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Study on the divergence of three isozyme patterns in different tissues of Calottes emma Gray

棕背树蜥不同组织三种同工酶之间的差异研究


文章采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,研究了分布在广东韶关地区的棕背树蜥(Calotes emma Gray)的肝脏、肌肉、心脏、脑、生殖腺五种组织酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)和过氧化氢酶(CAT)三种同工酶,研究结果,酯酶(EST)同工酶有两条共有的酶带,Rf8除了肝脏不具备外,心脏、肌肉、脑和性腺共有,体现肝脏的特异性,性腺酶带有明显的性别差异;淀粉酶(AMY)同工酶有一条共同酶带,肝脏酶带最为复杂,其次是生殖腺和雌体心脏,五种组织中有三种组织出现雌雄差异;过氧化氢酶(CAT)有两条共有的酶带,肝脏和生殖腺的酶带复杂,而且出现明显的性别差异性,心脏、肌肉和脑酶带相似,呈现不同组织的同源性.上述果表明三种同工酶在不同的组织表现出明显的同源性和差异性,雌雄个体间同一种酶表现出性别差异.

Three kinds of isozyme,EST.AMY and POD from five tissues,liver,muscle,heart,brain and sex gland,of Calotes emma Gray collected from Shaoguan district,Guangdong province were analysed by the method of PAGE.The results show the three isozymes take on the obvious diversity and homology.The same kind of enzyme shows sexual difference between male and female.EST isozymes possess two bands in common.RF8 existed in heart,muscle,brain and sex gland but in liver that indicated the speciality of liver.The band of enzyme from sex gland showed the obvious sexual difference.AMY isozymes possess a band in common.The band of enzyme from liver is the greatest complex.Three of the five tissues presented the difference between male and female.CAT sozymes possess two bands in common.The bands of enzyme from liver and gonad are the greatest complex and they show obvious sexual difference.The bands of enzyme from heart,muscle and brain are quite similar that show the homology of different tissues.


全 文 :
棕背树蜥不同组织三种同工酶之间的差异研究

黄红英 1,易道生 2,高建林 3(1. 韶关学院英东生物工程学院;2. 农产品检验所;3. 实验中心,韶关 512005)

【摘要】 文章采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,研究了分布在广东韶关地区的棕背树蜥(Calotes emma Gray)
的肝脏、肌肉、心脏、脑、生殖腺五种组织酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)和过氧化氢酶(CAT)三种同工酶,研究结果,酯
酶(EST) 同工酶有两条共有的酶带,Rf8 除了肝脏不具备外,心脏、肌肉、脑和性腺共有,体现肝脏的特异性,性腺酶
带有明显的性别差异;淀粉酶(AMY)同工酶有一条共同酶带,肝脏酶带最为复杂,其次是生殖腺和雌体心脏,五种组
织中有三种组织出现雌雄差异;过氧化氢酶(CAT)有两条共有的酶带,肝脏和生殖腺的酶带复杂,而且出现明显的性别
差异性,心脏、肌肉和脑酶带相似,呈现不同组织的同源性.上述果表明三种同工酶在不同的组织表现出明显的同源性
和差异性,雌雄个体间同一种酶表现出性别差异。
关键词:电泳;同工酶;酯酶;淀粉酶;过氧化氢酶
中图分类号:Q959.6;Q55 文献标识码:A 文章编号:1008-8873(2006)04-339-05

Study on the divergence of three isozyme patterns in different tissues of Calottes emma Gray
HUANG Hong-ying1, YI Dao-sheng2, GAO Jian-lin3 (1. Yingdong College of Biotechnology, Shaoguan University;
2. Department of Farm Produce Examination; 3. Center of Testing; Shaoguan 512005, China)
Abstract Three kinds of isozyme, EST. AMY and POD from five tissues, liver, muscle, heart, brain and sex gland, of Calotes
emma Gray collected from Shaoguan district, Guangdong province were analysed by the method of PAGE. The results show the
three isozymes take on the obvious diversity and homology. The same kind of enzyme shows sexual difference between male
and female. EST isozymes possess two bands in common. RF8 existed in heart, muscle, brain and sex gland but in liver that
indicated the speciality of liver. The band of enzyme from sex gland showed the obvious sexual difference. AMY isozymes
possess a band in common. The band of enzyme from liver is the greatest complex. Three of the five tissues presented the
difference between male and female. CAT sozymes possess two bands in common. The bands of enzyme from liver and gonad
are the greatest complex and they show obvious sexual difference. The bands of enzyme from heart, muscle and brain are quite
similar that show the homology of different tissues.
Key words: Calotes emma Gray;Isozyme;Electrophoresis; peroxidase; α-Amylase; Esterase

