全 文 ：261
杨 瑞，翟海瑞，杨劲松*
(海南大学食品学院，海南海口 570228)
摘 要:以菠萝皮渣为培养基的主要原料，采用法夫酵母(Phaffia rhodozyma)对其进行发酵生产虾青素，采用响应面分
析法对法夫酵母的发酵条件进行优化研究。先用 Plackett－Burman设计法实验确定重要因素，再用最陡爬坡实验法确
定因素水平，最后用响应面分析方法求得的最佳发酵条件为:发酵温度为 20.0℃，初始 pH 为 5.29，糖度为 6.1%，酵母
膏 2g /L，MgSO42g /L，(NH4)2 SO44g /L，KH2PO41.5g /L，种龄 36h。用此优化的发酵培养基培养法夫酵母，虾青素产量可
达 6.5751mg /L。
关键词:虾青素，法夫酵母，菠萝皮，响应面分析法
Fermentation conditions optimization of the astaxanthin
production for pineapple peel by Phaffia rhodozyma
YANG Rui，ZHAI Hai－rui，YANG Jin－song*
(College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract:Pineapple peel as main raw material was fermented with Phaffia rhodozyma to produce astaxanthin.
Response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions for astaxanthin production.First，
used Plackett－Burman design to select the most important fermentation conditions which affecting the growth of
Phaffia rhodozyma.Then，the steepest ascent was used to approach region of the fermentation conditions. The
optimal fermentation conditions were determined by a central composite design and response surface analysis.
And the optimal conditions follows:temperature 20.0℃，initial pH 5.29，sugar content 6.1%，yeast extract 2g /L，
MgSO42g /L，(NH4)2SO4 4g /L，KH2PO41.5g /L，seed age 36h.Using the optimal fermentation conditions to culture
Phaffia rhodozyma，the yield of astaxanthin could be up to 6.5751mg /L.
Key words:astaxanthin;Phaffia rhodozyma;pineapple peel;response surface analysis
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2011)09－0261－04
收稿日期:2010－08－30 * 通讯联系人
作者简介:杨瑞(1984－)，女，在读硕士，研究方向:食品科学与工程、
应用微生物。
基金项目:国家科技计划支撑项目(2007BAD76B04)。
虾青素(Astaxanthin)是一种天然类胡萝卜素，主
要存在于水生动物、藻类、酵母、细菌等生物类群中。
在动物体内，虾青素具有特殊的着色功能，可以使虾
壳和家禽的表皮及卵黄着色，使其色泽鲜艳［1－2］，最
初作为色素而被用作水产业的饵料添加剂。近几年
的研究表明，虾青素具有较强的抗氧化、清除自由
基、增强宿主免疫力等功能，因此在饲料、食品、化妆
品及医药等领域有广阔的应用前景［3－4］。法夫酵母
是一种产虾青素的酵母，它具有生长速度快、发酵周
期短、能利用大多数糖、可在发酵罐中实现高密度培
养等特点，是一种极具产业化前景的天然类胡萝卜
素资源 。但由于原始分离的法夫酵母虾青素产量水
平不高，要实现工业化生产必须设法提高产量。杨劲
松等对法夫酵母菌株进行复合诱变，将虾青素产量提
高到 7.26mg /L［5］。朱晓立等通过对法夫酵母培养基的
优化使虾青素产量达到 15.28mg /L［6］。另外，选用有
效、价廉易得的发酵底物也是降低成本的一个重要
方面，如以桉树木水解液［7］、谷物水解物［8］、甘蔗汁［9］
为发酵底物已有报道。菠萝果实加工产生的副产
物—果皮渣，菠萝皮渣中含有糖分、维生素、微量元
素等营养物质，能够为法夫酵母生长提供一定的营
养成分。本研究以菠萝皮渣的汁为主要原料，研究
其最优培养基组分及发酵条件，在提高产品附加值
