全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):138-145
脂肪酸是一类重要的营养成分，对人体起着十
分重要的作用，尤其是高度不饱和脂肪酸（Highly
unsaturated fatty acid，HUFA），能降低心脑血管疾
病［1］，抗衰老［2］，促进婴幼儿发育，增强记忆力［3］，
同时对能量代谢、维持细胞膜结构与功能以及信号
转导等生命活动有着至关重要的作用［4］。脂肪酸
去饱和酶和碳链延长酶是 HUFA 合成过程中的关键
酶［5，6］。动物脂肪酸去饱和酶主要有 4 种，包括△9
收稿日期 ：2015-01-19
基金项目 ：国家“863”高技术研究发展计划项目（2012AA10A409-5），国家自然科学基金项目（31472287，41276158），科技部港澳台科
技合作专项（2014DFT30270），上海教委知识服务平台项目（ZF1206）
作者简介 ：施秋燕，女，硕士研究生，研究方向 ：分子营养 ；E-mail ：shiqy1105@163.com
通讯作者 ：杨志刚，男，博士，研究方向 ：分子营养 ；E-mail ：zgyang@shou.edu.cn
三疣梭子蟹 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因全长 cDNA 克隆与
组织表达
施秋燕  杨志刚  王伟  姚琴琴  王瑶  成永旭
（上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）
摘 要 ： 旨在探讨三疣梭子蟹高度不饱和脂肪酸自身合成能力，探究三疣梭子蟹 HUFA 生物合成途径。采用 cDNA 末端快
速扩增（RACE）技术克隆得到三疣梭子蟹△ 6 去饱和酶 cDNA 全长序列，并利用荧光定量 PCR 技术进行肝胰腺、肠道、鳃等 8
种组织的表达分析。通过分析序列表明，基因序列全长 2 875 bp，其中 5 非编码区长 465 bp，3 非编码区长 1 078 bp，开放阅读框
（ORF）长 1 332 bp，编码 443 个氨基酸 ；并且编码的蛋白序列具有典型的去饱和酶特性 ：3 个组氨酸保守区，一个 N 端细胞色素
b5 结构域以及一个血红素结合的 HPGG 结构域。荧光定量 PCR 结果显示，Δ6 脂肪酸去饱和酶基因在三疣梭子蟹多个组织中均有
表达，在肝胰腺中表达量最高，其次是肠道和肌肉，心脏中表达最少。结果表明三疣梭子蟹具有△ 6 去饱和酶。
关键词 ： 三疣梭子蟹 ；脂肪酸去饱和酶 ；组织表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.019
Cloning and Tissue Expression of Full-length cDNA in Gene Encoding
Δ6-desaturase Fatty Acyl of Portunus trituberculatus
Shi Qiuyan Yang Zhigang Wang Wei Yao Qinqin Wang Yao Cheng Yongxu
（The College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract: The goal of this work is to investigate the self-synthesis capability of highly unsaturated fatty acid（HUFA）and understand
the synthesis pathway of HUFA in Portunus trituberculatus. Full-length cDNA of gene for Δ6-desaturase fatty acyl in P. trituberculatus was
cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE）, and the expressions in 8 tissues such as hepatopancreas, intestine and gill etc. were
analyzed by real-time quantitative PCR（qRT-PCR）. Analysis of the full-length cDNA of gene for Δ6-desaturase fatty acyl revealed that it
was 2 875 bp, including 465 bp of 5 UTR and 1 078 bp of 3 UTR, and encoded 443 amino acids. The presumed protein sequence had a typical
desaturase structure ：3 histidine-rich motifs, a b5 domain of an N terminal cytochrome and a heme-binding HPGG domain. qRT-PCR showed
that gene for Δ6-desaturase fatty acyl expressed in all 8 tissues while the highest in hepatopancreas, less in intestine and muscle, and the least in
the heart. The results indicate that P. trituberculatus possesses Δ6-desaturase fatty acyl.