同工酶属于蛋白质,所以性质不同的酶类通过电
泳染色的方法,会出现不同的酶谱.动物同工酶与动物
的生长、发育阶段和环境条件密切相关,不同的动物
组织或器官由于其形态特征和化学组成各异,合成的
蛋白质种类(包括酶蛋白)不同会出现不同的酶谱,根
据这些酶谱的差异进行统计分析,不仅可以探讨分析
不同个体、种群以及不同种的遗传差异情况,并由此
解释它们的系统学关系,而且还有助于研究动物基因
表达调控与生长发育及环境条件的关系,及许多生理
遗传问题[1]。
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( polyacrylamide gel
electrophoresis,缩写为 PAGE)是以聚丙烯酰凝胶作
支持介质的一种电泳方法.用聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离可溶性蛋白质和同工酶,方法简便,灵敏度高,重
现性强,结果便于观察、记录和保存,已广为采用。
棕背树蜥(Calotes emma Gray)属于爬行纲有鳞
目蜥蜴亚目鬣蜥科树蜥属动物,生活在海拔 450~1
600 m 的热带亚热带丛林或草丛、灌丛中,以昆虫为
食,棕背树蜥在韶关地区属于常见种.目前对蜥蜴亚目
动物同工酶的研究不多[2~5],棕背树蜥的同功酶研究
未见报道.本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析棕
背树蜥的同工酶,不仅为棕背树蜥物种资源的调查利
用以及多样性的保护提供依据,并为进一步探讨分布
在华南地区的棕背树蜥生物群体遗传、进化及系统分
类提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 实验动物
棕背树蜥采集地点:广东省韶关市郊黄冈、烈士
陵园和五里亭;采集时间:2004 年 5 月 4 日;样本:
4 条成体(1♀、3♂),其中雌性体内有 12 枚输卵管卵。
1.2 样品制备
1.2.1 取样 活体解剖取出肝脏、心脏、肌肉、脑、生
收稿日期:2006-03-12,2006-08-20 接受
作者简介:黄红英(1967—),高级实验师,女,主要从事动物生理生
态学研究,本科,在职攻读生态学硕士。
生 态 科 学 2006 年 8 月 第 25 卷 第 4 期 ECOLOGIC SCIENCE Aug., 2006, 25(4)339~342
万方数据
殖腺(♀取卵巢卵、♂取睾丸)五种组织各 2 g,在 4℃
冷浴中,加入 0.01 moL·L-1 PB(磷酸缓冲液),洗去
血污,除去脂肪组织并吸干。
1.2.2 匀浆 上述组织按体重: 体积=1: 3 比例分别加
入冷的 pH 7.4 的 0.01 mg·L-1 PB 中研磨,然后用玻
璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2.3 离心 研磨好的浆液,于 4℃ 1,2 000 r·min-1 离
心 30 min,取上清液,按不同组织分装成 50 µL·管-1,
在-20℃冰箱中保存备用。
1.3 电泳
采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酯酶、淀粉
酶和过氧化氢酶三种同工酶,浓缩胶 2.5﹪,分离胶
7.5﹪,按常规制备[7],每次进样 10 µL,以溴酚蓝作
前沿指示剂,电极缓冲液为 Tris-Gly (pH 8.3).电泳在
4℃的冰箱中进行;起始电压 100 V,60 min 后升至 220
V,恒压维持 30 min。
1.3.1 酯酶同工酶的染色 电泳完毕,剥取凝胶,立即
转移至脂酶同工酶的染色液(坚牢蓝 RR 盐 30 mg 溶
于 30 mL pH 6.4 的 0.1 mg·L-1 磷酸缓冲液中,2 mL 1%
醋酸萘脂)中,37℃保温数分钟,当呈现棕红色的酯
酶同工酶谱带时,迅速倒出染色液,后用蒸馏水漂洗
凝胶,后放置 7%乙酸中保存。
1.3.2 淀粉酶同工酶的染色 电泳完毕,把凝胶浸入 A
淀粉酶液(用可溶性淀粉 1 g 溶于 100 mL 1. 2%的
NaCl 溶液),37℃保温 30~120 min,取出凝胶用蒸馏
水洗干净残留淀粉;放置于 B 淀粉酶液(5%醋酸)
中浸泡 5 min,然后取出冲洗;放置淀粉酶液(碘溶
液: KI 30 mg·L-1,I2 13 mg·L-1)浸泡,直至在暗蓝
色背景上出现浅黄色或透明区带,倒去 C 液,蒸馏水
冲洗后,固定在 7.5%醋酸-30%乙醇-15%甘油中。
1.3.3 过氧化氢酶同工酶的染色 电泳完毕,先把凝胶
浸泡在淀粉溶液 30 min,用蒸馏水冲洗干净,放置在
A 液(pH 7.0 磷酸缓冲液 5 mL,0.1 mg·L-1 L
Na2S2O3.5H2O 3.5 mL),在温室下放置 15 min 后,倒
去 A 液,加入 B 液(0.09 mg·L-1 KI 25 m,加水 25 mL,
直到酶活性区带为蓝色背景上的白色带,蒸馏水冲洗
后,固定在甘油溶液(甘油:水=1:1,V/V)。
1.4 照相 染色后的凝胶立即拍照,并在光密度计上
510µm 处扫描,得到扫描图,计算迁移率。