的同时还可以保护环境。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 本研究室保藏
并通过诱变选育获得;菠萝皮 从市场取得;菌种保
藏培养基(g /L) 葡萄糖 10、麦芽汁 3、蛋白胨 5、酵
母膏 3、琼脂 20，pH5.0;液体种子培养基(g /L) 葡
萄糖 10、芽汁 3、蛋白胨 5、酵母膏 3，pH5.0;发酵培养
基(g /L) 将菠萝渣冲洗干净后用榨汁机压榨，过
滤，用葡萄糖调至所需糖度，以上培养基均于 121℃
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.09.069
262
表 2 Plackett－Burman实验设计表及实验结果
实验号
糖度
(%)
酵母膏
(g /L)
(NH4)2 SO4
(g /L)
KH2PO4
(g /L)
MgSO4
(g /L)
温度
(℃) 初始 pH
种龄
(h)
虾青素产量
(mg /L)
1 6.0 1.5 4.0 1.5 1.5 20.0 6.0 36 5.4000
2 6.0 2.0 3.0 2.0 1.5 20.0 5.0 36 5.2375
3 5.0 2.0 4.0 1.5 2.0 20.0 5.0 24 4.9813
4 6.0 1.5 4.0 2.0 1.5 25.0 5.0 24 4.1906
5 6.0 2.0 3.0 2.0 2.0 20.0 6.0 24 4.9625
6 6.0 2.0 4.0 1.5 2.0 25.0 5.0 36 4.8188
7 5.0 2.0 4.0 2.0 1.5 25.0 6.0 24 3.0000
8 5.0 1.5 4.0 2.0 2.0 20.0 6.0 36 4.7563
9 5.0 1.5 3.0 2.0 2.0 25.0 5.0 36 3.8437
10 6.0 1.5 3.0 1.5 2.0 25.0 6.0 24 3.4000
11 5.0 2.0 3.0 1.5 1.5 25.0 6.0 36 3.4438
12 5.0 1.5 3.0 1.5 1.5 20.0 5.0 24 4.8125
灭菌 20min;麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉 广东
环凯微生物科技有限公司，生化试剂;葡萄糖、二甲
基亚砜、丙酮 广州化学试剂厂，分析纯。
SHZ－95DF全温振荡器 金坛市大地自动化仪
器厂;UV－1100 紫外可见分光光度计 上海密通机
电科技有限公司;80－2 型离心沉淀器 上海手术器
械厂;HSR025 型人工气候箱 南京实验仪器厂;
LS－B50L型立式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪
器厂;WYT手持糖量计 成都市青羊联合光学仪器
成套部。
1.2 实验方法
1.2.1 种子液培养方法 取活化好的菌种接种于装
有 50mL 种子培养基的 500mL 三角瓶中，转速
170r /min，温度 21.5℃，培养时间 48h。
1.2.2 发酵方法 在 500mL 的三角瓶中装入 50mL
培养液，接种量 10%，转速 170r /min，温度 21.5℃，培
养时间 96h。
1.2.3 虾青素提取及测定［10］ 改进二甲基亚砜法。
发酵液经离心洗涤，加入 55℃预热的二甲基亚砜溶
液 5mL，55.0℃水浴 15min，再加入 4mL 丙酮溶液进
行提取，离心，收集上清液，以二甲基亚砜与丙酮混
合液(体积比 5∶4)为空白，于 480nm波长下测定上清
液吸光度。按下式分别计算单位体积发酵液的虾青
素产量:
虾青素产量(mg /L)= Va × A480 × 10000 /(E ×
Vb)
式中:Va 为萃取液体积(mL);A480为 480nm波长
下的吸光度;E 为比消光系数，取值 2150;Vb 为发酵
液取样体积(mL)。
1.2.4 培养基的优化
1.2.4.1 Plackett－Burman 实验设计法筛选重要因素
Plackett－ Burman 是一种两水平的实验设计方法，
它可以用最少的实验次数达到使因素的主效应得到
尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速的筛选
出最为重要的几个因素，供进一步研究用。每个因
素的两水平分别取低水平与高水平，高水平约低水
平的 1.25 倍。
本实验以虾青素的产量作为响应值，选择培养
基成分和培养条件中的 8 个因素作为考察对象，即
糖度、酵母膏、MgSO4、种龄、(NH4)2 SO4、初始 pH、
KH2PO4、发酵温度。采用实验次数 N = 12 的 Plackett
－Burman实验设计方案。
1.2.4.2 应用最陡爬坡实验法确定因素水平 由
Plackett－Burman 实验可知，发酵温度、初始 pH、糖度
这 3 个因素对法夫酵母的生长有重要的影响，糖度
为正效应，应增加;发酵温度和初始 pH为负效应，应
减小。根据这 3 个因素效应大小的比例设定它们的
变化方向及步长进行实验。
