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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):123-130
虾青素（3，3- 二羟基 -4，4- 二 β-胡萝卜素）是
一种橙红色类胡萝卜素，发现于多种微生物和海洋
动物中，由于其独特的共轭双键结构和羟基，使得
其具有比 β-胡萝卜素和番茄红素更高的抗氧化活性。
收稿日期 ：2015-04-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（20702019），福建省自然科学基金项目（2012J01137），集美大学校科研启动金项目（ZQ2007009）
作者简介 ：郑晨华，男，硕士，研究方向 ：微生物遗传育种 ；E-mail ：zch52840@163.com
通讯作者 ：李利君，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物遗传育种 ；E-mail ：ljli@jmu.edu.cn
法夫酵母中产类胡萝卜素特性与其合成相关基因表达
关系的研究
郑晨华1  杜希萍1  李利君1  李天丽1  曹樱1  倪辉1，2
（1. 集美大学食品与生物工程学院，厦门 361021 ；2. 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，厦门 361021）
摘 要 ： 为研究法夫酵母中类胡萝卜素合成代谢调控机理，通过高效液相色谱法和实时定量 PCR 技术分别对 JMU-VDL668
和 JMU-N3 法夫酵母菌株中类胡萝卜素和类胡萝卜素合成相关基因的表达差异进行分析，并研究了在 JMU-VDL668 菌株培养过程
中添加 β-胡萝卜素对其产虾青素的影响。结果显示，法夫酵母类胡萝卜素代谢途径的关键酶 crtE，crtYB，crtI 和 crtS 基因在 JMU-
VDL668 菌株中的表达水平整体低于 JMU-N3 菌株，而 JMU-N3 菌株中没有检测到 crtR 基因的表达。在 JMU-VDL668 菌株培养过程
中添加 β-胡萝卜素发现，在 72 h 和 96 h 添加时能促进虾青素的合成，其中 96 h 添加时所得虾青素比对照组提高了 83%。结果表明，
这两株菌的产类胡萝卜素特性与类胡萝卜素合成相关基因的表达量存在一定的正相关关系，且 JMU-VDL668 菌株中总类胡萝卜素
细胞产率在一定范围内，可能存在反馈调节机制。
关键词 ： 法夫酵母 ；虾青素 ；实时定量 PCR ；代谢调控
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.016
The Relationship Between Characteristics of Yielding Carotenoid and
Expression of Carotenogenic Genes in Phaffia rhodozyma
ZHENG Chen-hua1 DU Xi-ping1 LI Li-jun1 LI Tian-li1 CAO Ying1 NI Hui1，2
（1. College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021 ；2. Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme
Engineering of Fujian Province，Xiamen 361021）
Abstract: In order to study the metabolic regulation mechanism of carotenoid synthesis in Phaffia rhodozyma, the carotenoid biosynthesis
characteristics and the expression differences of carotenogenic genes in different strains of P. rhodozyma, JMU-VDL668 and JMU-N3 were
analyzed by HPLC and real-time qPCR, respectively. The effects of adding β-carotene during the culture of strain JMU-VDL668 to the yield of
astaxanthin were also analyzed. The results showed that, the expression levels of the carotenogenic genes crtE, crtI, crtYB and crtS of key enzymes
in the metabolic pathway of carotenoid in P. rhodozyma were lower in JMU-VDL668 than JMU-N3, even the expression of crtR was not detected
in JMU-N3. The synthesis of astaxanthin increased when β-carotene was added at 72 h and 96 h of culturing JMU-VDL668, and the astaxanthin
increased 83% while adding β-carotene at 96 h compared to the control group. The results indicated that the characteristics of yielding carotenoid
was positively correlated to the expression level of carotenogenic genes. Moreover, the productivity of cells for total carotenoid in JMU-VDL668
was in a certain range, suggesting that there was a feedback regulation.
