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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):222-227
多肽通常认为是所含氨基酸数量在 50-100 的小
分子蛋白，因为易于合成与优化组合，使其在药物
研发中表现出特定的优势和临床价值［1］。结核杆菌
的持留性和耐药性使抗结核病成为近年来中国所面
临的重要问题之一［2］，结核杆菌基因组测序完成后，
针对结核杆菌的多肽抑制剂研究成为新的药物研发
方向［3，4］。
异柠檬酸裂解酶（ICL）是结核杆菌在人体内处
收稿日期 ：2015-07-06
基金项目 ：吉林省科技发展计划项目（2008110）
作者简介 ：陈吉，男，硕士，研究方向 ：生物工程学 ；E-mail ：415786094@qq.com
通讯作者 ：吴丛梅，女，教授，研究方向 ：生物工程学 ；E-mail ：wucmyue@sina.com
合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用
陈吉  殷玉和  李玲玲  金浩  唐铭一  吴丛梅
（长春工业大学化学与生命科学院，长春 130012）
摘 要 ： 评价合成多肽对人白血病单核巨噬细胞 THP-1 的毒性和对结核分枝杆菌 H37Rv 的胞内抑菌作用。 通过多肽的不同
给药浓度，确定多肽对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC），利用流式细胞术方法和 MTT 法检测 2 号肽对细胞 THP-1 的毒性作
用，同时采用 CFU 方法检测其对 H37Rv 菌株的胞内抑菌作用。筛选的 4 条多肽均有抑菌作用，其中 2 号肽的最小抑菌浓度（MIC）
最小，为 200 μg/mL。2 号肽与细胞 THP-1 作用时，浓度为 1 200 μg/mL 时表现出细胞毒性，与 INH 细胞毒性无显著差别。对于胞
内 H37Rv，2 号肽抗结核作用具有时间和剂量依赖效应，随给药时间和剂量的增加 H37Rv 菌落数明显下降。2 号肽不仅对巨噬细胞
THP-1 的毒性小，而且具有较好的抗胞内结核分枝杆菌活性，是一种潜在的抗结核新型药物。
关键词 ： 合成多肽 ；结核杆菌 ；巨噬细胞 ；胞内抑菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.030
Intracellular Inhibitory Effect of Synthetic Peptide on Mycobacterium
tuberculosis
CHEN Ji YIN Yu-he LI Ling-ling JIN Hao TONG Ming-yi WU Cong-mei
（School of Chemistry and Life Sciences，Changchun University of Technology，Changchun 130012）
Abstract: This work is to evaluate the toxicity of the synthetic peptides on mononuclear macrophage THP-1 of human leukemia and
the intracellular bacteriostatic effect on Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The minimum inhibition concentration（MIC）of the synthetic
polypeptide on H37Rv was determined through the different drug concentrations of poly-peptides. Then，the toxic effects of peptide-2 on THP-1
cells were detected using flow cytometry method and MTT method. The colony-forming unit（CFU）method was used for detecting intracellular
bacteriostatic effect of peptide-2 on H37Rv. Results were as below ：All 4 screened peptides had bacteriostatic effect，the MIC of peptide-2
was 200 mg/mL. When the peptides-2 interacted with THP-1 cells，the cytotoxicity emerged at the concentration of 1200 mg/mL，meaning
that there was no significant difference from INH’s cytotoxicity. For intracellular H37Rv，the anti-tuberculosis effects of peptide-2 presented
time- and dose- dependent effect，the H37Rv colony count was obviously decreased with the increase of the time and dose. In conclusion，not
only has the peptide-2 small toxicity to the macrophage THP-1，but also solid intracellular anti-M. tuberculosis effect，and it can be a new and
potential anti-tuberculosis drug.
