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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):190-197
羧肽酶（carboxypeptidases，CPs）是一种专一
性地从肽链的 C 端逐个降解、释放游离氨基酸的一
类肽链外切酶。主要分为丝氨酸羧肽酶（EC 3.4.16-
）、金属羧肽酶（EC 3.4.17-）和半胱氨酸羧肽酶（EC
3.4.18-）3 个亚类。羧肽酶广泛应用于医药、食品等
工业领域。在食品工业，可用于制备高 F 值寡肽［1］，
收稿日期 ：2015-05-14
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA101609-7）
作者简介 ：王晓云，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物脱毒与食品安全 ；E-mail ：5052806592@qq.com
通讯作者 ：梁志宏，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物与食品安全 ；E-mail ：lzh01@cau.edu.cn
毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A 的响应面法优化
王晓云  徐诗涵  梁志宏  黄昆仑
（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）
摘 要 ： 采用 Central Composite Design（CCD）实验设计及响应面分析相结合的方法，对毕赤酵母表达牛胰脏羧肽酶 A 的表
达条件进行优化，旨在获得牛胰脏羧肽酶 A 的最佳表达条件。单因素实验结果显示，诱导时间为 96 h 时，最佳甲醇含量为 0.5%、
最佳 pH 值为 4、诱导时最佳菌体 OD600 值为 7。在此基础上，利用 CCD 实验设计及响应面分析法进行回归分析，获得最优表达参
数为 ：甲醇含量 0.5%、诱导 pH 为 5.90、接种前种子培养基 OD600 为 6.54。在优化后的条件下进行验证实验，得到牛胰脏羧肽酶 A
的表达量为 0.325 mg/mL，与理论值（0.326 mg/mL）相比，相对误差较小，为 0.38%。同时，对表达产物进行了 Western Blot 鉴定。
研究表明，采用响应面法分析优化牛胰脏羧肽酶 A 的表达条件准确可靠，有助于找出最佳条件，为指导其在发酵罐中进行高密度
发酵生产牛胰脏羧肽酶 A 奠定基础。
关键词 ： 牛胰脏羧肽酶 A ；毕赤酵母 ；响应面
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.030
Optimization of Expression Conditions of Recombinant Bovine
Pancreatic Carboxypeptidase A in Pichia pastoris by Response Surface
Method
WANG Xiao-yun XU Shi-han LIANG Zhi-hong HUANG Kun-lun
（College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）
Abstract: Central composite design（CCD）and response surface methodology（RSM）were used to optimize the expression conditions
of bovine pancreatic carboxypeptidase A. The results of single-factor test showed that the optimal conditions as following ：the inducible
expression time was 96 hours，the methanol content was 0.5% every 24 h，the initial induction pH4，and OD600 before induction expression
was 7. Based on the above result，CCD was used to design the tests，and RSM to have regression analysis. The optimal parameters for the
expression were obtained as ：methanol content was 0.5% every 24 hours，the induction pH 5.90，OD600 before inducible expression was 6.54，
the expression level after 96 h reached 0.325 mg/mL. Compared with the theoretical value（0.326 mg/mL），the small relative error was 0.38%.
Also，the expression of the target protein was confirmed by Western blot. Conclusively，using RSM for optimizing the expression condition of
bovine pancreatic carboxypeptidase A was accurate and reliable，and conducive to seek the optimal condition，thus this lays a foundation for
guiding the high-density fermentation production of bovine pancreatic carboxypeptidase A in fermenter.