Key words: Portunus trituberculatus ；fatty acid desaturase ；tissue expression analysis
2015,31(9) 139施秋燕等：三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长 cDNA克隆与组织表达
去饱和酶、△5 去饱和酶、△6 去饱和酶和△4 去饱
和酶，其中△6 去饱和酶为第一限速酶。这种膜结
合的蛋白酶催化 HUPA 生物合成的第一步，能分别
将亚油酸（C18 ：2n-6）和亚麻酸（C18 ：3n-3）催
化 为 C18 ：3n-6 和 C18 ：4n-3［7，8］。 除 此 之 外， 有
研究表明△6 去饱和酶是 EPA 和花生四烯酸合成过
程中的限速关键酶［9，10］。△6 去饱和酶在水产动物，
尤其是水产脊椎动物上的研究较多。研究者们分别
从 虹 鳟（Oncorhynchus mykiss）［11］、 斑 马 鱼（Danio
rerio）［12］、 鲤 鱼［13］、 大 西 洋 鲑（Salmo salar）［14］、
军曹鱼（Rachycentron canadum）［15］ 等多种脊椎鱼
类中克隆得到△6 去饱和酶基因全长。然而这在
甲壳动物中研究甚少，仅在中华绒螯蟹（Eriocheir
sinensis）［16］有过报道。
三 疣 梭 子 蟹（Portunus trituberculatus） 俗 称 梭
子蟹，属甲壳纲，十足目，梭子蟹科，是我国重要
的经济海水蟹类，其营养丰富，滋味独特，深受
人们的喜爱。其中，HUFA 在三疣梭子蟹中发挥十
分重要的生理功能，能够促进蟹类生长及性腺发
育［17-19］。现在水产养殖业中，对经济蟹类的营养需
求方面多集中在中华绒螯蟹上，对三疣梭子蟹脂肪
酸需求，特别是对 HUFA 需求报道甚少。鉴于此，
我们试从分子学角度入手，首次克隆三疣梭子蟹△6
去饱和酶基因全长，同时进行相关生物学分析，并
构建其组织表达谱，旨在为进一步研究三疣梭子蟹
△6 去饱和酶功能，探明三疣梭子蟹 HUFA 合成机
理奠定分子基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验中所用三疣梭子蟹，雌雄（雌 126±10 g，
雄 212±10 g）各 3 只，均购自上海芦潮港水产市场。
解剖三疣梭子蟹，取其肝胰腺、胸神经节、心脏、
肌肉、眼柄、肠道、胃、鳃共 8 种组织存于 -80℃冰
箱作为实验样品。
实 验 室 所 用 的 试 剂 均 来 自 日 本 TaKaRa 公 司
（RNAisoTM Plus、Reverse Transcriptase、dNTPs、rTaq
聚合酶、DNA Marker、pMD19-T Simple 载体试剂盒、
IPTG、X-Gal、SYBR Premix Ex TaqTM、琼脂糖）、天
根生化科技有限公司（氨苄青霉素、TOP10 感受态
细胞、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒）、Clontech 公司
（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage
2 PCR Kit）；、生工生物工程有限公司（无菌去离子
水、DEPC 水、50×TAE buffer、5×TBE buffer）、上
海赛百盛基因技术有限公司（核酸染料 Gold view）
及国药集团化学试剂有限公司（酒精、三氯甲烷等）。
1.2 方法
1.2.1 核 酸 的 提 取 和 反 转 录 参 照 RNAisoTM Plus
（TaKaRa）操作说明书，取三疣梭子蟹肝胰腺样品
提取总 RNA，经 1% 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光
光 度 计（Q5000） 检 测 RNA 完 整 度 及 浓 度。 根 据
PrimscriptTM Reverse Transcriptase（TaKaRa）说明书，
取 1.0 μg 三疣梭子蟹肝胰腺总 RNA 反转录成模板第
一链 cDNA。
1.2.2 引物设计及序列验证 根据实验室所构建
的三疣梭子蟹肝胰腺 cDNA 文库，通过 NCBI blast
比对发现，有一预测的 Δ6 去饱和酶基因序列片
段与中华绒螯蟹的 Δ6 去饱和酶（GenBank 登录号
JX946434）相似度十分高。根据已知片段序列设计
一对上下游引物（表 1），PCR 扩增，按照琼脂糖凝
胶 DNA 回收试剂盒（天根）回收纯化，并送上海工
程生物工程公司测序，对已知序列进行验证。
1.2.3 △6 去饱和酶基因的克隆 根据已验证的序
列， 设 计 3-FAD RACE 上 游 引 物 和 5-FAD RACE
下 游 引 物（ 表 1）。 利 用 SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit（Clontech）试剂盒反转录合成 3-
cDNA 第 一 链 和 5-cDNA 第 一 链， 作 为 基 因 3 和
5 端序列快速扩增的模板，并按照 SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit 说明书上的反应体系及反应
条件进行三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶基因的扩增。
PCR 反 应 体 系 ：3-cDNA（5-cDNA） 模 板
2.5 μL，10 μmol/L 的 3-FAD（5-FAD） 引 物 1.0
μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50× Advantage 2
Polymerase Mix 1.0 μL，10×Advantage 2 PCR buffer
缓冲液 5.0 μL，UPM 通用引物 5.0 μL，加无菌去离
子水至总体积 50.0 μL。反应条件 ：94℃ 30 s，72℃
3 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，
5 个循环 ；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25 个
循环。RACE PCR 产物进行胶回收、克隆并送上海
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9140
生工生物工程公司测序。
1.2.4 目 的 基 因 序 列 分 析 利 用 NCBI Vecscreen
网站去除测序结果的载体序列，然后进行片段的
拼接。开放阅读框的寻找利用 ORF（Open reading
frame）finder 软 件 ；序 列 翻 译 和 蛋 白 质 相 似 性 分
析利用 ClustalW 及 DNAMAN 等软件 ；相对分子量
和蛋白质等电点的计算使用 Compute pI/Mw（http ：//
web.expasy.org/compute_pi/）；系 统 进 化 树 构 建 用
MEGA6.0 软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）进行。
1.2.5 Δ6 去饱和酶基因在各组织中的表达 将已
获得的各组织 cDNA 作为模板，通过克隆得到的全
长序列设计荧光定量 PCR 引物（表 1）。根据 Livak
等［20］提出的相对标准曲线法 2-∆∆Ct，以三疣梭子蟹
β-actin 基因（GenBank 登录号 FJ641977.1）为内参，
雌雄各 3 只，每个组织分别 3 个重复。利用 CFX96
仪器进行标准曲线的制作及不同组织荧光定量 PCR
的扩增。标准曲线的制作以肝胰腺 cDNA 为模板，
以 5 倍梯度进行稀释，分别进行 Δ6 去饱和酶基因和
β-actin 基因引物的荧光定量 PCR，得出各稀释模板
Ct 值，制作标准曲线，反应体系 ：SYBR Premix Ex
TaqTM（2×）12.5 μL，上下游引物各 0.25 μL，cDNA
模板 2 μL，加去离子水至终体积为 25 μL ；反应程
序为 ：95℃ 30 s ；95℃ 5 s，62℃ 30 s，40 个循环，
65℃至熔解曲线。利用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，
数据均用平均值 ± 标准差（x
-
±s）表示。
2 结果
2.1 Δ6去饱和酶基因cDNA的序列分析
从三疣梭子蟹肝胰腺中提取总 RNA，反转为模
板，设计验证引物扩增获得三疣梭子蟹 Δ6 去饱和
酶基因部分片段，大小为 953 bp，与实验室基因库
中预测结果相符（图 1-A），初步确定为三疣梭子蟹
Δ6 去饱和酶基因。根据已验证的引物设计 RACE 引
物，经过 3-RACE PCR 和 5-RACE PCR 扩增后分别
获得 1 367 bp（图 1-B）和 1 259 bp（图 1-C）片段，
与预期片段大小基本一致。拼接测序结果，该基因
全长 2 875 bp，其中包括 465 bp 的 5 非编码区（UTR），
1 078 bp 的 3 非编码区（UTR），开放阅读框（ORF）
长 1 332 bp，编码 443 个氨基酸，同时具有加尾信
号（AATAAA）以及 Poly-A 尾（图 2）。分析序列表
明，编码理论等电点为 8.52，分子量为 50.62 kD 的
氨基酸。同时，该序列具有典型的组氨酸簇保守区
域，HNXFH（ 第 186-190 位 ）、HALSHH（ 第 214-
219 位）和 HTLHH（第 378-382 位），属于典型的
去饱和酶结构［16，22］。经 BLASTn、BLASTp 等比对
表明，此序列与中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）Δ6
去饱和酶基因序列具有高度的相似性，由此初步确
定此序列为三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶序列。
表 1 核苷酸引物序列
引物名称 核苷酸序列（5-3） 用途
FAD-F1 GGCAAAATGTGGATAGAGGT RT-PCR
FAD-R1 GTGGGCAGGAGATGGTGAAG RT-PCR
3-FAD TGACTGGGGACTGTGCCAGCTAGATG 3 RACE
5-FAD GGTCCAAGTGGGAGCAAGGCGAA 5 RACE
RT-FAD-F CCATGATGGAGACAAGATGAGAGA Real-Time PCR
RT-FAD-R GGTCAACAGTGGGCAGGAGAT Real-Time PCR
β-actin（+） TTTCACACACTGTCCCCATCTAC Real-Time PCR
β-actin（-） CACGCTCGGTCAGGATTTT Real-Time PCR
2000
953
bp bpbp
1 M 2M 3M
1000
1367
bp
1259
750
A B C
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：Δ6 去饱和酶基因部分片段 PCR 扩增结果 ；
2 ：Δ6 去饱和酶基因 3 RACE PCR 扩增结果 ；3 ：Δ6 去饱和酶基因 5 RACE