Key words: Phaffia rhodozyma ；astaxanthin ；real-time qPCR ；metabolic regulation 
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2124
研究还发现虾青素具有防皮肤癌、抗炎、抗胃癌活
性、保肝、抗糖尿病、心血管疾病的预防、免疫反
应、神经保护等作用，虾青素由于其独特的颜色和
生物活性被广泛应用于水产养殖、医药、保健食品、
化妆品等行业中，具有巨大的前景价值［1］。
法夫酵母（Phafia rhodozyma/ Xanthophyllomyces
dendrorhous）属于真菌界、真菌门、半知菌亚门、
担子菌纲、隐球酵母科、法夫酵母属［2，3］，因其能
天然合成虾青素且具有发酵条件简单易实现工业化
生产等优点而受到广泛关注。法夫酵母中虾青素合
成途径经过学者们的研究已被报道［4，5］，但是其调
控机理还未完全阐明。法夫酵母中虾青素合成途径
先由甲羟戊酸途径（MVA）合成萜类化合物前体——
异戊烯焦磷酸（IPP），IPP 受异戊烯焦磷酸异构酶
基因（idi）表达的异戊烯焦磷酸异构酶作用生成二
甲基丙烯焦磷酸（DMAPP），之后 DAMPP 再结合两
分子的 IPP 生成法尼基焦磷酸（FPP），FPP 在牻牛
儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（crtE）表达的牻牛
儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的作用下合成类胡萝卜
素合成前体——牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。
GGPP 之后再经过番茄红素环化酶基因（crtYB）表
达的八氢番茄红素合成酶，和番茄红素环化酶及八
氢番茄红素脱氢酶基因（crtI）表达的八氢番茄红素
脱氢酶催化生成 β-胡萝卜素，β-胡萝卜素在虾青素
合成酶基因（crtS）表达的虾青素合成酶的作用下
合成最终产物虾青素，其中虾青素合成酶需要细胞
色素 P450 还原酶基因（crtR）基因表达的细胞色素
P450 还原酶作为其辅酶［6］。
近年来有学者利用基因代谢工程技术，对类胡
萝卜素合成相关基因进行异源表达或过量表达研究
法夫酵母中虾青素合成途径的代谢调控机理。Xie
等［7，8］通过组合策略在酿酒酵母中构建一个可调控
表 达 tHMG，crtE，crtYB 和 crtI 基 因 的 β-胡 萝 卜 素
合成途径，使 β-胡萝卜素产量提高 300 多倍，达到
11 mg/g，之后又对前体 FPP 的上游、下游以及支路
代谢流进行有序的调节，平衡类胡萝卜素合成途径
中间产物的利用率，使得类胡萝卜素的细胞产率达
到 20.79 mg/g ；Sören 等［9］通过结合传统诱变和基因
工程技术的手段，在诱变得到高产虾青素的法夫酵
母菌株后过量表达 tHMG、crtE、crtYB 和 crtS 基因，
最终得到一株虾青素细胞产率达 9.1 mg/g 的虾青素
高产菌株 ；Shi 等［10］通过比较不同温度对酿酒酵母
产 β-胡萝卜素以及相关基因的表达情况的影响，发
现低温促进 β-胡萝卜素的合成，同时相关基因的表
达量也有少量提高 ；Csernetics 等［11］通过在 Mucor
circinelloides 中异源表达法夫酵母的 crtS 和 crtR 基因，
总类胡萝卜素的含量得到提高，同时虾青素占总类
胡萝卜素比例比单独表达 crtS 基因的高，说明 crtR
基因对 crtS 基因有协同促进作用。
本实验室前期筛选得到两株法夫酵母突变菌株，
分别为 JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株，前者产虾青
素，但是总类胡萝卜素细胞产率低。后者与前者相
比积累较多的类胡萝卜素，但是不产虾青素。本研
究从这两株特征突变菌株出发，通过对这两株菌的
产类胡萝卜素特性以及类胡萝卜素合成相关基因的
表达差异进行检测，在代谢过程和基因表达两个层
面探索他们产类胡萝卜素特性差异的原因，为进一
步阐明虾青素合成调控机理提供参考，同时也为后
期对这两株菌进行定向改造提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株由本实验
室保藏。
1.1.2 培养基 YPD 培养基［12］：称取 10 g 酵母膏、
