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Analyses of sequence variation and secondary structure on rDNA ITS regions of the strains of redtide-caused harmful algae Phaeocystis globosa

赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS区序列变异与二级结构分析


测定了南海球形棕囊藻香港株P1、P2和湛江株ZhJ1的rDNAITS区序列(含5.8srDNA),结合Gen Bank的13条同源序列,比对长度为904bp,变异位点271个,简约信息位点221个,平均(A+T)(34.5%)<(G+C)(65.4%).藻株P1、P2和ZhJ1序列存在变异位点20个,序列间相似性为97.9%~98.5%.ITS序列在种间和种内的解析度高于18srDNA和28srDNA基因;构建的NJ树、MP树、贝叶斯推断系统树的结构是一致的,不同种类的棕囊藻单独聚类,不同地理来源的球形棕囊藻混杂分布但相同地理来源的藻株多聚类在一起.RNA二级结构显示,不同藻种间5.8srDNA区结构基本一致,表现出属的特异性;ITS1、2区结构表现较大的种间差异,表明ITS区RNA二级结构可为棕囊藻分类鉴定提供有用的分子结构信息.

Sequences of rDNA ITS region in the Strains P1,P2 and ZhJ1 of Phaeocystis globosa collected from Hongkong and Zhanjiang in South China Sea were determined.Combined with 13 homologous sequences downloaded from GenBank,the aligned ITS sequences of Phaeocystis(including 5.8srDNA) were 904bp,of which 271 sites were variable,and 221 sites were parsimony-informative,the contents of(A+T)(34.5%) were less than those of(G+C)(65.4%).20 sites were variable and no parsimony-informative sites were found in the sequences of P1,P2 and ZhJ1,sequence similarities were 97.9%-98.5%.The resolution to interspecific and intraspecific relationships in ITS sequences were better than 18s,28s gene.The topologies of phylogenetic trees derived from Neighbor-Joining memod,Maximum parsimony method and Bayesian inference were consistent.Different Phaeocystis speciesclustered independently.Although different geographical strains of the same Phaeocystis species might intertwine together,the strains of the same geographical origin strains tended to cluster.A comparison of secondary structures of rDNA ITS sequences revealed that the 5.8srDNA structures were basically the same in different species of the same genus, indicating the specificity of the genus;The secondary structure of the ITS1,2 regions were much different among species;indicating that the secondary structure of rDNA ITS region could provide some molecular structure information for the classification of Phaeocystis.