PCR 扩增结果
图 1 三疣梭子蟹Δ6 去饱和酶基因 PCR 扩增产物
2.2 三疣梭子蟹Δ6去饱和酶氨基酸同源性分析及
系统进化树的构建
使用 ClustalX 软件将三疣梭子蟹去饱和酶氨基
酸序列与其他代表性的脊椎动物与无脊椎动物进行
Δ6 去饱和酶氨基酸多序列比对。结果（图 3）表
明，三疣梭子蟹的 Δ6 去饱和酶氨基酸与中华绒螯蟹
（Eriocheir sinensis）、大西洋鲑（Salmo salar）、罗非
鱼（Oreochromis niloticus）、利什曼原虫（Leishmania
donovani）以及线虫（Caenorhabditis elegans）的 Δ6
2015,31(9) 141施秋燕等：三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长 cDNA克隆与组织表达
实线框表示起始密码子及终止密码子 ；虚线框表示 Ploy（A）加尾信号 AATAAA ；下划线表示 3 个保守的组氨酸簇结构域
图 2 三疣梭子蟹Δ6 去饱和酶氨基酸全长 cDNA 序列及推测的氨基酸序列
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
ACATGGGGACATAAGGCGAGACAAAAGCAGACAGTGAAGGAAGTAGTGAGGAAGTATTAG
TATGTAAGAGCGTTAGAGTAACAAAAGTATTCCTGAGTCAACCTGAGATTTATCTACCAC
CTTCTCTAGAGACCCAGCCGTCCATAAAACTGTCTCACAATGAAGGAAAATTTGGCAAAC
CTTATTCAGTTCAGTGAGGAAAATTAAGGACACAATGTCACCGAGACGAGGATGACAAGA
AGAACTGCGCCAAGGCCAGCAGTATCAAGGAAGATATATAGAGATAGACATTCCTTGGTC
AATGTGATAATTGCTGTCTTCGTTGTTATATCAAGTACTCAAGTTACAAGACACTATTCC
ATCATCGGCTGGCCTCAAACGTCAAGTAAACGTGATTCACAGGCCGTGAATCCAGCGTGA
TTGTTGGTGTTGCCCTTGGCGGAATATAGAAGATCATCCTGAAGCATGCCACTTCGTCAG
M P L R Q
AGTGACCGCCAAGGTGGTGCTGGGACCAACCTCAAGTTAACTGCTTATAAGAAGTTTCCT6 5 4 * * $ * 7 1 / . / 7 $ < . . ) 3
ACAAACTATCCTCATCGGAATACAGATCTGTGGTTAAGTGGTAAAAGAATTGATGACAAC
T N Y P H R N T D L W L S G K R I D D N
ATTGGTCCCTACTGGAGGATACACAACAAGCTGTATGATCTAACAGACTTCGCTGACCGC
I G P Y W R I H N K L Y D L T D F A D R
CACCCAGGAGGCAAAATGTGGATAGAGGTTACCAAGGGCACAGACATCACTGAAGCCTTT
H P G G K M W I E V T K G T D I T E A F
GAGAGTGCTCATATTAGTGGAAATGCTGAGAAGCTCCTTAAAAAATTCTTTGTTAAAGAT
E S A H I S G N A E K L L K K F F V K D
ATTTCAACACCTAGGAACTCTCCTTATACATTTCATGAAGATGGTTTTTACAAAACATTC
I S T P R N S P Y T F H E D G F Y K T F
AAAAGAAAGGTGCAACCTATCCTGAAAGAAATAGGTACTGGACCTCCATGGAAAAGTTTG
K R K V Q P I L K E I G T G P P W K S L
CTGATCCAAGATGGTTTAACCCTTGCCTTTGTTGGCCTGACAATTGCTTCTTCTGTTTTA
L I Q D G L T L A F V G L T I A S S V L
TCTTCATTTACTCTTGCAGCTTTTGCAGGTGCTATCCTGAGCCTGGTCATATCATGTGCC
S S F T L A A F A G A I L S L V I S C A
CACAACTTCTTCCACCAGAGAGACAACTGGAGGATGCATTACTTTGATTTGTCCTTTGCT
H N F F H Q R D N W R M H Y F D L S F A
ACTGCATATGACTGGCGTGTGACTCATGCACTTTCACATCACCTCTACACTAACACTGCC
T A Y D W R V T H A L S H H L Y T N T A
AATGATATTGAAATATCTATTTTCGTGCCACTATGGGAGTATTTACCAAAACCCGACAAA
N D I E I S I F V P L W E Y L P K P D K
ACTTTGCTCCAGAGATATGGGACTATTATCTATGAGTTCGCCTTGCTCCCACTTGGACCA
T L L Q R Y G T I I Y E F A L L P L G P
CCCTTTCACCACCATATGCAGAATATCTATGCAGCGTATGTTAAGGGTAGAGCACCTCCC
P F H H H M Q N I Y A A Y V K G R A P P