20 g 蛋白胨溶解于 900 mL 水中，121℃高压灭菌 20
min，然后加入 100 mL 200 g/L 葡萄糖溶液（115℃
高压灭菌 15 min）。
1.2 方法
1.2.1 种子液的培养 取 -70℃保存的菌种，接种于
装有 30 mL YPD 培养基的 250 mL 摇瓶中，接种量为
1 mL，22℃、190 r/min 条件下于摇床中培养 3 d 得 1
代摇瓶种子。取 1 mL 1 代摇瓶种子液转接到新鲜的
YPD 培养基中，于相同的条件下培养 48 h 得到 2 代
摇瓶种子。
1.2.2 摇瓶发酵培养 将 5 mL 摇瓶种子液接入装有
150 mL YPD 培养基的 500 mL 摇瓶中，在 22℃、190
r/min 的条件下培养 4 d，需要添加 β-胡萝卜素的样
品在设定的时间内添加 4 mg/L β-胡萝卜素。每 12 h
取样一次。
2016,32(2) 125郑晨华等：法夫酵母中产类胡萝卜素特性与其合成相关基因表达关系的研究
1.2.3 生物量的测定 先将离心管置于 105℃烘至
恒重，称重 m1 ；取 5 mL 培养液加入离心管，离心
弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤两遍，最后置于 105℃
烘至恒重，称重 m2 ；菌体干重 m 为 m2、m1 之差。
1.2.4 发酵液中残糖的测定 采用 DNS 法［13］（3，5-
二硝基水杨酸法）测定发酵液中的还原糖。
1.2.5 总类胡萝卜素含量的测定 采用二甲基亚砜
（DMSO）法［2］破壁 ：取 2.5 mL 发酵液，离心后沉
淀用蒸馏水洗涤 2 次，加入预热至 75℃的二甲基亚
砜 2 mL，充分振荡摇匀后，加入 5 mL 乙醇振荡均
匀，3 500 r/min 离心 5 min 取上清液，用乙醇定容至
10 mL。紫外分光光度计在 474 nm 波长下进行检测
总类胡萝卜素［14］。
1.2.6 类胡萝卜素成分的测定 使用 Aglient 1200 高
效液相色谱仪（G1315 DAD 检测器），Nova-Pak C18
柱（3.9×150 mm，4 μm）检测类胡萝卜素中的不同
成分，流速为 1.0 mL/min，柱温 30℃，柱压 0-3 000
psi，进样量 20 μL，检测波长 474 nm。梯度条件如
表 1 所示，用虾青素、β-胡萝卜素和 β-隐黄质（Si-
mga）标准品制作标准曲线。
表 1 液相分析梯度条件
时间 /min
流动相 /%
超纯水（A） 甲醇（B） 乙腈（C） 四氢呋喃（D）
0-40 40-0 36.6-61 4.2-7 19.2-32
40-45 0-40 61-36.6 7-4.2 32-19.2
45-48 40 36.6 4.2 19.2
1.2.7 RNA 的提取与逆转录 分别取 24、36、48、
60、72、84 和 96 h 的发酵液，3 500 r/min，离心 8
min 收集法夫酵母菌体，然后用 PBS 缓冲液洗涤菌
体两次，对离心收集到的菌体进行液氮研磨。取
0.1 g 粉 末， 根 据 TRI REAGENT 总 RNA 提 取 试 剂
盒使用说明提取法夫酵母总 RNA。采用 RS232C 蛋
白分析仪测定 RNA 的浓度及 OD260/OD280 值，并用
2% 的普通琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，样品
保 存 于 -70℃。 利 用 TransScriptTM First-Strand cDNA
Synthesis SuperMix（全式金）试剂盒对提取的 RNA
进行逆转录合成 cDNA 第一条链，作为后续实时定
量 PCR 的模板。
1.2.8 引物的设计 选取法夫酵母中类胡萝卜素合
成相关基因 crtE，crtYB，crtI，crtS 和 crtR 基因进行
实时定量检测，β-actin 作为内参基因。根据 NCBI
数 据 库 中 法 夫 酵 母 β-actin，crtE，crtI，crtYB，crtS
和 crtR 基因 mRNA 的序列，按照实时定量 PCR 引
物设计原则［15］，用 Primer Premier 5.0 软件设计引物
并合成，引物序列见表 2。
表 2 RT-qPCR 引物序列
基因 引物名称 序列（5-3） GenBank 登录号
β-actin q-β-actin F TCCACGACAACTACACCATTG Y08366.1
q-β-actin R AACCTTACCGACGGCCTTG