2 结 果
2.1 脂酶同工酶
在 5 个组织中,从脂酶酶带(图 1)和迁移率(表
1)可看出:Rf1 和 Rf3 是共有的酶带,其中肝脏、脑、


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 3 5 7 9 (雌体 Female);2 4 6 8 10 (雄体 Male)
1,2 肝 Piver;3,4 脑 Brain;5,6 心 Heart;7,8 肌 Muscle;9 卵 Egg;10 睾丸 Spermary

图 1 脂酶同工酶的酶谱图
Fig. 1 Electrophoretograms of Esterase Isoenzymes

表 1 脂酶同工酶迁移率
Table 1 Mbility of Esterase Isoenzymes
肝 Piver 脑 Brain 心 Heart 肌肉 Muscle 卵 Egg 睾丸 Spermary酶带
Isoenzyme a b a b a b a b a b
Rf1 0.09 0.07 0.08 0.08 0.08 0.07 0.07 0.07 0.07 0.09
Rf2 0.16 0.16 - - 0.17 0.17 - - 0.12 0.19
Rf3 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.20 0.20
Rf4 - - ---- - - - - - - -
Rf5 - - ---- - - - - - - -
Rf6 - - ---- - - - - - - -
Rf7 - - - - - - - - - -
Rf8 - - 0.89 0.90 0.90 0.88 0.89 0.85 0.88 0.86
Rf9 - - - - 0.94 0.95 - - 0.97 -
Rf10 - - - - - - - - - -
注 Note: a: 雌 Female; b: 雄 Male

340 生 态 科 学 25 卷
万方数据

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 3 5 7 9 (雌体 Female);2 4 6 8 10 (雄体 Male)
1,2 肝 Piver;3,4 脑 Brain;5,6 心 Heart;7,8 肌 Muscle;9 卵 Egg;10 睾丸 Spermary

图 2 α-淀粉同工酶的酶谱图
Fig. 2 Electrophoretograms of α-Amylase Isoenzymes

表 2 α-淀粉酶的同工酶迁移率
Table 2 Mbility of α-Amylase Isoenzymes
肝 Piver 脑 Brain 心 Heart 肌肉 Muscle 卵 Egg 睾丸 Spermary 酶带
Isoenzyme a b a b a b a b a b
Rf1 0.16 ---- - ---- ---- ---- - - - -
Rf2 - 0.21 - - - - - - - -
Rf3 0.25 0.26 ---- - 0.29 - - - 0.29 0.32
Rf4 0.34 0.34 0.35 0.36 0.36 0.37 0.37 0.38 0.37 0.37
Rf5 - - - - - - - - - -
Rf6 - - - - - - - - - -
Rf7 - - - - - - - - - -
Rf8 - - - - - - - - - -
Rf9 - - - - - - - - - -
Rf10 - - - - - - - - - -