CCGGGGGAATTTGCACAGTATTCTGTGTTGTTCGTGATGGCTATCTTTTCCCAATCTTTT
P G E F A Q Y S V L F V M A I F S Q S F
TGGCTTGCACTCAGATTATTTGTGGCACTGCATGTGACTGCACATTTGGTATTCTCATTT
W L A L R L F V A L H V T A H L V F S F
ATTGGCTTGACAGCAGCCCACCACCATCCTGATATTTTCCATGATGGAGACAAGATGAGA
I G L T A A H H H P D I F H D G D K M R
GATGATCCTGACTGGGGACTGTGCCAGCTAGATGCAGTGAGAGACAGGACGGAAGTTACT
D D P D W G L C Q L D A V R D R T E V T
GGCAACTTGCTAATGGTGTTGACAACTTTTGGTGACCACACTCTTCACCATCTCCTGCCC
G N L L M V L T T F G D H T L H H L L P
ACTGTTGACCACTCCAAGTTGAGCAGCCTCTACCCAGTCTTCTTGGAAACATGCAAGGAG
T V D H S K L S S L Y P V F L E T C K E
TTCAATGTGCCATTTTCCTTTATGAGTTGGCAAACTTTATTTACTGGAAGATACTTGCAG
F N V P F S F M S W Q T L F T G R Y L Q
ATGGCTAATATTACCCCAAACCCTAACCATCCAGGCTATAAAGCTAAAGTGTCCTAAAAA
M A N I T P N P N H P G Y K A K V S *
TCACAATAATTAGGAGTAACTTTAGGGGAATTGGTATTATTATGTAGTTAATTACACCAA
TTCTTTTGATTTAGTAAAAAAAATAGTTACCATAGACTAATTTACCTATTTATGTTTAC
TCTGATGCCTCACAAGAGAAATAACATTAAATTTGCCTTAAAATTTGTGATATGATGAGA
AGGAAGCTCTAAAATCAAACATATGAATGTTATCTGGTGAATGCATGTGTATGGGTATTT
TATAATAGGTACTCCATTTTGTTTTTGATACACCTTTGTGGTTGTCTCACCTTACCTTAC
CTTCCATATGCAGAAAATTAGCAATCAAGGGGGAAAACATTGTTATCACTTCATACCACT
CACTGAGCCAAAGTAAATATGAAGGAATTGAAGGAAAGCAGAAATATTACAGTTTCTATA
TTAACAGAAAATATTATTCAGCAGATTATATGTACGTTCTAGATGCTGCATTATTTGCTC
ACTACAAGTGAGACAACAATGTTGTGATTTATTGTATATTTAACATAGAAGAAAGAATTC
TGGAATTAAGAGAATATGTGCATGATCAATTAAGCTTAAAAGGTATTTCACCTTTAGGAC
ACAGTATGCATATAAATCACATTGCTAAAAGGCCTCCCCTTGTATGACAGTAATGCGGAC
TGCGACCACAGTCTCAAAGTTGGATTGTAACACAAAATTGGTGCACAAACCAATTTATTA
TAAAACTAGTGTGGCCACCATCACCCCAACAGACCTCAAAAAATAGCACAGTTAGCATTT
CTGGACAAAATACCTTAATGGGAAGCTGCTACGCAACACCCATAACAATCTGCATAAACA
TATTAACCTTACATTATCACCAGTTTCCTGACACCATCGTCAAATGCTGCATTAGTACCA
AAAGAAAAGCTAATAAGTAGTTCTAGAATAACTTGAAAACTTTTAAATGTGCCTATTCTT
TTGCTGACTGATGTCATGGGTGATACTCAAGAATAAAATTTTCAAATAAAATTGCCTGTA
TATGTAATATACAGCTATAATTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9142
去饱和酶氨基酸都具有一个血红素结合的 HPGG 保
守结构域，相似性分别为 66%、37%、37%、24%
和 40%。与人（Homo sapiens）的 Δ6 去饱和酶氨基
酸相似性要高于与 Δ5 去饱和酶氨基酸的相似性，分
别为 39% 和 32%。
利用 MEGA6.0 软件的邻接法（Neighbor-Joining）
将相关代表脊椎动物和无脊椎动物的 Δ6 去饱和酶氨
基酸序列构建发育树。此外，该发育树还包括可能
存在于脊椎动物中的另一种与 Δ6 去饱和酶相似度较
大的膜结合蛋白 Δ5 去饱和酶。脊椎动物中，包括
鱼类的很多 Δ6 去饱和酶已经被确定，但是在无脊
椎动物中被确定较少。因此选择所做的鱼类和其他
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
Portunus trituberculatus
Eriocheir sinensis
Salmo salar
Oreochronuis niloticus
Leishmania donovani
Homo sapiens
90
90
87
78
49
79
177
177
177
168
136
169