Key words: bovine pancreatic carboxypeptidase A ；Pichia pastoris ；response surface method
2016,32(3) 191王晓云等：毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A的响应面法优化
食品和饲料中赭曲霉素的去除［2］、用作脱苦味剂［3］
等。动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等的胰脏中，
如羧肽酶 A/B（carboxypeptidaseA/B），其数量非常有
限、价格昂贵、导致其应用受到限制。微生物来源
的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中，具有
广阔的应用前景，但后期纯化及大量获得仍然存在
困难。因此，借助基因工程策略采用微生物为宿主
大量生产重组羧肽酶，有助于进一步降低生产成本、
提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围。
赵莹［4］完成了猪羧肽酶 A1 酶原在毕赤酵母中的表
达，易静等［5］完成了人羧肽酶 A1 的毕赤酵母可溶
表达，为进一步研究 CPA1 在抗体导向酶 - 前体药
物疗法中的应用奠定了基础。
赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA）是由曲霉
属（Aspergillus spp.）和青霉属（Penicillium spp.）等
霉菌产生的次级代谢产物，属于聚酮类化合物，主
要存在于谷物及其副产品中［6］。OTA 具有强烈的
肾脏毒性和肝脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作
用［7］，对动物和人体健康有很大的潜在危害，研
究 OTA 的 脱 毒 对 人 类 健 康 生 活 至 关 重 要。1969
年 Pitiou［8］用薄层层析和光谱方法就发现羧肽酶
（CPA）能将赭曲霉毒素 A 降解为 OTα 和 L-苯丙氨酸。
Deberghes［9］在含有赭曲霉的液体培养基（50 mL）
中分别加入 100 μL 的 1、2、5 U 的牛胰脏羧肽酶 A，
结果发现 1 U 羧肽酶 A 降解率为 17%，2 U 羧肽酶
A 降解率为 49%，5 U 羧肽酶 A 降解率达了 100%。
本实验所用菌由师磊等［10］证明具有降解赭曲霉毒
素 A 效果。
巴斯德毕赤酵母表达系统是应用广泛而成功的
蛋白表达系统。与其他真核蛋白及原核蛋白表达系
统相比，具有以下优点［11］：（1）生长速度快，易实
现高密度发酵 ；（2）可生产分泌型蛋白，方便收集
及纯化 ；（3）可避免内毒素及噬菌体污染 ；（4）可
进行蛋白的翻译后修饰，包括多肽的折叠、糖基化、
甲基化等 ；（5）有良好的酵母表达载体，如 pPIC
9K、pPICZα、pMET B 等。外源蛋白的表达条件如
诱导时间、pH、碳源、诱导剂浓度等对目标蛋白的
产量及活性影响较大。优化培养条件可有效提高外
源蛋白含量。
响应面法（Response surface methodology，RSM）
是以多元二次回归数学模型为工具，描述相互作用
的实验因子与响应值之间的关系的数据处理方法。
响应面法能有效地找到因素间的最优组合，相比于
传统的全因子实验设计，该法能在更为经济的试验
次数下，得到精确的统计结果，具有周期短、精确
度高等优点。因此，本研究利用单因素实验，初步
优化了培养基成分，诱导 pH 值、诱导前菌体 OD600
值和甲醇含量。在单因素实验的基础上，利用响应
面法优化实验对初始诱导 pH 值、诱导前菌体 OD600
值和甲醇含量三因素对牛胰脏羧肽酶 A 表达量的影
响进行研究，分析各因素的变化规律，以期获得牛
胰脏羧肽酶 A 表达的最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料
重 组 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 Pichia pastoris（GSll5/
pPIC9K/proCPA，His+，Mut+，本实验室构建、保存（牛
胰脏 ProCPA 基因（Accession No.NM_174750）由北
京奥科鼎盛有限公司依据 P.pastoris 对密码子的偏爱
性进行密码子优化）；Werstern Blot 实验中的 His 标
签小鼠单克隆抗体、AP 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体
均购自 Abcam ；BCIP/NBP 显色液购自 Amresco ；培
养基试剂购自北京奥博星生物技术有限责任公司 ；