1.2.4.3 响应面分析法优化培养基 根据 Plackett－
Burman实验和最陡爬坡实验结果，确定对虾青素产
量影响显著的 3 个因素:发酵温度、初始 pH、糖度。
并确定接近最大响应值区域的发酵温度、初始 pH 和
糖度的取值。采用中心组合设计对这些因素进行进
一步的优化。因素水平选取见表 1。
表 1 中心组合实验设计实验因素水平及编码表
编码 因素
水平
－ 1.68179 － 1 0 1 － 1.68179
X1 发酵温度(℃) 19.3 20.0 21.0 22.0 22.7
X2 初始 pH 4.90 5.00 5.20 5.40 5.50
X3 糖度(%) 5.1 5.5 6.0 6.5 6.8
2 结果与分析
2.1 Plackett－Burman实验设计法筛选重要因素
实验结果采用 Minitab15 软件进行各因素主效
应分析，结果见表 2 和表 3。
表 3 Plackett－Burman实验回归分析表
因素 T P 重要性
糖度 3.42 0.042 2
酵母膏 0.04 0.968 8
(NH4)2 SO4 1.56 0.217 5
KH2PO4 － 0.93 0.419 6
MgSO4 0.73 0.517 7
温度 － 8.04 0.004 1
初始 pH － 3.15 0.051 3
种龄 2.32 0.103 4
由表 3 可知，发酵温度、糖度和初始 pH 是主要
的影响因素，其可信度分别为 99.6%、95.8%、94.6%。
其中糖度为正效应，应增加;发酵温度和初始 pH 为
负效应，应减小。其它 5 个因素，酵母膏、MgSO4、种
龄、(NH4)2 SO4、KH2PO4 的重要性相对较小一些，由
263
此确定发酵温度、初始 pH和糖度为重要因素进行下
一步实验。在后续的实验中将对这三个因素做进一
步的优化。其余各因素的效应如下:酵母膏、MgSO4、
种龄和(NH4)2 SO4 正效应，取高水平;KH2PO4 为负
效应，取低水平。因此在后续实验中，除上述三个显
著因素外，其它各因素的水平调整如下:酵母膏
2g /L，MgSO4 2g /L，(NH4)2 SO4 4g /L，KH2PO4 1.5g /L，
种龄 36h，且在后续实验中将不再改变。
2.2 最陡爬坡实验
Plackett－Burman 实验回归分析确定发酵温度、
初始 pH和糖度为重要因素，由此设计最速上升实
验:减少发酵温度、初始 pH，分别每次减少 2.0℃、
0.4，糖度每次增加 0.5%，其它因素水平为 PB实验调
整后的值。考察发酵液虾青素含量的变化趋势，逼
进最大响应区域。实验设计及结果见表 4。
表 4 最速上升实验设计及结果
实验号
糖度
(%) 初始 pH
发酵温度
(℃)
虾青素产量
(mg /L)
1 5.0 6.0 25.0 5.2252
2 5.5 5.6 23.0 5.7033
3 6.0 5.2 21.0 6.2340
4 6.5 4.8 19.0 6.1000
5 7.0 4.4 17.0 5.5092
由表 4 可知，随发酵温度、初始 pH 的下降和糖
度的上升，虾青素产量变化趋势为先上升后下降，3
号发酵瓶中的色素产量达到最大值。该处理的发酵
温度、初始 pH和糖度用于下面的优化实验。
2.3 响应面法优化发酵条件
由 Plackett－Burman实验选出发酵温度、初始 pH
和糖度为重要因素，进而由最陡爬坡实验确定接近
最大响应值区域的发酵温度、初始 pH 和糖度的取
值。最后采用响应面分析法对发酵温度、初始 pH 和
糖度进行优化。实验设计采用中心组合设计
(CCD)，实验设计及结果见表 5。
表 5 中心组合实验设计及其实验结果
实验号 X1 X2 X3
虾青素产量
(mg /L)
1 － 1 － 1 － 1 6.0604
2 1 － 1 － 1 5.5207
3 － 1 1 － 1 6.3458
4 1 1 － 1 6.0708
5 － 1 － 1 1 6.3563
6 1 － 1 1 5.4917
7 － 1 1 1 6.5608
8 1 1 1 6.1000
9 － 1.68179 0 0 6.5395
10 1.68179 0 0 5.9354
11 0 － 1.68179 0 6.0104
12 0 1.68179 0 6.2250
13 0 0 － 1.68179 5.3458
14 0 0 1.68179 5.7833
15 0 0 0 6.3796
16 0 0 0 6.3896
17 0 0 0 6.4058
18 0 0 0 6.3786
19 0 0 0 6.2958
20 0 0 0 6.3896
表 6 回归方程中回归系数的估计值
参数 系数 系数标准误 T P
常量 6.3695 0.0514 123.85 0.000
X1 － 0.2311 0.0341 － 6.77 0.000
X2 0.1471 0.0341 4.31 0.002
X3 0.0913 0.0341 2.68 0.023
X21 － 0.0239 0.0332 － 0.718 0.489
X22 － 0.0662 0.0332 － 1.99 0.074