Key words: synthetic peptide ；Mycobacterium tuberculosis ；macrophage ；intracellular inhibitory
2016,32(4) 223陈吉等：合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用
于持续感染状态时乙醛酸支路代谢中的关键酶，是
其潜伏状态下利用碳源所必需的［5］。本课题组前期
工作即以结核杆菌 ICL 作为靶点筛选可以抑制细菌
生长的多肽，且利用噬菌体肽库筛选技术和分子对
接技术，优化筛选出 4 种异柠檬酸裂解酶肽类抑制
剂［6］。本研究进一步检测这 4 种多肽的细胞毒性和
胞内抑菌作用，以期获得潜在的抗结核新型药物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及菌种 结核分枝杆菌人型无毒株 H37Rv
（利福平、异烟肼敏感菌种）由中国药品生物制品检
定所馈赠。人白血病单核巨噬细胞 THP-1 由吉林大
学疫苗研究实验室馈赠。菌株和细胞均由本实验室
培养传代保存。
1.1.2 肽类化合物及试剂 4 种肽类化合物由本实
验组合成（表 1）。
表 1 4 种肽类化合物
序号 氨基酸序列 分子量 /kD 纯度 /%
1 LTLGPLL 725.9 96.7
2 LYALATM 782 98.8
3 QKASPGA 657.7 98.5
4 TELSLPS 745.8 96.4
二甲基亚砜（DMSO）；DMEM 培养基、RPMI-
1640 培养基（美国 Gibco 公司）；3-（4，5-二甲基
噻唑 -2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，Sigma 公
司）；胎牛血清（FBS 美国 Gibco 公司）；PI 染料（Si-
gma 公司）；其余试剂均为国产分析纯，购自北京化
学试剂厂。
1.2 方法
1.2.1 多 肽 MIC 检 测 将 筛 选 出 的 4条 多 肽 用
DMSO 稀 释， 使 其 终 浓 度 为 100、200、500、800、
1 000 和 1 500 μg/mL， 分 别 加 到 含 正 常 培 养 基 的
H37Rv 菌株培养液的 24 孔板中，37℃培养 2-3 周观
察结果。同时以利福平（RMP，浓度为 0.5 μg/mL）
和异烟肼（INH，浓度为 0.2 μg/mL）作为阳性对照。
以正常 H37Rv 培养液作为阴性对照。观察长菌情况，
并记录各种多肽的 MIC。
1.2.2 流式细胞术测定 2 号肽对 THP-1 细胞的毒
性 收集 THP-1 细胞，2 000 r/min 离心 5 min，弃上
清液后，加入新鲜 RPMI1640 培养液，按 4.0×105
个细胞每孔接种 24 孔细胞培养板中，37℃，5% CO2
条件下培养 24 h，加入 2 号肽，药物浓度分别为 0、
200、400、800、1 000 和 1 200 μg/mL， 各 种 用 药
浓度分别作用 1、3、5 和 7 d，并分别设置加 PBS、
1% DMSO、含 400 μg/mL 的 INH 为阳性对照。取出
与药物作用后的细胞，2 000 r/min 离心 5 min，弃上
清，再用预先冰浴的 PBS 缓冲溶液洗两次，每次 1.0
mL。75% 冰乙醇固定过夜，离心收集细胞，用 300
目筛过滤一次，加碘化丙锭 PI 反应 15 min。使用流
式细胞仪检测细胞凋亡。
1.2.3 MTT 法测定 2 号肽对细胞 THP-1 的毒性 将
稳定感染的细胞接种于 96 孔板，每孔 4×104 个细
胞。向孔内加入 RPMI1640 培养液（含 10% 胎牛血清）
100 μL，其中分别含有 2 号肽浓度为 0、500、800、
1 000、1 200、1 500、1 800 和 2 000 μg/mL 设 为 实
验组，同时用不含药物的 RPMI1640 培养液为空白
对照，含 400 μg/mL 的 INH 为阳性对照。分别于 0、
4 及 7 d 向 96 孔细胞培养板上每孔加入 10 μL 浓度
为 5 mg/mL 的 MTT，继续培养 4 h，培养结束，取
出细胞培养板，离心弃上清，每孔加 100 μL DMSO，
混匀后室温放置 20 min，于 570 nm 检测吸光值。按
下述公式计算巨噬细胞存活率。
细胞存活率（%）=（感染细菌孔 A 均值 - 培
养液对照孔 A 均值）/（未感染细菌孔 A 均值 - 培
养液对照孔 A 均值）×100%
1.2.4 多肽对巨噬细胞胞内 H37Rv 株抑制作用检
测 细菌与巨噬细胞的比例为 10∶1（H37Rv 浓度
1×107/mL，THP-1 细胞密度 1×106/mL）混合，在
终浓度为 100 mmol/L 的丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）
中诱导细胞分化。96 孔板每孔加 100 μL 菌悬液，感
染 4 h 后，每孔加含不同浓度目的肽 100 μL 继续培养，