其余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株活化 将毕赤酵母重组菌株在新鲜 YPD
平板上划线，于 30℃倒置培养 2 d。
1.2.2 种子培养 从 YPD 平板挑取单菌落接种到 50
mLYPD 培养基中，30℃和 200 r/min 振荡培养过夜，
然后接入 50 mL BMGY 培养基中继续培养至 OD600
达 6.0-8.0。
1.2.3 牛 proCPA 基因的表达 250 μL 种子培养液
接种于 25 mL BMGY（13. 4 g /L YNB，4 ×10- 5 g /L
生物素，100 mL /L 磷酸缓冲液，10 mL /L 甘油）培
养液中。于 28℃，250 r /min 的速度振摇至菌浓度
为所需的 OD600。离心收集菌体弃去 BMGY 培养液，
用 25 mL 改良 BMMY（13. 4 g /L YNB，4 ×10- 5g /L
生物素，100 mL /L 磷酸缓冲液，1% 山梨醇，所需
的甲醇浓度）培养液。于 28℃，250 r /min 的速度
振摇，开始诱导表达，每 12 h 或 24 h 补充甲醇。于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3192
24、48、72、96、120 h 分别取 1 mL 上清液。
1.2.4 发酵产物分析 每天收集 1 mL 的发酵上清
液，测量 OD 值，4℃，10 000 r/min 离心 5 min，取
出上清，-20℃保存，备检。
1.2.5 表达上清检测 对上清中的蛋白进行 SDS-
PAGE、Western Blot 验证及纯化。利用 Bradford 法，
结合标准曲线对表达上清中的蛋白含量进行分析。
980 μL 考马斯亮蓝 G250 中加入 20 μL 的表达上清，
充分混匀。室温反应 2 min，测定 595 nm 处的吸光
值。依据标准曲线，计算蛋白浓度。
SDS-PAGE 分 析 ：配 制 12% 分 离 胶 和 5% 浓
缩 胶， 取 上 述 样 品 40 μL， 加 入 10 μL 5×Loading
Buffer，混合制样。每孔上样 30 μL，浓缩胶电压
80 V，分离胶电压 120 V。电泳结束后，ddH2O 冲
洗后，在考马斯亮蓝染色液中振荡染色 40 min，然
后用 ddH2O 反复冲洗，放入脱色液（10% 的乙酸）
中脱色，直至背景清晰，此过程需不定时更换脱
色液。
Western Blot 验 证 ：将 SDS-PAGE 电 泳 结 束 后
未染色的胶，电转至 NC 膜上 ；加入封闭液（5% 的
BSA 溶于 TBST 中）室温振荡孵育 1 h ；TBST 振荡
洗涤 6 次，每次 5 min ；加入 TBST 溶液稀释的 His
标签的鼠源一抗，4℃孵育过夜（12-16 h）；TBST
振荡洗涤 6 次，每次 5 min ；加入 TBST 溶液稀释的
AP 标记的羊抗鼠二抗，室温振荡孵育 1 h ；TBST 振
荡洗涤 6 次，每次 5 min ；加入 BCIP/NBP 显色液，
避光显色 5-10 min，肉眼观察结果。
2 结果
2.1 目的蛋白SDS-PAGE、Western Blot验证及纯化
含重组质粒（pPIC9K/proCPA，His+，Mut+）的
巴斯德毕赤酵母 GS115 菌株经甲醇诱导后在 47 kD
左右有明显的蛋白条带（图 1），与目的蛋白大小符
合。经 Western Blot 分析为目的蛋白（图 2）。
2.2 标准曲线
用 BSA 制作蛋白标准液，根据不同蛋白浓度绘
制蛋白浓度（mg/mL）- 吸光度 A 的标准曲线。经
数据处理分析获得蛋白质标准曲线回归方程为 ：
y=0.4837x+0.2068，R2=0.9931。
2.3 单因素实验结果
2.3.1 甲醇诱导浓度对蛋白表达量的影响 考察甲
醇含量分别为 1% 每 24 h 补加、0.5% 甲醇每 24 h 补
加、1% 甲醇每 12 h 补加时蛋白的表达量。当甲醇
浓度为 0.5% 时，蛋白浓度最大，且在第 4 天后涨势
缓慢，第 6 天时浓度最大（图 3-A）。考虑到工业生
产的时间成本问题，诱导表达时间为 4 d。
2.3.2 诱导 pH 值对蛋白表达量的影响 考察诱导
pH 分别为 3、4、5、6 时目的蛋白的表达量。发现
诱导 pH 值为 4 时第 4 天目的蛋白表达量均较高（图
3-B）。因此，单因素实验中的最适诱导 pH 值为 4。
2.3.3 诱导时菌体 OD600 对蛋白表达量的影响 考
察诱导时菌体 OD600 值分别为 6、7、8 时目的蛋白
的表达量。诱导时菌体 OD600 值为 7 时目的蛋白表
达量最高（图 3-C）。因此，选择菌体 OD600 值为 7
作为诱导表达时的最适的菌体 OD600 值。