全 文 :刘海林,章群,江启明,马奔. 赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS 区序列变异与二级结构分析[J]. 生态科学, 2010. 29(5):
432-437
LIU Hai-lin, ZHANG Qun, JANG Qi-ming, MA Ben. Analyses of sequence variation and secondary structure on rDNA ITS regions of
the strains of redtide-caused harmful algae Phaeocystis globosa [J]. Ecological Science, 2010. 29(5):432-437
赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS 区序列变异
与二级结构分析
刘海林 1,2,章群 1*,江启明 1,马奔 1
1暨南大学水生生物研究所,广州 510632
2广东省农业科学院花卉研究所,广州 510640
【摘要】测定了南海球形棕囊藻香港株P1、P2和湛江株ZhJ1的rDNA ITS区序列(含5.8srDNA),结合GenBank的13条同源序列,
比对长度为904bp,变异位点271个,简约信息位点221个,平均(A+T) (34.5%)<(G+C)(65.4%)。藻株P1、P2和ZhJ1序列存在变异位点
20个,序列间相似性为97.9%~98.5%。ITS序列在种间和种内的解析度高于18srDNA和28srDNA基因;构建的NJ树、MP树、贝
叶斯推断系统树的结构是一致的,不同种类的棕囊藻单独聚类,不同地理来源的球形棕囊藻混杂分布但相同地理来源的藻株多
聚类在一起。RNA二级结构显示,不同藻种间5.8srDNA区结构基本一致,表现出属的特异性;ITS1、2区结构表现较大的种间
差异,表明ITS区RNA二级结构可为棕囊藻分类鉴定提供有用的分子结构信息。
关键词:球形棕囊藻;rDNA ITS区;二级结构;序列分析;中国近海
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2010.05.006 中图分类号:Q178.532 文献标识码:A 文章编号:1008-8873(2010)05-432-06
Analyses of sequence variation and secondary structure on rDNA ITS regions of
the strains of redtide-caused harmful algae Phaeocystis globosa
LIU Hai-lin1,2, ZHANG Qun1*, JANG Qi-ming1, MA Ben1
1. Institute of Hydrobiology,Jinan University,Guangzhou ,510632.China;
2. Floricultural Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou ,510640.China.
Abstract: Sequences of rDNA ITS region in the Strains P1, P2 and ZhJ1 of Phaeocystis globosa collected from Hongkong and Zhanjiang in
South China Sea were determined. Combined with 13 homologous sequences downloaded from GenBank, the aligned ITS sequences of
Phaeocystis (including 5.8srDNA) were 904bp, of which 271 sites were variable, and 221 sites were parsimony-informative, the contents of
(A+T)(34.5%) were less than those of (G+C)(65.4%).20 sites were variable and no parsimony-informative sites were found in the sequences of
P1,P2 and ZhJ1, sequence similarities were 97.9%-98.5%. The resolution to interspecific and intraspecific relationships in ITS sequences were
better than 18s, 28s gene. The topologies of phylogenetic trees derived from Neighbor-Joining method,Maximum parsimony method and
Bayesian inference were consistent. Different Phaeocystis species clustered independently. Although different geographical strains of the same
Phaeocystis species might intertwine together, the strains of the same geographical origin strains tended to cluster. A comparison of secondary
structures of rDNA ITS sequences revealed that the 5.8srDNA structures were basically the same in different species of the same genus,
indicating the specificity of the genus; The secondary structure of the ITS1,2 regions were much different among species; indicating that the
secondary structure of rDNA ITS region could provide some molecular structure information for the classification of Phaeocystis.
Key words: Phaeocystis; rDNA ITS region; secondary structure; sequence analysis; coastal waters of China


基金项目:国家自然科学基金项目(40106014)
作者简介:刘海林(1980-),男,山东滨州人,硕士,研究实习员,从事分子生态学研究
*通讯作者:章群.E-mail:tqzhang@jnu.edu.cn
第 29 卷 第 5 期 生 态 科 学 29(5):432-437
2010 年 10 月 Ecological Science Oct.2010

1 引言 (Introduction)

棕囊藻(Phaeocystis)隶属金藻门(Chrysophyta)
定鞭藻纲(Prymnesiop hyceae)定鞭藻目
(Prymnesiales)棕囊藻科(Phaeocystaceae),是全球广
泛分布的广温广盐性海洋微藻类,多数种类产棕囊藻
毒素。随着近年来沿海经济的发展,受水体富营养化
及全球气候变化等影响,棕囊藻赤潮爆发频率和危害
范围逐年增加,它不仅污染环境、破坏海洋景观和生
态平衡,还严重威胁海洋生态安全和渔业生产。国内
自1997年在东南沿海首次爆发棕囊藻赤潮至今已
先后发生多起,危害范围扩大至整个中国沿海 [1-2]。
目前,国内外对棕囊藻分类、生态毒理等研究较多,
但棕囊藻在分类上仍以形态为主。由于单细胞个体微
小、生活史复杂,个体或群体形态具有可塑性、不同
种间表型有重叠等因素的干扰,种类间易混淆或归属
不明,不同学者分类标准的差异亦对藻种的划分产生
分歧,仅依据形态难以准确分类[3-4]。然而,准确及
时鉴定棕囊藻种类,对棕囊藻赤潮危害的监测防控起
着非常重要的作用。
与形态特征相比,DNA反映的是物种的遗传本
质,它受环境影响小,能够较好地解析种内种间差异。
核糖体转录间隔区(Internal transcribed spacers, ITS)
进化速率快,包含的遗传信息更丰富,已被广泛应用
于微藻分类鉴定和遗传变异研究中[5-6]。本文测定了
中国南海球形棕囊藻香港株P1、P2和湛江株ZhJ1
rDNAITS区序列,结合GenBank中同源序列构建系统
树,比较不同种类和同种不同地理株间的遗传差异及
其ITS序列RNA二级结构,探讨ITS序列作为棕囊藻
属分类分子标记的有效性,为棕囊藻分类鉴定开展提
供基础资料。