247
247
267
258
225
258
247
247
267
258
225
258
337
336
357
348
315
348
426
425
440
431
401
431
443
442
454
445
414
445
图 3 三疣梭子蟹与其他物种Δ6 去饱和酶氨基酸序列比较
脊椎动物发育树的分支比无脊椎动物的分支要宽广，
共同聚成一大支。同时，三疣梭子蟹的 Δ6 去饱和酶
与中华绒螯蟹的 Δ6 去饱和酶同聚一小支，形成单独
的一体，表明这两个物种亲缘关系接近。
2.3 三疣梭子蟹Δ6去饱和酶mRNA不同组织的表
达分析
绘制得到的 Δ6 去饱和酶基因和 β-actin 基因的
标准曲线分别为 ：y=-3.260x+33.59，R2=0.997，扩增
2015,31(9) 143施秋燕等：三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长 cDNA克隆与组织表达
效 率 E 为 102.6% ；y=-3.203x+30.72，R2=0.992， 扩
增效率 E 为 105.2%，因此满足 2-ΔΔCt 法。
取三疣梭子蟹成蟹的肠、胃、心脏、肝胰腺、
胸神经节、肌肉、眼柄和鳃 8 个组织，利用荧光定
量 PCR 方法研究三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶 mRNA 的
组织表达特征，设定三疣梭子蟹在心脏中的表达量
为 1，根据 Δ6 去饱和酶在各个组织中的相对表达
量作柱形图。结果（图 5）显示，Δ6 去饱和酶在上
述所有检测的组织中均有表达，且在三疣梭子蟹的
肝胰腺中表达量最高，表达水平显著高于其他组织
（P<0.05）；其次是肠道和肌肉组织 ；在心脏、胸神
经节、眼柄、鳃和胃组织中微量表达。
合成过程中起着关键限速酶的作用［13］。在所有已知
结构的去饱和酶中都有一个典型的特征 ：3 个典型
的组氨酸簇保守域，一个细胞色素 b5 结构域和一个
血红素结合的 HPGG 结构域［21，22］。本实验所克隆
的三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶基因与上述特征完全相
符，初步确定为三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶基因。分析
多序列比对结果，三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶氨基酸与
人的 Δ6 去饱和酶氨基酸相似性高于 Δ5 去饱和酶氨
基酸，同时与中华绒螯蟹 Δ6 去饱和酶氨基酸的相似
性为 66%，因此初步确定为三疣梭子蟹 Δ6 去饱和
酶基因。在构建三疣梭子蟹、多种鱼类、小鼠、人
和中华绒螯蟹的进化发育树中，三疣梭子蟹和中华
绒螯蟹单独聚为一支，表明两者亲缘关系最近，而
与其他脊椎动物关系较远。
Δ6 去饱和酶作为脂肪酸合成过程中的关键酶，
在组织中广泛表达［15，16，23，24］。本实验荧光定量
PCR 表明，三疣梭子蟹 Δ6 去饱和酶 mRNA 在胃、
心脏、胸神经组织、肌肉、肝胰腺、肠道、眼柄和
鳃组织中均有表达。Δ6 去饱和酶在三疣梭子蟹肝胰
腺中表达量最高，这与前人研究中 Δ6 去饱和酶基因
在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［23］和中华绒螯（Eri-
ocheir sinensis）［16］等的表达情况均一致。有研究认
为［25，26］，Δ6 脂肪酸去饱和酶基因在肝脏中的高表
达与肝脏参与调控脂肪酸的新陈代谢有关。可见肝
胰腺作为脂类代谢中心在三疣梭子蟹生命过程中极
其重要。
实验结果显示 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因在肠道
中表达量相对较高，表明肠道可能是合成 HUFA 的
Dicentrarchus labrax Δ6FADCAN99564
Scophthalmus maximus Δ6FADAAS49163
Oreochromis niloticus Δ6FADBAB62850
Salmo salar Δ6FADNP 001165251
Oncorhynchus mykiss Δ5FADAFM77867
Homo sapiens Δ6FADAAD20018
Mus musculus Δ6FADADZ54083
Leishmania donovani Δ6FADXP 003859509
Eriocheir sinensis Δ6FADAFV15455
Portunus trituberculatus Δ6FAD
100
100
100100
96
47
76
0.2
图 4 基于Δ6 去饱和酶氨基酸序列的 NJ 系统进化树
0
10
20
30
40
50 㛳 㜨 ᗳ 㚼㓴㓷 㛍 㛐 ⵬ 勳
400
200
m
R
N
A
⴨ሩ㺘䗮䟿 600800
不同字母代表与对照组间差异显著（P<0.05）
图 5 三疣梭子蟹Δ6 去饱和酶基因 mRNA 组织表达图谱
3 讨论
去饱和酶基因家族在脂肪酸代谢调节中有着十
分广泛而又不可或缺的功能，Δ6 去饱和酶在 HUFA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9144
重要部位。在大西洋鲑鱼［27］、建鲤［24］Δ6 去饱和酶
基因 mRNA 组织表达研究中发现，其在肠中表达量
均较高 ；由此可见，肠道在 HUFA 合成过程中必定
发挥着重要作用。2001 年，Seiliez 等［23］在虹鳟幼
鱼 Δ6 脂肪酸去饱和酶 mRNA 组织定量表达时发现，