72
55
43
34
M1
47
kD
2 3
M ：蛋白质 marker ；1 ：1.0% 甲醇含量每 24 h 补加 ；2 ：0.5% 甲醇含量每 24
h 补加 ；3 ：1.0% 甲醇含量每 12 h 补加
图 1 目的蛋白的 SDS-PAGE 验证
55
43
34
M1 2 3
M ：蛋白质 marker ；1 ：1.0% 甲醇含量每 12 h 补加 ；2 ：1.0% 甲醇含量每 24
h 补加 ；3 ：0.5% 甲醇含量每 24 h 补加
图 2 目的蛋白的 Western Blot 验证
2016,32(3) 193王晓云等：毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A的响应面法优化
2.4 响应面法实验设计
根据 CCD 实验设计原理，综合单因素影响实
验结果，以诱导 pH 值（pH）、诱导表达前培养基
OD600（OD）和甲醇添加量（M）三因素为自变量，
以牛胰脏羧肽酶 A 表达量为响应值，利用 CCD 组
合设计实验方案，并以 -1、0 和 1 分别代表变量的
因素编码（表 1），进行毕赤酵母菌表达牛胰脏羧肽
酶 A 的优化。采用 Design Expert 8.0.6 软件进行实验
设计。
表 1 响应面旋转中心组合设计因素水平编码表
因素
水平
-1.682 -1 0 +1 +1.682
甲醇添加量 %/24 h 0.33 0.40 0.50 0.60 0.67
诱导 pH 3.32 4.00 5.00 6.00 6.67
OD600 5.32 6.00 7.00 8.00 8.68
2.5 模型方程的建立及显著性检验
根据表 2 结果计算各项回归系数，以这些回
归系数建立牛胰脏羧肽酶 A 表达量与诱导 pH 值
（pH）、诱导表达前培养基 OD600（OD）和甲醇添加
量（M）三个因素的数学回归模型。由表 2 可以得
出二次回归方程式为 ：牛胰脏羧肽酶 A 表达量＝
-1.23998+3.07479×M+0.18464×pH-0.082985×OD-
0.055525×M×pH-0.042232×M×OD-3.15950E-
003×pH×OD-2.5376×M2-0.011486×pH2-3.4090E-
003×OD2 ；M、pH 变量的正系数表明，该变量的正
向变化能引起响应值的增加 ；OD 变量负系数表明，
该变量的正向变化能引起响应值的减少。负的二次
项系数表明，方程的抛物面开口向下，具有极大值点，
能够进行最优分析。
表 2 响应面旋转中心组合设计与结果
实验号 M pH OD600 蛋白浓度 /（mg·mL
-1）
1 0.4 4.00 6.00 0.227281
2 0.6 4.00 6.00 0.243270
3 0.4 6.00 6.00 0.285743
4 0.6 6.00 6.00 0.288298
5 0.4 4.00 8.00 0.240516
6 0.6 4.00 8.00 0.248389
7 0.4 6.00 8.00 0.295116
8 0.6 6.00 8.00 0.272003
9 0.33 5.00 7.00 0.278222
10 0.67 5.00 7.00 0.246940
11 0.50 3.32 7.00 0.275096
12 0.50 6.68 7.00 0.328641
13 0.50 5.00 5.32 0.334610
14 0.50 5.00 8.68 0.314841
15 0.50 5.00 7.00 0.323932
回归模型方差分析（表 3）显示，实验选用的
模型显著（P<0.05），说明模型是合适的 ；方差分析
中的确定系数 R2=0.801 6，校正确定系数 R2Adj=0.622
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
㳻ⲭ⎃ᓖmg·mL-1 
24
A
48 72ᰦ䰤h96 120 144 1%⭢䞷24 h㺕࣐0.5%⭢䞷1%⭢䞷12 h㺕࣐
0.31
0.29
0.27
0.25
0.23
0.21
0.19
0.17
0.15
㳻ⲭ⎃ᓖmg·mL-1 
24 48 72ᰦ䰤h96 120 144
pH 4
pH 5
pH 6
B
0.35
0.33
0.31
0.29
0.27
0.25
0.23
0.21
0.19
㳻ⲭ⎃ᓖmg·mL-1 
24 48 72 ᰦ䰤h96 120 144
OD600=6
OD600=7
OD600=8
C
图 3 甲醇浓度（A）、初始诱导 pH 值（B）、及诱导时菌
体 OD600（C）对蛋白表达量的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3194
9。R2Adj 可显示所选模型的拟合程度，即预测值与实
测值之间的相关性，Jalgeker 和 May 建议—个拟合