2 材料与方法 (Material and methods)

2.1 藻株来源
球形棕囊藻香港株P1、P2为1999年棕囊藻赤潮
期间采于香港将军澳海域,由香港大学生态与生物多
样性系提供;湛江株ZhJ1为本实验室分离培养的2005
年广东湛江棕囊藻赤潮样品。其余序列来自
GenBank。

2.2 DNA提取纯化和 PCR扩增
DNA提取及PCR反应参见陈丽芬等(2003)[11]。扩
增上游引物ITSF:5-CGTAACAAGGTTTCCGTAG
G-3’;下游引物ITSR: 5-ACTAGGGGCATCCCTG
TTGG-3’,由上海博亚生物公司合成。PCR产物经1%
琼脂糖凝胶电泳检测合格后,-20℃保存以备测序。

2.3 序列分析和数据处理
PCR 产物纯化后送至上海英骏生物技术有限公
司进行正反向测序。测序引物与 PCR扩增引物相同。
序列经人工校对后,用 ClustalX1.83 软件比对,
MEGA4.0 软件分析碱基组成、遗传距离、序列相似
性等。利用 DNAStar 软件对 ITS 序列进行 RNA 二
级 结 构 预 测 。 以 小 定 鞭 藻
(Prymnesiumparvum)ZB1101(登录号: FJ907460)为
外 类 群 , 利 用 MEGA4.0 构 建 邻 接
(Neighbor-Joining,NJ) 树 、 最 大 简 约 (Maximum
parsimony,MP) 树 , 两 种 树 的 评 估 采 用
Boot-Strap1000 次重复。同时,以 MrBayes 3.1 等软
件进行贝叶斯推断(Bayesian Inference,BI),确定最适
进化模型,运算 100万代得到支持率大于 50%的一致
进化树。

3 结果与分析 (Results and analysis)

3.1 棕囊藻 ITS 序列特征
本文16株棕囊藻ITS序列(含5.8S rDNA)比对长
度为904bp,变异位点为271个(占总长的29.97%),
简约信息位点221个,转换(29)/颠换(34)比为0.9;平
均(A+T)(34.5%)<(G+C)(65.4%),不同于棕囊藻线粒
体、叶绿体非核基因(A+T)%>(G+C)%的特点[12]。球
形与波切、南极棕囊藻,波切与南极棕囊藻种间序列
相似性分别为78.0%、81.4%、87.2%;球形和波切棕
囊藻种内遗传距离为0.045和0.009,序列相似性为
95.7%和99.1%。
ITS1 比对长度为 313bp,变异位点 152 个,简约
信息位点 126 个,转换(17)/颠换 (20)比为 0.9,
(A+T)(28.5%)<(G+C)(71.5%);5.8SrDNA 比对长度
为 176bp,变异位点 8 个,简约信息位点 2 个,转、
颠换数均为 1,(A+T)(55.1%)>(G+C)(44.8%);ITS2
比对长度为 415bp,变异位点 149 个,简约信息位点
124 个 , 转 换 (16)/ 颠 换 (18) 比 为
0.9,(A+T)(28.6%)<(G+C) (71.4%)。可见,两侧的
ITS1、ITS2 区变异较多;中间的 5.8SrDNA 区变异
少,具有较高的保守性。
5 期 刘海林,等.赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS 区序列变异与二级结构分析 433