该基因在脑、肝脏和鳃等组织中高表达，而在肌肉
中的表达量则较低，这与本实验在成蟹肌肉中表达
较高的结果有所不同。许友卿［15］、任洪涛［24］等同
样在军曹鱼幼鱼、建鲤幼鱼组织表达中发现，Δ6 脂
肪酸去饱和酶基因在幼鱼肌肉组织中表达量较低。
究其原因，可能与所研究物种的发育阶段有关。有
研究表明，水产动物组织中脂肪酸的功能就是为机
体提供三磷酸腺苷（ATP）［28］，因此肌肉中高表达
的 Δ6 脂肪酸去饱和酶预示着成蟹肌肉较幼蟹肌肉功
能更完善。
目前研究表明，Δ6 脂肪酸去饱和酶通常参与
C18 多不饱和脂肪酸（PUFA）转化为 C20 的 HUFA
的过程。一般认为海水蟹类合成 HUFA 的能力较弱，
但是缺乏相关的功能验证，故此初步确定的三疣梭
子蟹 Δ6 脂肪酸去饱和酶基因是否具有合成 HUFA
的能力及合成能力的大小还有待进一步研究。
4 结论
本实验首次成功克隆获得三疣梭子蟹 Δ6 去饱
和酶基因全长 cDNA 序列，该序列全长 2 875 bp，
ORF 长 1 332 bp，编码 443 个氨基酸，具有典型的
去饱和酶特征。系统进化树符合物种传统分类进化
原则，进化结果显示三疣梭子蟹与中华绒螯蟹亲缘
关系最近。该基因在肝胰腺中高表达，其次是肠道
和肌肉，其他组织少量表达。
参 考 文 献
［1］Rasmussen BM, Vessby B, Uusitupa M, et al. Effects of dietary
saturated, monounsaturated, and n-3 fatty acids on blood pressure in
healthy subjects［J］. Am J Clin Nutr, 2006, 83（2）：221-226.
［2］Rapoport SI, Rao JS, Igarashim M. Brain metabolism of nutritionally
essential polyunsaturated fatty acids depends on both the diet and
the liver［J］. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 2007, 77
（5-6）：251-261.
［3］王景梓 , 徐贵发 . n-3 多不饱和脂肪酸的药理作用［J］. 食品与
药品 , 2005, 7（7）：64-66.
［4］Kuriki K, Hirose K, Wakai K, et al. Breast cancer risk and
erythrocyte compositions of n-3 highly unsaturated fatty acids in
Japanese［J］. Int J Cancer, 2007, 121（2）：377-385.
［5］Cook HW. Fatty acid desaturation and chain elongation in
eukaryote［M］// In Vance DE, Vance JE. Biochemistry of Lipids,
Lipoproteins and Membranchs ：Netherlands Elisevier, Amsterdam,
1996.
［6］Sprecher H. Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty
acids［J］. Biochi Biochys Acta, 2000, 1486（2-3）：219-231.
［7］González-Rovira A, Mourente G, Zheng XZ, et al. Molecular and
functional characterization and expression analysis of a Δ6 fatty acyl
desaturase cDNA of European Sea Bass（Dicentrarchus labrax L.）
［J］. Aquaculture, 2009, 298（1-2）：90-100.
［8］Li SL, Mai KS, Xu W, et al. Characterization, mRNA expression
and regulation of Δ6 fatty acyl desaturase（FADS2）by dietary n-3
long chain polyunsaturated fatty acid（LC-PUFA）levels in grouper
larvae（Epinephelus coioides）［J］. Aquaculture, 2014, 434（20）：
212-219.
［9］ De Antueno RJ, Knickle LC, Smith H, et al. Activity of human Delta5
and Delta6 desaturases on multiple n-3 and n-6 polyunsaturated fatty
acids［J］. FEBS Lett, 2001, 509（1）：77-80.
［10］D’Andrea S, Guillou H, Jan S, et al. The same rat Delta6-
desaturase not only acts on 18- but also on 24-carbon fatty acids
in very-long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis［J］.
Biochem J, 2002, 364（part 1）：49-55.