较好的模型 R2 至少应为 0.80［12］。
由表 3 可知模型的一次项 B 影响显著，A，C
影响不显著。从 F 值可以看出，单因素对提取率的
影响顺序依次是 B>A>C，即 pH> 甲醇添加量 >OD。
交互项影响不显著，二次项 A2 影响极显著，表明该
影响因素对表达量的影响不是简单的线性关系。
2.6 响应面交互作用分析与工艺优化
对诱导 pH 值（pH）、诱导表达前培养基 OD600
（OD）和甲醇添加量（M）三因子，两两作交互作
用分析，对其作响应面图，分别见图 4- 图 6。等
高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两
因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互
作用显著。3 张图中等高线均呈椭圆形，故 3 个因
素两两之间交互作用显著，其中交互作用显著程度
初始诱导 pH 值与甲醇添加量 < 诱导 pH 值与诱导
表达前培养基 OD600< 甲醇添加量与诱导表达前培养
基 OD600。在求取最优提取条件时 RSM 能够综合考
虑各因素对 2 个响应值不同的影响程度及趋势进行
综合评价。可得最佳工艺参数为 ：甲醇每 24 h 含量
0.5%、诱导 pH 为 5.90、诱导表达前培养基 OD600 为
6.54，在此优化条件下，牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达
量为 0.326 mg/mL。为了进一步验证响应面分析法的
可靠性，采用上述最优条件进行蛋白表达，3 组平
行，测得牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达量分别为 ：0.324
mg/mL、0.324 mg/mL和0.326 mg/mL，取平均值为0.325
mg/mL，与理论值相比，相对误差较小，为 0.38%。
因此，采用响应面法分析优化得到的牛胰脏羧肽酶
A 的参数准确可靠，可用于实际操作。
3 讨论
本研究利用毕赤酵母表达系统成功实现了牛胰
脏羧肽酶 A 的可溶性表达及纯化，对表达产物进行
了 SDS-PAGE 及 Western Blot 验证。通过单因素及响
应面法优化了表达条件。羧肽酶作为一大类水解酶，
应用及其广泛，而其来源有限、价格昂贵使其应用
受到了限制。借助基因工程手段可以实现羧肽酶的
大量生产，有助于摆脱来源有限，价格昂贵的限制。
毕赤酵母表达系统是一种应用成熟的表达系统，其
分泌型表达使表达产物实现可溶状态，广泛用于各
类酶的表达。Damaso 等［13］在毕赤酵母中优化表达
了耐热木聚糖，Minning 等［14］在毕赤酵母中优化表
达了米根霉脂肪酶。
外源蛋白的表达量受到许多因素的调节。由
于毕赤酵母对所使用的氨基酸密码子具有明显的偏
爱性，同义密码子的表达效率差别明显［15］。故在
表达外源蛋白时，应进行密码子优化和 GC 含量的
调整［16］。本研究中所使用的表达载体在构建时已
进行了密码子的优化，且表达量有显著提高。宿主
表 3 回归模型方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 0.017 9 0.001838 4.49 0.0140 *
A-M 0.0001780 1 0.0001780 0.43 0.5246
B-pH 0.005408 1 0.005408 13.21 0.0046 *
C-OD 0.00003484 1 0.00003484 0.085 0.7765
AB 0.0002466 1 0.0002466 0.60 0.4557
AC 0.0001472 1 0.0001472 0.35 0.5681
BC 0.00007986 1 0.00007986 0.20 0.6682
A2 0.009280 1 0.009280 22.66 0.0008 **
B2 0.001901 1 0.001901 4.64 0.0566
C2 0.0001671 1 0.0001671 0.41 0.5373
残差 0.004095 10 0.0004095
失拟项 0.004905 5 0.0008190
误差 0.000 5 0.000
总和 0.021 19
注 ：*0.01 < P < 0.05 ；**P < 0.01。R2 = 0.8016，R2Adj = 0.6229
2016,32(3) 195王晓云等：毕赤酵母表达重组牛胰脏羧肽酶 A的响应面法优化
菌的选择也至关重要。目前，用于外源基因表达的
菌株种类众多，如 GS115，X-33，KM71 等。为了
防止外源蛋白被同时表达的蛋白酶酶解，蛋白酶缺
陷 型 菌 株 SMD1168（pep4-）、SMD1165（prb1-） 和