crtE q-crtE F TTCAGTCTTCTGAGTATGCCC DQ016502.1
q-crtE R GAATGAGTGGGTTTCTGTGC
crtI q-crtI F GCTATCATCGTGGGATGTGG AY177424.1
q-crtI R GACCCAATCTTCCATCTTCTC
crtYB q-crtYB F CTGTCTGCCTGCGATCATAC AY177204.1
q-crtYB R TAACTTCGCTAGGAAATCCAG
crtS q-crtS F AAGATGCAGAAGAATTCAGACC DQ002007.1
q-crtS R TGATGGGCTCGAACTGGA
crtR q-crtR F GAAACAAGACCTACGAGCAGT EU884134.1
q-crtR R CTCGGTTACGACAAAGTCAGG
1.2.9 实 时 定 量 PCR 扩 增 及 数 据 分 析 选 用
TransStart Top Green qPCR Mix（ 全 式 金 ） 试 剂 盒，
按说明书建立 20 μL 反应体系 ：SYBR Green Ⅰ Mix
（2×）10 μL，上下游引物各 0.3 μL，Dye I 0.4 μL，
cDNA 模板 2 μL，ddH2O 7.4 μL；反应程序：94℃ 30 s，
94℃ 5 s，60℃ 31 s，40 个循环。反应在 ABI 7300
实时定量 PCR 仪上进行，每个处理设置 3 次重复，
记录仪器输出的 RQ 值，以 β-actin 基因为内参基因，
所有结果以 2-∆∆CT 法计算相对定量值。
2 结果
2.1 JMU-VDL668和JMU-N3菌株不同培养时间细
胞生长特性比较
分析 JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株生物量随时
间变化趋势（图 1-A），可知 JMU-N3 菌株生长旺盛，
生长速率比 JMU-VDL668 菌株快，培养 48 h 生物量
达到最大，为 15.29 g/L，JMU-VDL668 生物量最大
可达 12.22 g/L。48 h 左右时 JMU-VDL668 和 JMU-N3
两株菌进入稳定期，生物量略有下降，可能是由于
细胞在生长后期破裂自溶引起的。
从图 1-B 中可以看出，JMU-N3 菌株的耗糖速
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2126
率大于 JMU-VDL668 菌株。在培养 36 h 时，两株菌
培养基中的糖已基本耗尽，但对比这两株菌的生长
曲线，自 36-48 h 还有较大幅度的细胞增长，可能
是因为在培养前期，培养基中葡萄糖浓度较高，产
生了克雷布特里效应，对酵母的呼吸产生抑制作用，
使酵母在发酵过程中生成乙醇、甘油等糖代谢副产
物，葡萄糖耗尽后，解除了克雷布特里效应，菌株
开始利用乙醇或甘油等糖代谢产物，所以可以继续
生长。随着培养基中的葡萄糖消耗完全，两株菌逐
渐进入稳定期。
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JMU-VDL668 JMU-N3
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JMU-VDL668 JMU-N3
B
图 1 JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株的细胞生长特性
2.2 JMU-VDL668和JMU-N3菌株的产类胡萝卜素
特性比较
JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株的产类胡萝卜素
特效变化如图 2 所示，JMU-VDL668 菌株中的总类
胡萝卜素细胞产率低于 JMU-N3 菌株，其中以虾青
素为主。在整个发酵过程中，JMU-VDL668 菌株中
虾青素的细胞产率始终占总类胡萝卜素的 80% 以上，
最 高 可 达 98.2%。 在 24-72 h 期 间 JMU-VDL668 菌
株的总类胡萝卜素和虾青素均快速积累，随后一段
时间内总类胡萝卜素和虾青素的细胞产率变化不大，
其中虾青素细胞产率最高仅为 0.25 mg/g。JMU-N3
菌株中检测到 β-胡萝卜素和 β-隐黄质，但没检测到
虾青素，积累的类胡萝卜素产物以虾青素前体物质 β-
隐黄质为主，最高可达 0.31 mg/g，而 β-胡萝卜素的