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 3 5 7 9 (雌体 Female);2 4 6 8 10 (雄体 Male)
1,2 肝 Piver;3,4 脑 Brain;5,6 心 Heart;7,8 肌 Muscle;9 卵 Egg;10 睾丸 Spermary

图 3 过氧化氢酶同工酶的酶谱图
Fig. 3 Electrophoretograms of Peroxidase Isoenzymes

肌肉、睾丸的脂酶酶带最简单,只有 3 条酶带,
但是肝脏的酶带与脑、肌肉、睾丸的酶带又有差异,
脑、肌肉和睾丸酶带相似;心脏、睾丸和卵的酶带最
复杂,有 5 条酶带;即脂酶酶带在 5 个组织中出现组
织的同源性与特异性。两性差异除性腺酶带雌雄有明
显的性别差异外,表现卵的酶带明显区分睾丸的酶带,
其余肝脏、脑、肌肉没有呈现性别差异。
2.2 α-淀粉酶
从 α-淀粉酶酶带(图 2)和迁移率(表 2)可看
出:肝脏、脑、肌肉、生殖器、心脏五个组织中,Rf4
是共有的酶带, Rf1 雌体肝特有,Rf2雄性肝特有,Rf3
肝脏、雌体心脏和卵、睾丸共有.肝脏酶带复杂,酶带
3 条;其次是生殖腺和雌体心脏,酶带 2 条;雌性心
脏明显区别与雄性心脏的酶带,呈现不同组织同工酶
的同源性和性别的特异性。
2.3 过氧化氢酶
从过氧化氢酶酶带(图 3)和迁移率(表 3)可看
出:在肝脏、脑、肌肉、生殖器、心脏五个组织中,
Rf6 和 Rf8 是共有的酶带,而且肝脏和生殖腺的酶带复
杂,出现明显的性别差异性。心脏、肌肉和脑只有 2
条酶带,而且酶带相似,呈现不同组织同工酶的同源
性.Rf9、Rf10 是肝脏和性腺共有,Rf7 是卵特有,Rf4 雄
性肝特有,Rf5 卵特有。

3 讨 论
酶谱是基因编码的产物.研究表明: 动物在非正
常生长环境或在其它逆境条件下,可以诱导动物合成
新的特异性蛋白,同工酶谱也会发生改变。自从

4 期 黄红英,等:棕背树蜥不同组织三种同工酶之间的差异研究 341
万方数据
表 3 过氧化氢酶同工酶迁移率
Table 3 Mbility of Peroxidase Isoenzymes
肝 Piver 脑 Brain 心 Heart 肌肉 Muscle 卵 Egg 睾丸 Spermary 酶带
Isoenzyme a b a b a b a b a B
Rf1 - - - - - - - - - -
Rf2 - - - - - - - - - -
Rf3 - - - - - - - - - -
Rf4 - 0.38 - - - - - - - -
Rf5 - - - - - - - - 0.45 -
Rf6 0.50 0.50 0.53 0.54 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.52
Rf7 - - - - - - - - 0.62 -
Rf8 0.72 0.72 0.73 0.74 0.74 0.75 0.76 0.74 0.74 0.75
Rf9 0.83 0.82 - - - - - - 0.84 0.84
Rf10 0.94 0.94 - - - - - - 0.97 0.95