［11］Owen JM, Adron JW, Middeton C, et al. Elongation and
desaturation of dietary fatty acids in turbot Scophthalmus maximus
L. and rainbow trout Salmo gairdnerii rich［J］. Lipids, 1975, 10
（9）：528-531.
［12］Hastings N, Agaba M, Tocher DR, et al. A vertebrate fatty acid
desaturase with Delta 5 and Delta 6 activities［J］. Proce Nation
Acad Sci USA, 2001, 98（25）：14304-14309.
［13］Zheng X, Seiliez I, Hasting N, et al. Characterization and
comparison of fatty acyl Delta6 desaturase cDNAs from freshwater
and marine teleost fish species［J］. Comp Biochem Physiol B
Biochem Mol Biol, 2004, 139（2）：269-279.
［14］Zheng XZ, Tocher DR, Dickson CA. Highly unsaturated fatty
acid synthesis in vertebrates ：new innsights with the cloning and
characterization of a △6-desaturase of Atlantic salmon［J］.
2015,31(9) 145施秋燕等：三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长 cDNA克隆与组织表达
Lipids, 2005, 40（1）：13-24.
［15］许友卿 , 郑一民 , 丁兆坤 . 军曹鱼△6 脂肪酸去饱和酶的
cDNA 序列克隆与基因表达［J］. 中国水产科学 , 2010, 6（17）：
1183-1191.
［16］Yang ZG, Guo ZH, Ji LY, et al. Cloning and tissue distribution of
a fatty acyl △6-desaturase-like geneand effects of dietary lipid
levels on its expression in the hepatopancreas of Chinese mitten
crab（Eriocheir sinensis）［J］. Comparative Biochemistry and
Physiology, 2013, 165（Part B）：99-105.
［17］Takeuchi T, Nakamoto Y, Hamasaki K, et al. Requirement of n-3
highly unsaturated fatty acids for larval swimming crab Portunus
trituberculatus［J］. Nippon Suisan Gakkaishi, 1999, 65（5）：
797-803.
［18］Wu X, Cheng Y, Sui L, et al. Effect of dietary supplementation of
phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive
performance and offspring quality of Chinese mitten crab,
Eriocheir sinensis（H. Milne-Edwards）, female broodstock［J］.
Aquaculture, 2007, 273（4）：602-613.
［19］丰浪 . 高不饱和脂肪酸（HUFA）对三疣梭子蟹卵巢发育、内
分泌激素以及组织生化组成的影响［D］. 上海：上海海洋大学 ,
2011.
［20］Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））
method［J］. Methods, 2001, 25（4）：402-408.
［21］Hashimoto K, Yoshizawa AC, Okuda S, et al. The repertoire of
desaturases and elongases reveals fatty acid variations in 56
eukaryotic genomes［J］. J Lipid Res, 2008, 49（1）：183-191.
［22］Monroig O, Zheng X, Morais S, et al. Multiple genes for functional 6
fatty acyl desaturases（Fad）in Atlantic salmon（Salmo salar L.）：
Gene and cDNA characterization, functional expression, tissue
distribution and nutritional regulation［J］. Biochim Biophys Acta,
2010, 1801（9）：1072-1081.
［23］Seiliez I, Panserat S, Kaushik S, et al. Cloning, tissue distribution
and nutritional regulation of a Delta6-desaturase-like enzyme in
rainbow trout［J］. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,
2001, 130（1）：83-93.
［24］任洪涛 , 俞菊华 , 徐跑 , 等 . 建鲤两种 Δ6 脂肪酸去饱和酶基
因克隆与表达［J］. 中国生物化学与分子生物学报 , 2012, 28
（7）：677-684.
［25］Zheng X, King Z, Xu Y, et al. Physiological roles of fatty acyl
desaturases and elongases in marine fish ：Characterisation of
cNDAs of fatty acyl △6 desaturase and elovl5 elongase of cobia
（Rachycentron canadum）［J］. Aquaculture, 2009, 290（1-2）：
122-131.
［26］Bell MV, Dick JR, Porter AE. Pyloric ceca are significant sites
of newly synthesized 22 ：6n-3 in rainbow trout（Oncorhynchus
mykiss）［J］. Lipids, 2003, 38（1）：39-44.
［27］Morais S, Monroig O, Zheng XZ, et al. Highly unsaturated fatty acid
synthesis in Atlantic salmon ：characterization of ELOVL5- and
ELOVL2-like elongases［J］. Mar Biotechnol, 2009, 11（1）：
627-639.
［28］Sargent JR, Henderson RJ, Tocher DR. The lipids［M］// Halver
JE. Fish nutrition. 2nd ed. London ：Academic Press, 1989 ：153-
218.
（责任编辑 马鑫）