X23 － 0.2618 0.0332 － 7.88 0.000
X1X2 0.0836 0.0446 1.87 0.009
X1X3 － 0.0638 0.0446 － 1.43 0.183
X2X3 － 0.0028 0.0446 － 0.06 0.951
表 7 回归方程的方差分析
来源 DF SS MS F P
回归 9 2.2388 0.2488 15.65 0.000
线性 3 1.1388 0.3796 23.87 0.000
平方 3 1.0115 0.3372 21.20 0.000
交互作用 3 0.0885 0.0295 1.86 0.200
残差误差 10 0.1590 0.0159
失似 5 0.1513 0.0303 19.75 0.003
纯误差 5 0.0077 0.0015
合计 19 2.3978
实验数据拟合所得二次多项式方程为:Y =
－58.0053－0.6358X1－9.3419X2 + 15.5758X3 + 0.0239X
2
1
+ 1.6548X22 － 1.0470X
2
3 + 0.4178X1X2 － 0.1277X1X3
－0.0284X2X3
回归方程的 R2 = 0.9337，表明模型能解释
93.37%虾青素素产量的变化，该模型的拟合效果较
好，基本上可以用该回归方程代替实验真实点对实
验结果进行分析。利用软件可得到其响应面分析
图，见图 1～图 3。
图 1 温度与 pH交互作用对虾青素产量的影响
图 2 温度与糖度交互作用对虾青素产量的影响
由回归方程即可计算得到三个因素的最佳组
合，最终确定培养基优化后的最优组合为:发酵温度
为 20.0℃，初始 pH为 5.29，糖度为 6.1%，虾青素预测
产量 Y =6.5925mg /L。
2.4 验证实验
为了确定建立的模型与实验结果是否相符，通
过作进一步实验对模型的可靠性进行验证，以发酵
(下转第 266 页)
266
一定的影响，同时温度过高时溶剂挥发严重，结果都
会导致总黄酮提取率的降低。因此选择 70℃为最适
宜提取温度。
2.2 正交实验
在单因素实验的基础上，根据 2.3 中的设计方
案，采用 L9(3
4)表进行正交实验，对马尾松松花粉中
总黄酮的提取条件进行优化，结果见表 8。
表 8 正交实验结果与分析
实验号 A B C D 总黄酮提取率
(mg /g)
1 1 1 1 1 9.48
2 1 2 2 2 11.83
3 1 3 3 3 11.97
4 2 1 2 1 11.83
5 2 2 3 2 13.12
6 2 3 1 3 12.69
7 3 1 3 1 10.59
8 3 2 1 2 10.31
9 3 3 2 3 13.02
K1 33.28 31.90 32.48
K2 37.64 35.26 34.25
K3 33.92 37.68 35.68
k1 11.09 10.63 10.83
k2 12.55 11.76 11.42
k3 11.31 12.56 11.89
R 1.46 1.93 1.06
由表 8 可知，在考察的三个因素中，影响松花粉
中黄酮类化合物提取率的主次顺序依次为:B ＞ A ＞
C，即乙醇浓度 ＞提取温度 ＞料液比，其最佳的提取
条件为 A2B3C3，即提取温度 70℃、乙醇浓度为 95%、
料液比 1∶25。根据该条件进行实验，所得马尾松花
粉总黄酮类物质的提取率为 13.52mg /g。
3 结论
3.1 松花粉中含有脂肪酸，比较脱脂与不脱脂的松
花粉总黄酮类物质的提取率，结果表明提取效果上
没有明显的差别，因而松花粉是否经过脱脂处理对
黄酮的提取率影响不大，从经济角度考虑，可采用不
经脱脂处理的松花粉作为原料。
3.2 实验采用乙醇作为提取剂，松花粉总黄酮类物
质的最佳提取工艺为:乙醇浓度 95%、料液比1∶25、
提取温度 70℃，在此实验条件下总黄酮的提取率为
13.52mg /g。
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48－49.
(上接第 263 页)
图 3 pH与糖度交互作用对虾青素产量的影响
温度为 20.0℃、初始 pH 为 5.29、糖度为 6.1%、酵母
膏 2g /L、MgSO4 2g /L、(NH4 )2 SO44g /L、KH2PO4
1.5g /L、种龄 36h 进行重复摇瓶实验，虾青素产量从
4.8125mg /L提高到 6.5751mg /L。预测值与实验值之
间的良好拟合性证实了模型的有效性。
3 结论
研究结果表明，在法夫酵母发酵生产虾青素的过
程中，发酵温度、初始 pH、糖度对虾青素的提高起着重
要作用，其参数分别为发酵温度为 20.0℃，初始 pH为
5.29，糖度为 6.1%。其他工艺参数分别为:酵母膏
2g /L，MgSO42g /L，(NH4)2SO4 4g /L，KH2PO41.5g /L，种
龄 36h;在上述条件下发酵生产虾青素最高值可达
6.5751mg /L，比未优化前的产值 4.8125mg /L 提高了
13.7%。
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