目 的 肽 给 药 浓 度 为 0、500、800、1 000、1 200、
1 500、1 800 和 2 000 μg/mL。同时用 RPMI-1640 完
全培养液作空白对照，4 mg/mL 的 INH 作阳性对照。
以此时作为细菌感染零时，分别于感染后 0、4 及 7
d 去除板上培养液，每孔加入 50 μL 1% Triton X-100
裂解细胞。待其全部裂解后，每孔加 50 μL RPMI-
1640 细胞培养液终止裂解。混匀后每孔分别作 1∶10
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4224
和 1∶100 稀释，接种于正常培养基 37℃培养 18 d
后计 CFU。
1.2.5 统计学处理 各组数据结果采用“x
-
±s”表示，
采用 t 检验进行各组间均数比较，P < 0.05 为差异显
著，P < 0.01 为差异极显著。
2 结果
2.1 多肽最小抑菌浓度（MIC）检测
根据前期实验结果，合成 4 条多肽，检测其对
H37Ra 菌株的 MIC，同时设 INH 和 RIFD 对照组，实
验结果如表 2 所示。1，3 和 4 号合成多肽的 MIC 均
为 500 μg/mL，而 2 号多肽的 MIC 为 200 μg/mL。而
对照组中，INH 组 MIC 为 0.2 μg/mL，RIF 组 MIC 为
0.5 μg/mL。
表 2 各种化合物对 H37Ra 的最小抑菌浓度
编号 MIC/（ μg·mL-1）
1 500
2 200
3 500
4 500
INH 0.2
RIF 0.5
2.2 多肽对THP-1细胞凋亡的影响
根据以上研究结果，进一步检测 2 号多肽对
THP-1 细胞凋亡的影响。以终浓度分别为 200、400、
800、1 000 和 1 200 μg/mL 五个梯度给药，流式细胞
术检测细胞凋亡。同时设 PBS 空白对照组，DMSO
（1%）和 INH 对照组。结果（表 3，图 1）表明，2
号肽给药组和 INH 对细胞的毒性没有明显差别，但
这两组细胞毒性均明显大于 PBS、DMSO（1%）对
照组，且各组细胞毒性呈现一定的时相性，总体趋
势随时间和浓度增加而增大。
2.3 MTT法测定2号肽的细胞毒性
细胞给予 500-2 000 μg/mL 不同剂量多肽，给药
后第 4 天和第 7 天采用 MTT 法检测细胞存活率。同
时设空白对照组和 INH（终浓度为 400 μg/mL）对照
组。检测结果（图 2）显示，给药后，2 号多肽给药
组随着给药剂量的增加，细胞存活率呈剂量依赖性
降低，而且第 7 天细胞存活率明显低于第 4 天细胞
存活率。其中 INH 组细胞存活率低于 2 号肽给药组。
2.4 筛选多肽对巨噬细胞胞内H37Rv株抑制作用
的测定结果
进一步检测多肽对细胞内 H37Rv 菌的抑制作
用。THP-1 细胞经 100 nmol/L PMA 刺激 48 h 后细胞
由分散、悬浮转变为黏附、贴壁，显微镜下观察细
胞的形态学变化（图 3），细胞体积变大并生成伪足，
表明细胞已经有效贴壁。
以结核杆菌 H37Rv 感染 THP-1 细胞，吞噬对照
菌落计数表明细菌已经被细胞有效吞噬。当 2 号肽
终浓度为 2 000 μg/mL 时，与 INH 对照相比，胞内
细菌下降两个数量级，细菌的生长被明显抑制（图
4），这说明在较低的浓度下，2 号肽表现出对胞内
细菌的抑制作用。通过 t 检验分析，P<0.05，即各
实验组对胞内菌均具有抑制作用，具有显著性差异。
3 讨论
目前多肽化学合成技术成熟，合成多肽容易与
杂质或副产品分离，纯度高，部分多肽比小分子药
物用量少，选择性更强，特异性更好，作用效果好
同时副作用少，更加适合临床应用和市场开拓［7］。
但是多肽也存在很多问题，例如，由于多肽分子大小，
极性，亲水性和带电性等问题，使其缺乏细胞膜渗
透力，影响细胞吸收［8，9］。
本课题组利用噬菌体肽库筛选技术与计算机模
拟分子对接技术优化异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的
筛选［10］。首先通过噬菌体肽库筛选出与 ICL 具有高
亲和力的结合肽，然后利用 Discovery Studio 2.1 模拟
分子对接，将成功对接的多肽采用 Fmoc 固相合成
法，并对其生物活性进行检测。结果显示所合成多
表 3 不同时间、2 号肽浓度下 THP-1 阳性细胞百分比 /%
组别
时间 /d
1 3 5 7
200 μg/mL 0.4 0.1 8.7 0.1
400 μg/mL 0.1 0.1 5.7 0.0
800 μg/mL 0.2 0.3 1.7 0.0
1000 μg/mL 0.2 0.1 0.8 0.0
1200 μg/mL 1.3 0.2 2.3 0.0
INH 8.7 3.9 2.1 1.0
PBS 0.1 0.0 1.0 0.2
DMSO 1.4 0.3 0.3 3.4
2016,32(4) 225陈吉等：合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用
肽均对 ICL 的活性有明显的抑制作用（抑制率均超