细胞产率远低于其下游产物 β-隐黄质。总类胡萝卜
素细胞产率在 0-108 h 间不断积累，至 108 h 时最高
达 0.52 mg/g。β-隐黄质的积累和总类胡萝卜素积累
的趋势类似，β-胡萝卜素在 24 h 处已达到最大积累
量，仅为 0.033 mg/g，随后一直保持稳定。
2.3 JMU-VDL668和JMU-N3菌株中类胡萝卜素相
关基因表达差异
图 3 显示，crtE、crtYB、crtI 和 crtS 基因均有在
JMU-N3 和 JMU-VDL668 菌株中表达。JMU-N3 菌株
不产虾青素，却有检测到 crtS 基因的表达，而 crtR
0.4
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总类胡萝卜素 虾青素
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总类胡萝卜素 β-胡萝卜素 β-隐黄质
B
图 2 JMU-VDL668（A）和 JMU-N3（B）菌株的产类胡萝卜素特性
2016,32(2) 127郑晨华等：法夫酵母中产类胡萝卜素特性与其合成相关基因表达关系的研究
基 因 则 只 在 JMU-VDL668 菌 株 中 检 测 到。JMU-N3
菌株中 crtE 基因的表达量在 24-96 h 均高于 JMU-
VDL668 菌株，其中在 72 h 表达差异达到最大，到
84 h 表达差异显著下降，到 96 h 又有所提高 ；crtYB
基因的表达在整个发酵过程都高于 JMU-VDL668 菌
株，其中分别在 48 h 和 96 h 有较大的表达差异 ；
crtI 基 因 的 表 达 量 在 24-96 h 均 高 于 JMU-VDL668
菌株，其中在 24 h 表达差异最大 ；crtS 基因的表达
量也在整个发酵过程均高于 JMU-VDL668 菌株，其
中在 96 h 时表达差异较大。总体来说，JMU-N3 菌
株中 crtE、crtYB、crtI 和 crtS 基因的表达水平均比
JMU-VDL668 菌株的表达水平高。
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JMU-VDL668
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JMU-N3
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D
JMU-VDL668
JMU-N3
JMU-VDL668
JMU-N3
相对表达量是以 JMU-VDL668 菌株基因表达量为基数 1
图 3 JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株中虾青素合成途径相关基因的表达差异结果
2.4 添加β-胡萝卜素对JMU-VDL668菌株中产类
胡萝卜素的特性的影响
分析 JMU-VDL668 菌株中产类胡萝卜素的特性
可以看出，总类胡萝卜素含量低可能是限制 JMU-
VDL668 菌株中虾青素产量提高的因素。因此本研究
在 JMU-VDL668 菌株培养的不同时间点添加 4 mg/L
β-胡萝卜素，并检测添加 24 h 后该菌产类胡萝卜素
的变化，采用 SPSS 软件进行差异显著性分析。结果
（表 3）显示，与对照组相比，0 h 添加 β-胡萝卜素，
培养 24 h 后 JMU-VDL668 菌株的总类胡萝卜素细胞
产率提高到 307 μg/g，β-胡萝卜素细胞产率提高 8 倍，
虾青素细胞产率变化不大，表明 0 h 时 JMU-VDL668
菌株可以从外界摄入了 β-胡萝卜素，但是 β-胡萝卜
素合成量的增加并不能提高虾青素的细胞产率。在
发酵 24 h 和 36 h 添加时，添加组和对照组总类胡萝
卜素细胞产率均在 300 μg/g 左右，添加组的不同类
胡萝卜素的细胞产率与对照组相比均无显著差异，
表明在这两个时间点时 JMU-VDL668 菌株不能从外
界摄入 β-胡萝卜素。在 48 h 添加时，两个实验组的
类胡萝卜细胞产率无明显的差异，均大于 400 μg/g，
添加组的 β-胡萝卜素细胞产率为对照组的 2 倍，虾
青素细胞产率却比对照组低了 33 μg/g。在 72 h 和 96
h 添加时，添加组的总类胡萝卜素细胞产率均在 350
μg/g 左右，高出实验组近 50 μg/g，β-胡萝卜素和虾
青素的细胞产率均大于对照组，其中在 96 h 添加 β-
胡萝卜素时 JMU-VDL668 菌株中虾青素的细胞产率