表 1 棕囊藻藻株采样点及 rDNA ITS 区序列来源
Tab.1 Sampling locations of Phaeocystis strains and the sequence information of rDNA ITS regions used in this study
种(属)及中文名
Species & Chinese
藻株及克隆号
Strains & clone No.
登录号
Accession No.
序列长度
Length(bp)
采样点
Sampling locations
参考文献或来源
Reference or Sources
P.globosa 球形棕囊藻 HongKongP1 本实验室 this lab 722 中国香港 HongKong,China 本文 this article
P.globosa 球形棕囊藻 HongKongP2 本实验室 this lab 707 中国香港 HongKong,China 本文 this article
P.globosa 球形棕囊藻 ZhanJiangZHJ1 本实验室 this lab 834 中国湛江 ZhanJiang,China 本文 this article
P.globosa 球形棕囊藻 CCMP1524(clone11) AJ279500 801 泰国 Thailand
Chen Y Q, et
al.2003[11]
P.globosa 球形棕囊藻 CCMP1524(clone4) AJ279501 810 泰国 Thailand
P.globosa 球形棕囊藻 CCMP627(clone2) AJ279502 818 墨西哥海湾 Mexico Gulf
P.globosa 球形棕囊藻 CCMP627(clone5) AJ279503 822 墨西哥海湾 Mexico Gulf
P.globosa 球形棕囊藻 Santou97(clone2) AJ279504 801 中国汕头 Shantou,China
P.globosa 球形棕囊藻 Santou97(clone6) AJ279505 814 中国汕头 Shantou,China
P.sp.Santou 球形棕囊藻 Santou97(clone3) AJ271217 674 中国汕头 Shantou,China
P.sp.Santou 球形棕囊藻 Santou97(clone8) AJ271218 691 中国汕头 Shantou,China
P.globosa 球形棕囊藻 BOHAI2 EU077557 828 中国渤海 Bohai,China 曲凌云等.2008 [12]
P.globosa 球形棕囊藻 BOHAI EU024766 827 中国渤海 Bohai,China Gao,et al.2008[13]
P.pouchetii波切棕囊藻 P361(clone5) AJ417693 874 挪威 Svalbard,Norway
Chen,et al.2003[11]
P.pouchetii波切棕囊藻 P361(clone3) AJ271046 871 挪威 Svalbard,Norway
P.antarctica 南极棕囊藻 —— AF289039 441 德国 Germany Ben,et al.2001[14]

球形棕囊藻香港株 P1、P2 和湛江株 ZHJ1 序列
间变异位点为 20 个,无简约信息位点,序列相似性
为 97.9%-98.5%。南部海域的香港、汕头藻株与北部
海域的渤海藻株间的序列相似性为 93.8%-94.3%,湛
江与渤海藻株间序列相似性为 90.2%。波切棕囊藻
AJ271046、AJ417693 间遗传距离为 0.009,序列相似
性为 99.1%。同一藻株的不同克隆序列间存在着一定
的差异,如球形棕囊藻 Santou97 株除 AJ279504 与
AJ271217 克隆间序列相似性为 99.1%外,其余克隆
间序列相似性为 97.2%-98.1%;藻株 CCMP1524 的
AJ279500、AJ279501 克隆间序列相似性为 97.0%;
藻株 CCMP627 的 AJ279502、AJ279503 克隆间序列
相似性为 99.3%,这可能与 PCR 扩增或测序过程中造
成的核苷酸位点突变等原因有关。
为进一步了解棕囊藻不同种类rDNA ITS区序列
二级结构上的差异,本文以球形棕囊藻香港株P1及波
切棕囊藻AJ417693、南极棕囊藻AF289039为例,进
行了RNA二级结构预测和比较分析(图1-3)。
从图 1-3 可以看出,由于序列长度和碱基组成上
差异,得到的茎环数量也不相同。球形棕囊藻香港株
P1 有 35 个茎环;波切棕囊藻 AJ417693 有 40 个茎环,
南极棕囊藻 AF289039 由于序列较短,仅有 23 个茎

图 1.球形棕囊藻香港株 P1 ITS 区 RNA 二级结构(722bp)
Fig1. The secondary structrue of the RNA ITS from the strain P1
of Phaeocystis globosa collected from Hongkong(722bp)
(Mini energy:-280.04; temperature 37℃;GU is allowed)
(注:粗箭头处为序列的起始位置,结构观察按逆时针方向,
数字为茎环结构序号,ITS 各分区交界处均有标示,下同.)
(Note: the bold arrow indicated the initial position of the
sequence, the observation of the structure was anticlockwise, the
numbers were the sequential number of the stem-loops, and the
delimitation of every domain of RNA ITS region were labelled.
Ditto for the following secondary structures)

