蟹转录组文库中的 nm23
同源序列，利用 RACE 技术，首次克隆获得了三疣
梭子蟹 nm23 的全长 cDNA 序列。推导的 nm23 氨基
酸序列由一个典型的 NDPK 区域组成，该区域包含
11 个 NDPK 活性位点、9 个多肽结合位点和 1 个保
守的 NDPK 活性位点结构域。三疣梭子蟹 nm23 与
其他甲壳动物的 nm23 一致性较高，均在 90% 以上，
与脊椎动物第一类 nm23 的一致性也达到 70% 以上。
Group I
Group II
图中枝上的数据代表置信度，标尺表示进化距离 ；各序列 GenBank 登录号在基因名后的括号里显示 ；三疣梭子蟹 nm23 用方框标出
图 3 邻接法构建的基于 nm23 氨基酸序列的系统进化树
2016,32(4) 99徐晴等：三疣梭子蟹 nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析
进一步构建系统进化树发现甲壳动物 nm23 与第一
类 nm23 聚为一支，这表明目前甲壳动物克隆获得
的 nm23 均为第一类 nm23，甲壳动物中是否存在第
二类 nm23 还需进一步证实。值得注意的是，在已
知甲壳动物的 nm23 中，罗氏沼虾 nm23 拥有延伸的
C 末端和 N 末端，其可能是甲壳动物 nm23 的另一
种亚型［25］，该亚型是否存在于三疣梭子蟹中还有待
进一步研究。
与脊椎动物第一类 nm23 一样，甲壳动物 nm23
也广泛存在于各个组织中，但在不同物种中，其
主要表达的组织并不一致。例如，在罗氏沼虾中，
nm23 在肌肉中、肝胰腺、精巢和卵巢中均有较高
的表达［25］；在中华绒螯蟹中，除肌肉和肝胰腺外，
nm23 在鳃和心脏中也有较高的表达［24］。本研究中，
三疣梭子蟹 nm23 在肌肉、卵巢和肝胰腺中均有较
高的表达，与之前报道相符 ；但不同的是，nm23 在
三疣梭子蟹的 Y 器和眼柄中也存在较高的表达，这
可能与罗氏沼虾和中华绒螯蟹中并未检测 nm23 在 Y
器和眼柄中的表达情况有关。在斑节对虾中，nm23
虽然在雌蟹眼柄中表达水平最高，但在雄蟹眼柄中
却极低［26］；且其在卵巢和肝胰腺中表达水平较低，
与本研究结果也不一致。因此，nm23 在甲壳动物中
的组织分布特性并不明确，可能因种而异。
三疣梭子蟹的卵巢发育过程主要经历了卵原细
胞的增殖（I 期）、内源性卵黄合成期（II）、外源性
卵黄合成期（III）、近成熟期（IV 期）和成熟期（V
期）等阶段［27］。三疣梭子蟹 nm23 在卵巢发育的 I
期表达水平最高，之后随着卵巢发育的进行，其表
达水平逐渐下降，并在成熟期降至最低。该结果与
罗氏沼虾 nm23 的研究结果相一致［25］，这表明 nm23
可能抑制甲壳动物的卵巢发育过程。此外，Hsieh 和
Wu［29］认为 nm23 可以通过抑制 B 型细胞周期蛋白
（Cyclin B）从而阻止细胞从 G2 期向 M 期转化。三
疣梭子蟹 nm23 是否也是通过 Cyclin B 实现对卵母细
胞减数分裂的负向调控还需进一步研究。
4 结论
本研究首次克隆获得了三疣梭子蟹 nm23 基因
的全长 cDNA 序列，其氨基酸序列与已知甲壳动物
的 nm23 一致性达到 90% 以上，且与哺乳动物第一
类 nm23 亲缘关系较近。组织差异表达分析显示，
三疣梭子蟹 nm23 在三疣梭子蟹各组织内均有表达，
其表达水平在眼柄、肌肉和 Y 器中最高，卵巢和肝
胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，卵巢中
nm23 的表达水平在Ⅰ期最高，之后逐渐下降，在成
熟期降至最低，这表明 nm23 可能参与调控三疣梭
子蟹的卵巢发育。
参 考 文 献
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7
6
5
4
3
2
1
0
Ep
c c c
b
b
c c
c
a
aa⴨ሩ㺘䗮䟿
Te Ov Hp Mo Ms Es Yo Ht Br Tg
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
⴨ሩ㺘䗮䟿
I
a
b
c
cd d
II III IV V
Ep ：皮 ；Te ：精巢 ；Ov ：卵巢 ；Hp ：肝胰腺 ；Mo ：大颚器 ；Ms ：肌肉 ；
Es ：眼柄 ；Yo ：Y 器 ；Ht ：心脏 ；Br ：脑 ；Tg ：胸神经节。不同字母表示显
著性差异（P<0.05），下同
图 4 三疣梭子蟹 nm23 在不同组织里的表达水平
图 5 三疣梭子蟹第一次卵巢发育过程中 nm23 在卵巢中的
表达水平变化
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（责任编辑 狄艳红）