SMD1163（pep4-prb1-） 也 被 广 泛 使 用［17］。 此 外，
表达载体的选择，表达载体导入酵母菌基因组，多
拷贝菌株的筛选，信号肽的选择和改造也至关重要。
发酵条件的优化，如溶氧、pH、温度、甲醇浓
6.84
㳻ⲭ㺘䗮䟿 㳻ⲭ㺘䗮䟿6.345.84
5.34
4.84
0.38 0.48 0.580.53
6.84
6.34
5.84
5.34
4.84 0.38
0.43
0.48
0.53
0.58
0.28
0.29
0.30
0.31
0.32
0.33
0.43
A: M
B
: p
H
A: MB: pH
0.31
0.32
6
0.31
0.29
0.29
0.3
0.3
0.3
0.3
图 4 甲醇添加量和诱导 pH 值的响应曲面和等高线图
8.0
㳻ⲭ㺘䗮䟿 㳻ⲭ㺘䗮䟿7.57.06.5
6.0
0.38 0.48 0.580.53
7.5
7.0
6.5
6.0 0.38
0.43
0.48
0.53
0.58
0.28
0.27
8.00
0.29
0.30
0.31
0.32
0.33
0.43
A: M
c:
o
d
A: MC: od
0.31
0.31
60.29 0.3
0.3
图 5 甲醇添加量和诱导表达前培养基 OD600 的响应曲面和等高线图
8.3
㳻ⲭ㺘䗮䟿 㳻ⲭ㺘䗮䟿7.36.3
5.3
4.3
3.9 5.9 7.96.9
7.3
6.3
5.3
4.3 3.9
4.9
5.9
6.9
7.9
0.28
0.24
8.30
0.26
0.30
0.32
0.34
4.9
B: pH
c:
o
d
B: pHC: od
0.32
6
0.28
0.26
0.28
0.3
0.3
图 6 诱导 pH 值和诱导表达前培养基 OD600 的响应曲面和等高线图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3196
度、碳源、诱导时间等都是影响蛋白产量的重要条
件。pH 值影响细胞的生物量、蛋白表达量、活性及
稳定性。在 pH5.0 时，重组人生长激素的生物量为
42 g/L，蛋白表达量为 271 mg/L，而当培养基 pH 达
6.0 时，虽然细胞生物量最高可达 53 g/L，但是蛋白
表达量仅为 24 mg/L［18］。低温诱导或许可以通过降
低蛋白酶活力，增加外源蛋白稳定性来提高外源蛋
白的产量。合适的甲醇浓度是维持细胞高活性，促
进蛋白高表达的关键因素。过低的甲醇浓度不足以
完全诱导蛋白的表达，而当甲醇浓度过高时又会对
细胞产生毒性，一般超过 1% 的甲醇浓度就会对酵
母细胞产性毒性。本研究中，甲醇浓度为 0.5%，每
天补加培养基体积 0.5% 的纯甲醇时即可诱导目的蛋
白表达，且表达量高于 1% 的甲醇浓度。另外，当
使用甲醇作为唯一碳源时，细胞生长缓慢，混合碳
源补加的方法能有效提高表达量。常用的混合碳源
有甲醇和山梨醇，甲醇和甘油等。Diego 等［19］在培
养基中添加山梨醇显著提高了牛凝乳酶 B 的表达量。
山梨醇的添加有助于降低耗氧量及热产率［20］。本研
究中发现添加山梨醇可以增加蛋白表达量，故在添
加 1% 山梨醇的 BMMY 培养基中进行优化实验。一
般来说，表达体系中细胞密度增加，蛋白表达量也
会相应升高。但较高的细胞密度，溶氧量、营养成分，
酵母细胞的代谢产物会影响目的蛋白的产量和稳定
性。诱导前培养基的 OD 值表示了酵母细胞的生物量，
本研究中，诱导表达前菌体的 OD600 值分别为 6、7、
8，当 OD600 的值为 7 时，第 1 天的蛋白表达量明显
高于其他两组，且在前 4 天一直高于其他两组。
4 结论
本研究采用 CCD 实验设计原理设计及响应面分
析，建立牛胰脏羧肽酶 A 表达量的二次多项式数学
模型。经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好
地预测牛胰脏羧肽酶 A 表达量。
利用模型的响应面及其等高线，对影响牛胰脏
羧肽酶 A 表达量的关键因素及其相互作用进行探
讨，通过典型分析并考虑到实际操作的便利性得到
的最终优化条件参数为甲醇每 24 h 含量 0.5%、诱导
pH 为 5.90、诱导表达前培养基 OD600 为 6.54。同时，
在此优化条件下，牛胰脏羧肽酶 A 表达量的理论值
为 0.326 mg/mL。
采用上述最优条件进行蛋白表达，3 组平行，
测得牛胰脏羧肽酶 A 蛋白表达量分别为 0.324 mg/
mL、0.324 mg/mL 和 0.326 mg/mL，取平均值为 0.325
mg/mL，与理论值相比，相对误差较小，为 0.38%。
因此，采用响应面法分析优化得到的牛胰脏羧肽酶
A 的参数准确可靠，获得了较高的蛋白表达量。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）