过 50%）［11］。本研究中进一步检测所合成多肽的细
胞毒性和胞内抑菌效果。
首先检测多肽的最小抑菌浓度 MIC。实验结果
证实，其中 3 条多肽的 MIC 较高（500 μg/mL），而
2 号多肽的 MIC 为 200 μg/mL。本课题组设计并合成
16 7777 215
C04 5p
Gate: P1 in all
SS
C
-A
10 000 000
5 000 000
0
FL2-A
103 104 105 106 107.2
16 7777 215
C04 5p
Gate: P1 in all
SS
C
-A
10 000 000
5 000 000
0
FL2-A
103 104 105 106 107.2
16 7777 215
C04 5p
Gate: P1 in all
SS
C
-A
10 000 000
5 000 000
0
FL2-A
103 104 105 106 107.2
16 7777 215
C04 5p
Gate: P1 in all
P4
2.1%
P4
2.3%
P4
0.3%
P4
1.0%
SS
C
-A
10 000 000
5 000 000
0
FL2-A
103 104 105 106 107.2
A B
C D
A ：PBS 对照组 ；B ：DMSO 对照组 ；C ：2 号肽组 ；D ：IHN 对照组
图 1 各种试剂对 THP-1 细胞毒性测定结果
0
20
40
60
80
100
120
0 500 800 1000 1200 1500 1800 2000 INH⎃ᓖµg·mL-1㓶㜎ᆈ
⍫⦷/% ##
#
##
#
##
##
##
##
##
#
##
##
##
#
##
##
0 d
4 d
7 d
同 0 d 组相比较，# P<0.05，## P<0.01，n=4
图 2 不同时间、药物浓度对细胞存活率统计
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4226
的 4 种肽类化合物作了多次实验，最终能达到的最
好的纯化度（表 1），而且纯度没有明显差别（其中
2 号和 3 号纯度几乎一致，分别为 98.8%，98.5%）。
但是最小的抑菌浓度相差较多，2 号肽的 MIC 是
200 μg/mL，而 3 号 MIC 为 500 μg/mL。因此，下步
实验选择 2 号多肽作为研究目标。
选用人白血病单核巨噬细胞 THP-1，检测合成
多肽细胞毒作用。流式细胞术检测结果显示，2 号
多肽对细胞凋亡的作用与 INH 对照组没有显著的差
异。而 MTT 实验结果显示，2 号多肽组细胞存活率
高于 INH 对照组。两组实验结果均证实，2 号多肽
的细胞毒性不高于 INH，且细胞毒性有剂量和时间
相关效应，细胞毒性随时间延长而增强，随给药剂
量增大而增强。
进一步检测合成多肽的胞内抑菌作用。THP-1
细胞经 100 nmol/L PMA 刺激 48 h 后，显微镜下可观
察到细胞明显的形态学变化。细胞由分散、悬浮转
变为黏附、贴壁，细胞体积变大并生成伪足，表明
细胞已经有效贴壁。以结核杆菌 H37Rv 感染 THP-1
细胞，计数吞噬对照菌落。实验结果表明，感染后
细菌可在细胞内繁殖，并随着感染时间的延长数量
增加。而给予药物后，当 2 号肽终浓度为 800-2 000
μg/mL 时，细菌的生长受到明显的抑制，且明显低
于 INH 对照组（P<0.01）。这说明 2 号肽在较低的浓
度下，就表现出对胞内细菌的抑制作用。INH 对静
止期的结核分枝杆菌具有抑制作用，但是没有杀菌
作用，而且长期使用可引起耐药性。本研究中 2 号
多肽对结核分枝杆菌的杀菌作用好于 INH，是否是
因为两种药物对静止期细菌的不同影响，其作用机
制有待进一步探讨。
4 结论
多肽类抑制剂具有很好的成药物理参数，并且
能在低浓度下有效抑制细菌生长，具有成药潜力，
是理想的抗结核药物。
参 考 文 献
［1］孙立春 , CIY David H. 多肽药物研究进展［J］. 上海医药 ,
2014, 35（5）：55-60.
A B C
0
1
2
3
4
5
0 500 800 1000 1200 1500 2000 INH⎃ᓖµg·mL-1㧼㩭䇑ᮠLg
CFU/ᆄ 0 d4 d
7 d
# #
# ##
##
#
# ##
##
##
## ##
####
A ：诱导前正常 THP-1 ；B ：100 nmol/L PMA 诱导 6 h ；C ：100 nmol/L PMA 诱导 48 h
图 3 PMA 诱导不同时间细胞分化结果
同 0 d 组相比较，# P<0.05，## P<0.01，n=4
图 4 不同时间、浓度 H37Rv 菌落计数统计
2016,32(4) 227陈吉等：合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用
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2170.
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（责任编辑 李楠）