环。在茎环结构组成上,不同种类棕囊藻株具有一些
类似的结构,如香港株 P1 的 14-23 茎环区、波切棕
434 生 态 科 学 Ecological Science 29 卷

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囊藻 AJ417693 的 16-25 茎环区、南极棕囊藻
AF289039 的 12-21 茎环区,而该区域为在碱基序列
和氨基酸序列上都表现出较强保守性的 5.8SDNA 序
列,说明此结构可能具有属的特异性;而 ITS1、ITS2
区 RNA 二级结构,无论从茎环的数量上还是从茎环
形成的位置上,不同种类间和同种类的不同地域的个
体间都显现较大的变化,表现出了一定的种间、种内
结构的差异性。


图 2.波切棕囊藻(AJ417693) ITS 区 RNA 二级结构(874bp)
Fig.2 The secondary structure of RNA ITS sequence of
Phaeocystis pouchetii (AJ417693) (874bp)(Mini energy:-212.76;
temperature 37℃;GU is allowed.)

图 3.南极棕囊藻(AF289039) ITS 区 RNA 二级结构(441bp)
Fig.3 The secondary structure of RNA sequence of Phaeocystis
antartica(AF289039)(414bp)(Mini energy:-68.72; temperature
37℃;GU is allowed.)

3.2 系统发育分析
3 个实验室藻株序列结合 GenBank 中的同源藻
株序列构建 ITS 序列邻接(NJ)树、最大简约(MP)树、
贝叶斯推断(Bayesian Inference, BI)系统进化树。在图
4 的 NJ 树中,不同种类棕囊藻分别聚类,节点支持
率为 89%和 100%;group1 全部为球形棕囊藻,group2
为波切棕囊藻,group3 为南极棕囊藻。球形棕囊藻种
内不同地理株混杂聚类,虽然多数节点的支持率在
60%以下,但相同地理来源的藻株有一起聚类的倾
向;源自同一藻株的不同克隆形成了不同的分支,表
现一定的序列上的差异,可能是 PCR 扩增或测序过程
中造成的碱基突变,导致了不同分支结构的形成,但
也不排除遗传上存在差异的可能性。
球形棕囊藻香港株 P1、P2 与湛江株 ZHJ1 在 ITS
邻接树中聚类在同一支上,节点支持率为 99%。MP
法和贝叶斯推断构建的系统进化树与 NJ 树的拓扑结
构是一致的,仅分支的支持率略有不同,个别样品的
所处的分支位置稍有变动(如 P.globosa AJ279504 和
P.sp.Santou AJ271217),不同种类棕囊藻也分别聚类
形成 3 个明显的大分支,表明本研究得出的不同藻株
间的系统发育关系是较为可靠的。

图 4.基于棕囊藻 ITS 序列的邻接(NJ)树
Fig.4 Neighbor-Joining tree based on ITS sequences of
Phaeocystis
(注:标尺一个刻度代表 0.05 的进化距离,节点旁的数值为节点
的支持率;▲表示本实验室藻株.)
(Note:A scale ruler on behalf of the evolutionary distance of 0.05,
the value next to the node represent the support rate; ▲ means
that the laboratory algae strains.)

4 讨论(Discussion)

4.1 棕囊藻遗传差异的比较分析
分子分类是形态分类的有效补充,目前已有许多
关于赤潮藻类18S rRNA、28S rRNA、叶绿体、线粒
体基因等分类研究的报道,但应用在棕囊藻分类研究
中的多种分子标记的解析效果并不高,未能做到明确
5 期 刘海林,等. 赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS 区序列变异与二级结构分析 435