Markert 发现同工酶以来 [8],同工酶的研究日益活
跃[1-6]。蜥蜴同工酶的表现不仅反映不同个体生理代谢
的状况,同时可能与其在机体内的功能密切相关,即
也是机体生长发育中生理机能的反映。棕背树蜥不同
组织三种同工酶研究对比结果显示三种同工酶在不同
的组织表现出明显的同源性和差异性。由于栖息韶关
地区的棕背树蜥经过冬眠后真正活动的时间在 4 月以
后,气温达到 20℃以上转入活动状态,而且休眠结束
后成体马上转入繁殖输出季节;因此身体机能恢复过
程与繁殖输出,导致不同组织三种酶表现出明显的同
源性与差异性。
酯酶属水解酶,是一组在不同 pH 条件下,水解
各种脂肪族或芳香族酯类的酶,是催化羧酸酯类的酯
键水解的酶类,能水解大量非生理性存在的酯类化合
物,包括一些药物,有去毒作用[3]。从棕背树蜥 EST
酶酶带和迁移率看出,Rf1 和 Rf3 是共有的酶带,Rf8
除了肝脏不具备外,心脏、肌肉、脑和性腺共有,体
现肝脏的特异性,这种特异与棕背树蜥经过漫长的休
眠,肝脏内三大物质代谢尤其是脂肪代谢有关。心脏
和卵的酶带最复杂,体现心脏机能的活跃和卵巢卵经
过卵裂进行细胞分裂有关。由于生殖机能上繁殖输出
区别,卵的酶带 5 条,睾丸酶带 3 条,呈现性腺酶带
有明显的性别差异。与张永普等[3]对丽纹龙蜥 EST 同
工酶的研究结果对比,虽然棕背树蜥和丽纹龙蜥同属
于鬣蜥科,由于物种的差异以及实验的时间和活动的
地区不同,导致肝脏(棕背树蜥 3 条酶带,丽纹龙蜥
5 条酶带)、心脏(棕背树蜥 5 条酶带,丽纹龙蜥 2 条
酶带)呈现明显的差异,但是雄性性腺相似,都是 3
条酶带,体现物种的亲缘性。
α-淀粉酶是将淀粉降解为麦芽糖的水解酶类,从
α-淀粉酶酶带(图 2)和迁移率(表 2)可看出 Rf4
是共有的酶带,呈现不同组织同工酶的同源性;肝脏
酶带复杂,酶带 3 条, 而且雌体肝和雄性肝酶带出现
差异,呈现性别的特异性。其次是生殖腺和雌体心脏,
酶带 2 条;雌性心脏明显区别与雄性心脏的酶带,与
雌雄个体的体况、繁殖输出与体能输出的差异有关。
过氧化物酶是一种以铁扑啉为辅基的氧化还原酶,
它广泛存在于动物组织中,它可催化 H2O2 还原生成
H2O。过氧化氢释放出新生态氧以氧化某些酚类和胺
类,起到提供电子使氧自由基还原,增强抗氧化酶活
性,迅速消灭自由基的作用,因此过氧化物酶是细胞
的一个重要的氧自由基的清除剂,是动物体内防御自
由基的酶系统。从棕背树蜥 AMY 酶酶带和迁移率看
出,Rf6 和 Rf8 是共有的酶带,呈现不同组织同工酶的
同源性,肝脏和生殖腺的酶带明显复杂活跃,Rf9 和
Rf10 是肝脏和性腺共有,Rf7 卵特有,Rf4雄性肝特有和
Rf5 卵特有.出现明显的性别差异性;肝脏酶带为♀4、
♂5,生殖腺的酶带为♀6、♂4。肝脏代谢机能旺盛产
生较多的活性氧,经过冬眠聚积体内的 H2O2 多,导
致肝脏酶带明显复杂活跃。由于 5 月份是蜥蜴活动时
期,而且此时成熟雌性个体内有多枚卵巢乱,腹腔被
卵占据,行动不便,而雄性个体活动很活跃,导致肝
的 AMY 酶带出现明显的性别差异.此外,由于取出的
是受精卵巢卵,受精卵已经进入卵裂,细胞代谢加强,
体内 H2O2 多,所以卵的酶带明显比睾丸多 2 条酶带.
其次是雄性生殖腺和雌体心脏,酶带 2 条,雌性心脏
明显区别于雄性的酶带,呈现出性别的特异性。