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2128
表 3 β-胡萝卜素对 JMU-VDL668 菌株中类胡萝卜素细胞产率 /（μg·g-1）的影响
添加时间 /h 取样时间 /h
总类胡萝卜素 β- 胡萝卜素 虾青素
对照组 添加组 对照组 添加组 对照组 添加组
0 24 122.4±5.9a 307.2±16.9b 23.3±3.9a 196.9±11.6b 50.0±7.3a 60.6±9.7a
24 48 326.5±16.0a 319.7±30.2a 60.6±13.4a 60.5±3.1a 139.7±12.3a 138.4±17.0a
36 60 367.9±30.2a 386.3±7.5a 90.7±33.7a 98.6±6.2a 154.2±11.8a 160.7±8.6a
48 72 415±51.2a 405.4±9.3a 75.7±33.6a 142.4±30.9b 184.7±21.7a 151.3±8.6a
72 96 302±7.9a 352±20.7b 33.7±7.8a 62.7±16.0b 132.9±22.9a 172.0±27.7b
96 120 297±20.6a 388.8±9.3b 34.5±2.2a 51.5±10.8b 117.1±3.3a 213.6±10.7b
注 ：不同处理组中不同小写字母表示差异显著（P ≤ 0.05）
比对照组提高了 83%。
3 讨论
虾青素作为法夫酵母中的次级代谢产物，代
谢途径复杂，合成虾青素的过程受多种机制的调
控，其中类胡萝卜素合成关键酶基因的表达水平直
接影响法夫酵母菌株中类胡萝卜素的合成，对类
胡萝卜素的合成具有重要作用［16］。本研究通过对
JMU-VDL668 和 JMU-N3 菌株进行发酵，结果发现
JMU-N3 菌株的生长速率较快，生物量也高于 JMU-
VDL668 菌株，葡萄糖的利用速率也比 JMU-VDL668
高，不过两株菌的细胞生长的整体趋势相差较小。
两株菌产类胡萝卜素的特性发现 JMU-N3 菌株从发
酵初期就迅速合成类胡萝卜素，而 JMU-VDL668 菌
株则是 24 h 后才开始迅速合成。JMU-VDL668 菌株
中总类胡萝卜素细胞产率低于 JUM-N3 菌株，类胡
萝卜素的成分以虾青素为主。JMU-N3 菌株虽然积累
较多的总类胡萝卜素，但是其中主要为 β-隐黄质，
未检测到虾青素的合成。对 JMU-N3 和 JMU-VDL668
菌株中类胡萝卜素合成相关基因的表达差异进行分
析，发现两者存在较显著的差异，推测这两株菌产
类胡萝卜素特性差异与类胡萝卜素合成相关基因的
表达差异存在一定的相关性。
法夫酵母中与类胡萝卜素合成直接相关的关键
酶基因有 crtE、crtI 和 crtYB 基因。Breitenbach 等［17］
在法夫酵母中过量表达 crtE 基因，其 β-胡萝卜素的
产量增加了接近 2 倍，但虾青素的含量却没有相应
的提高 ；Miao 等［18］发现在不同的生长时期，高产
虾青素的法夫酵母菌株的 crtE 基因的表达水平高于
野生型菌株 2-8 倍，crtE 的表达水平与 GGPP 的产
量呈正相关，提高 crtE 的表达量在一定范围内提高
总类胡萝卜素的含量 ；Verdoes 等［19］将 crtYB 基因
连接到一个同源的 gpd 启动子上进行 crtYB 基因的
过量表达，检测到 β-胡萝卜素和海胆酮等产物的大
量积累，由此推测可能是由于大量表达 crtYB 基因，
导致更多的番茄红素环化酶被合成，促进了双环类
胡萝卜素的生产 ；Verdoes 等［19］发现过量表达 crtI
基因则使类胡萝卜素往单环途径合成 ；Visser 等［20］
发现法夫酵母由 crtI 基因表达的八氢番茄红素脱氢
酶和 crtYB 基因表达的番茄红素环化酶之间的竞争
结果决定番茄红素的代谢流是朝着 β-胡萝卜素转化
成虾青素的方向，还是通过 3，4- 二氢番茄红素生成
HDCO。crtI 基因的过量表达反而不利于双环番茄红
素的大量积累，可能还需与 crtYB 基因协同调控才
能起到促进虾青素合成的作用。从这些学者的研究
中可以发现，在 crtI 与 crtYB 基因协同作用的情况
下，总类胡萝卜素的含量与这 3 个基因的表达量呈
正相关关系。本研究中 JMU-N3 菌株的 crtE、crtI 和
crtYB 基因的表达量整体均比 JMU-VDL668 菌株高，
因此推测这些基因的高表达有可能是 JMU-N3 菌株