区分种间及种内关系[13]。
ITS区进化速率快且包含的遗传变异信息多。本
研究球形棕囊藻与波切棕囊藻、球形棕囊藻与南极棕
囊藻、波切棕囊藻与南极棕囊藻种间ITS序列平均相
似性为79.6%、82.9%、87.4%,远小于Zingone et
al.(1999)报道18SrRNA序列相似性99.8%、99%和
99.6%及杨泽民等(2004)报道的球形棕囊藻与南极
棕囊藻种间28SrDNA序列相似性99.99%[14-15],与屈良
鹄等(1999)报道的真菌和藻类种间ITS序列种间差异
值一般大于14.0%的结论基本一致[16];3个种间ITS序
列遗传距离分别为0.220、0.186、0.128,远大于陈月
琴等(2002)报道的球形棕囊藻与波切棕囊藻种间
18SrDNA序列遗传距离0.0098-0.018[8,17]。球形棕囊
藻、波切棕囊藻种内平均遗传距离为0.045、0.009,
大于陈月琴等(2002)报道的球形棕囊藻与波切棕囊
藻种内18SrDNA遗传距离0.0013- 0.0251和0.0031[17].
综上可见,ITS较18SrDNA、28SrDNA具有更高的解
析度,可作为棕囊藻分类研究的一种良好分子标记。
香港株P1、P2和湛江株ZHJ1与纬度相近的汕头、
泰国、墨西哥湾地理株间亲缘较近,与曲凌云等
(2008)的结论一致,支持P. globosa各株系间亲缘
关系的远近与其地理分布无明显关联的观点[8];与低
纬度地区球形棕囊藻渤海株间的遗传距离较大
(0.06-0.105),序列相似性为90.2%-94.3%。香港株P1、
P2间ITS序列核苷酸差异数为12,核苷酸差异率为
1.65%,小于杨泽民等(2004,2005)报道的叶绿体psaA
核苷酸差异率(3.34%)而与psbA基因的核苷酸差异率
接近(1.88%和1.13%)[12,18]。
本研究ITS序列在种间、种内甚至同一藻株的不
同克隆中显示出明显的遗传差异,与 Chen et al.(20
03)、Lange et al.(2002)的研究结论类似,但球形棕囊藻
种内关系的区分效果并不好且地理结构不明显[7,19]。
球形棕囊藻、波切棕囊藻各自种内的不同克隆间ITS
序列存在差异,可能在培养过程中藻株间有杂合或在
克隆扩增及随后的测序时出现意外导致[23]。球形棕
囊相同地理来源的藻株首先聚在一起或邻近位置上,
但分支支持率较低(多数<60%),与曲凌云等(2008)对
18SrDNA基因、Lange et al.(2002)对ITS1序列分析得
到的结论一致,支持Vaulot et al.(1994)报道的球形棕
囊藻可能是一个复合种群的观点[8,19-20]。

4.2 棕囊藻ITS序列二级结构分析
不同于DNA序列和氨基酸序列,RNA二级结构能
够提供结构差异方面的信息,对棕囊藻的分子分类具
有一定的参考价值。它可作为一种―分子形态‖信息,
与形态和分子标记结合起来分析[21]。球形棕囊藻香
港株P1、P2叶绿体psbA基因序列相同,在RNA二级
结构上存在较大差异, 表现明显的种属特异性和种
间差异性[18];叶绿体psaA基因种间RNA二级结构差
异较大,而28SrDNA基因RNA二级结构完全相同,
表现种水平上具有保守性[12,15]。本研究发现,虽然不
同种类的棕囊藻形成茎环结构的位置和数目等方面
存在差别,但仍具有一些相似的结构。5.8SrDNA序
列在不同种类的RNA二级结构中形成一个相似的茎
环结构,说明其具有较强的序列保守性和种属的特异
性,而变异较多的ITS1、ITS2序列的RNA二级结构
在不同种间变化较大,表现出一定的种间差异性,为
棕囊藻分类研究提供了有用的分子结构方面的信息。

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5 期 刘海林,等. 赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS 区序列变异与二级结构分析 437

赤潮棕囊藻(Phaeocystis globosa)rDNA ITS区序列变异与二级结构分析
作者: 刘海林, 章群, 江启明, 马奔, LIU Hai-lin, ZHANG Qun, JANG Qi-ming, MA Ben
作者单位: 刘海林,LIU Hai-lin(暨南大学水生生物研究所,广州,510632;广东省农业科学院花卉研究所,广州,510640)
, 章群,江启明,马奔,ZHANG Qun,JANG Qi-ming,MA Ben(暨南大学水生生物研究所,广州,510632)
刊名: 生态科学
英文刊名: ECOLOGICAL SCIENCE
年,卷(期): 2010,29(5)

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