参考文献

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表型效应与目内物种及种群间亲缘关系的研究[J]. 遗传,
24(6):670-674.
(下转第 353 页)
342 生 态 科 学 25 卷
万方数据
自然保护区(包括森林公园)面积 386 km2,占总面
积的 3.9%。全市已建黄山区为全国生态示范区,歙县
为全国生态农业实验县。由于有较高的森林覆盖率,
对污染物的接纳和净化能力较强,大气环境质量较高,
整个市域的生态环境协调能力很强。动植物资源丰富,
具有较高的生物多样性,有利于区域生态环境的整体
保护。

3 结论与讨论
3.1 主要结论
(1)近 10 年来,黄山市土地的基本用地特征变化不
大,林地和耕地一直占很大比重,林地、耕地的面积不断
减少以及城乡居民点和工矿用地迅速增加是土地利用
变化的突出特点。林地多转化为人工牧草地,城乡居
民点和工矿用地建设占用大量农田。
(2)黄山市生态环境质量总体上良好,有林地
790966.1 hm2,森林覆盖率为 79.1%,生态环境指数
高达 0.822。全市自然保护区面积 386 km2,占总面积
的 3.9%,市域的生态环境协调能力较强。
(3)近 10 年来黄山市生态环境有退化的趋势,其
间 1987~1995 年退化相对较严重。从表 3 可以明显看
出:1987~1995 年 EV 值普遍有不同程度的下降,但
1995~2000 年 EV 值基本保持不变。
(4)不同地域之间的生态环境质量存在差异,祁门
县的生态环境质量最好 EV=0.861,屯溪区生态环境质
量最差 EV=0.623。近年来,休宁县的生态环境有所改
善,EV 值从 0.811 增加至 0.813,其他地区都存在不
同程度的退化,黄山区的生态环境退化相对最为严重,
EV 值从 0.827 降至 0.821。
(5)生态环境质量和土地利用类型之间,存在较大
的相关性,尤其是土地利用类型中的林地面积和生态
环境质量息息相关:森林面积减少,EV 值也变小,
生态环境质量也相应下降。
3.2 存在问题
所采用的定量测算生态环境质量的方法并不完
善,存在一定的主观性,不能精确、客观的反映研究
区具体的生态环境质量。研究区土地利用类型的划分
应该进一步细化,如耕地可划分为水田和旱地,林地
可划分为有林地、疏林地与灌木林地,以便于更加精
确的确定不同土地利用类型的相对生态价值。

参考文献

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(上接第 342 页)
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4 期 崔淑卿,等:黄山市土地利用变化的生态效应研究 353
万方数据
棕背树蜥不同组织三种同工酶之间的差异研究
作者: 黄红英, 易道生, 高建林, HUANG Hong-ying, YI Dao-sheng, GAO Jian-lin
作者单位: 黄红英,HUANG Hong-ying(韶关学院英东生物工程学院), 易道生,YI Dao-sheng(农产品检验所), 高建林
,GAO Jian-lin(实验中心,韶关,512005)
刊名: 生态科学
英文刊名: ECOLOGICAL SCIENCE
年,卷(期): 2006,25(4)
被引用次数: 1次

参考文献(8条)
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3.龚大洁;周开亚 同工酶及其在爬行动物系统学中的应用 1999(01)
4.杜震宇;邵邻相 5种动物LDH和SOD同工酶的比较[期刊论文]-华南师范大学学报(自然科学版) 2002(01)
5.Markert C L;Ursprung H The Ontogeny of isozyme patterns of lactate dehydrogena in the Mouse (Dev.Bio)[外文期刊]
1962(05)
6.张永普;贾守菊;陈艳乐 丽纹龙蜥不同组织的同工酶[期刊论文]-河南师范大学学报(自然科学版) 2003(04)
7.肖向红;曾科文;顾海军 丽斑麻蜥和山地麻蜥组织LDH同工酶比较研究 1994(09)
8.李建武;萧能赓;余瑞元;袁明秀,陈丽蓉,陈雅惠,陈来同 生物化学实验原理和方法 1994

引证文献(1条)
1.张思宇.迟德富.李鹤.宇佳 不同色斑型异色瓢虫的同工酶比较[期刊论文]-昆虫知识 2008(3)


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