中总类胡萝卜素细胞产率较 JMU-VDL668 菌株高的
主要原因。
crtS 基因作为目前为止发现的唯一一个催化 β-
胡萝卜素转化成虾青素过程中的基因，对于其表达
的虾青素合成酶的作用是同时具有酮化和羟化的功
能还是只有羟化的功能还没有定论［21，22］，但是通
过基因敲除以及比较高产菌株与低产菌株发现，crtS
基因的表达与虾青素产量存在正相关关系［18，23］；
Ukibe 等［24］在酿酒酵母中异源表达来自法夫酵母中
的 crtI、crtYB 和 crtS 基因时发现没有虾青素生成，
但是在共表达来自法夫酵母的 crtR 基因后则有虾青
2016,32(2) 129郑晨华等：法夫酵母中产类胡萝卜素特性与其合成相关基因表达关系的研究
素合成，说明法夫酵母中 crtS 基因表达的虾青素合
成酶对于 crtR 基因表达的细胞色素 P450 还原酶有选
择特异性。crtS 基因表达的虾青素合成酶需要由 crtR
基因表达的细胞色素 P450 还原酶作为辅酶来完成
从 β-类胡萝卜素到虾青素的转化［4］，这些研究说明
crtR 基因对于虾青素的合成是必不可少的。在本研
究中 JMU-VDL668 菌株中的 crtS 基因整体表达量比
JMU-N3 菌株低，而 JMU-N3 菌株虽然有较高的 crtS
基因表达量，但是未检测到 crtR 基因的表达，这个
结果有可能是导致 JMU-N3 菌株不产虾青素的主要
原因。
本研究还在不同时间点往 JMU-VDL668 菌株的
培养基中添加 β-胡萝卜素，结果发现在 72 h 和 96 h
添加时，JMU-VDL668 菌株的虾青素细胞产率得到
一定的提高，其中在 96 h 添加 β-胡萝卜素时，JMU-
VDL668 菌株中虾青素的细胞产率与对照相比提高
了 83%，当吸收外界添加的 β-胡萝卜素后其虾青素
细胞产率就显著提高，一定程度在代谢水平上解释
类胡萝卜素合成相关基因的低表达有可能导致总类
胡萝卜素合成不足限制虾青素的合成。Krivoruchko、
Verwaal 等［25，26］研究发现类胡萝卜素因其高疏水性，
只能储存在膜系统中，如果大量积累的话会对细胞
产生代谢压力，不利于细胞生长。在本研究中也发
现不同时间点添加 β-胡萝卜素时，添加组的总类胡
萝卜素细胞产率总是在 300-400 μg/g 之间。因此推
测在 JMU-VDL668 菌种中总类胡萝卜素的细胞产率
可能存反馈调节机制，当 JMU-VDL668 自身合成的
总类胡萝卜素细胞产率低于这个范围时，可以从环
境中吸收 β-胡萝卜素，当高于这个范围时则会受到
反馈调节，抑制类胡萝卜素的合成。
通过对 JMU-VDL668 和 JMU-N3 株菌在代谢水
平和基因表达水平的研究发现，这两株菌的产类胡
萝卜素特性与类胡萝卜素合成相关基因的表达量可
能存在一定的正相关关系，且 JMU-VDL668 菌株中
总类胡萝卜素细胞产率在一定范围内，可能存在反
馈调节机制。虽然通过提高类胡萝卜素合成相关基
因的表达量可以提高总类胡萝卜素的产量，但是在
微生物中，代谢产物的合成还受到转录后修饰，翻
译水平，酶的活性、基因和酶之间的相互关系等多
方面的调控。结合本研究的一些发现以及 Xie 等［7］
的研究结果表明，有效的提高法夫酵母中虾青素含
量不但要提高相关基因的表达水平，同时还需对法
夫酵母中的虾青素合成相关代谢流以及不同类胡萝
卜素合成相关基因之间的表达进行有序协调的控制。
利用基因工程和代谢工程技术对法夫酵母菌株进行
高效有目的性的改良还需对类胡萝卜素合成途径相
关的调控机理进行更系统和深入的研究。
4 结论
本研究通过比较 JMU-VDL668 和 JMU-N3 株菌
中产类胡萝卜素特性，与类胡萝卜素合成相关基因
表达差异之间的关系来研究法夫酵母中的类胡萝卜
素合成的代谢调控机理。结果发现法夫酵母中类胡
萝卜素的合成和类胡萝卜素合成相关基因的表达量
存在一定的正相关关系，且 crtR 基因在虾青素合成
中具有重要作用。JMU-VDL668 菌株中合成类胡萝
卜素相关基因的表达水平比 JMU-N3 菌株低，使得
其总类胡萝卜素细胞产率低，不能为虾青素的合成
提供足够的前体，限制虾青素的合成。而 JMU-N3
菌株中类胡萝卜素合成相关基因的表达水平比 JMU-
VDL668 菌株高，使得其总类胡萝卜素细胞产率比
JMU-N3 菌株高，但是由于 crtR 基因得不到表达或
者表达量低，使得其不能产虾青素。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）