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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):131-137
肌 动 蛋 白（Actin） 是 真 核 生 物 细 胞 中 普
遍 存 在 的 重 要 蛋 白 质， 构 成 细 胞 骨 架 中 的 微 丝
（microfilament）系统。作为构成细胞骨架微丝系统
的基本组分，肌动蛋白起着重要作用，如参与细胞
分裂、细胞器运动、细胞形态维持、细胞极性的建成、
细胞壁沉积以及细胞伸长等生命活动［1，2］。该蛋白
主要包括 α-actin、β-actin 和 γ-actin 3 种类型，其中，
α-actin 通常存在于平滑肌细胞中，而 β-actin 和 γ-actin
则几乎在所有细胞中存在。目前在高等真核生物中
已报道了多个不同的 actin 基因，在真菌中报道较多
的是 γ-actin 基因［3］。actin 基因在各组织和细胞中的
表达相对恒定，是高度保守的管家基因，因此，通
收稿日期 ：2015-12-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31060110，31360125），内蒙古自然科学基金项目（2012MS0526）
作者简介 ：张虹，女，硕士研究生，研究方向 ：菌根生物技术 ；E-mail ：944434952@qq.com
通讯作者 ：峥嵘，女，博士，研究方向 ：菌根生物技术 ；E-mail ：zhengrong09@163.com
球根白丝膜菌 γ-actin 基因的克隆及表达分析
张虹 峥嵘
（内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特 010022）
摘 要 ： 根据真菌肌动蛋白（actin）基因保守区序列设计引物，用简并 PCR法和 RACE技术分离得到球根白丝膜菌
（Leucocortinarius bulbiger）γ-肌动蛋白基因（Lb-act）的全长 cDNA序列。该序列全长为 1 357 bp，包含一个 1 137 bp的开放阅读框
（ORF），编码 378个氨基酸，5端非翻译区（5 UTR）92 bp，3 UTR长度 128 bp。Port Param软件在线分析结果表明，该 cDNA所
编码的蛋白质理论等电点为 5.12，相对分子质量为 95.022 kD，具有真菌 γ-actin基因 3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明，
Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性，其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不
同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致，验证了该基因作为分子内标的可靠性。
关键词 ： 球根白丝膜菌；肌动蛋白；cDNA ；克隆
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.020
Cloning and Expression Analysis of γ-actin Gene from
Leucocortinarius bulbiger
ZHANG Hong ZHENG Rong
（College of Life Sciences and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot 010022）
Abstract: Designing the primers based on the conserved sequences of several fungal actin genes，the full-length cDNA sequence of γ-actin
gene from Leucocortinarius bulbiger（Lb-act）was cloned using RT-PCR and RACE. The full-length of Lb-act cDNA sequence was 1 357 bp，
consisting of a 1 137 bp open reading frame（ORF），encoding a protein of 378 amino acids，a 5-UTR with 92 bp and a 3-UTR with 128 bp.
The online analysis by Port Param software revealed that the putative amino acids had an isoelectric point of 5.12，a molecular weight of 95.022
kD，and 3 highly conserved regions of fungal γ-actin gene. Blast homology search indicated that the sequences of Lb-act amino acid had a high
similarity with the sequences of Basidiomycetes actin，and it had the closest relationship with the amino acid sequence of Laccaria bicolor
actin. In culture conditions of different carbon and phosphorus levels，the expression levels of Lb-act were almost the same，thus this research
confirmed the reliability that actin gene could be used as intermolecular standard.
Key words: Leucocortinarius bulbiger ；actin gene ；cDNA ；clone
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7132
常在实时定量 PCR 中作为内参基因。此外，actin 基
因现已在植物界、动物界和真菌界作为分子系统学
研究的重要基因之一［4］。
球根白丝膜菌（Leucocortinarius bulbiger）隶属
于担子菌亚门（Basidiomycotina）、伞菌目（Agarica-
les）、 丝 膜 菌 科（Cortinariaceae）、 白 丝 膜 菌 属
（Leucocortinarius），分布于黑龙江、甘肃、吉林、内
蒙古等地［5］。球根白丝膜菌可以食用，具有广阔的
经济用途，并且球根白丝膜菌侵染油松，能与油松
形成典型的外生菌根［6］，对油松生长有显著的促进
作用，菌根形成后不仅可以有效提高寄主植物耐干
旱性［7，8］、抗重金属性［9］、促进植物在盐渍环境下
的生长［10］，而且能够显著提高油松的抗旱能力。前
人研究仅揭示菌根真菌影响植物抗逆性的一些现象，
但本质上菌根真菌对于植物抗逆性的调节是基于对
相关基因表达的调控，即通过上调或下调某些基因
的表达以及诱导新的逆境基因表达来增强植物抗逆
性［11］，菌根同时能增强植物的防病、抗病能力［12］。
球根白丝膜菌功能基因的研究需要一个表达量相对
恒定的内参基因，actin 基因被证明在逆境胁迫条件
下表达量相对恒定［13］，也经常作为内参应用于植物
抗旱基因。
由于受全球环境变化的影响，内蒙古大青山降
水量逐年下降，干旱导致的大量菌根真菌丧失，在
常规造林的过程中使其自然感染菌根真菌比较困难，
人为菌根化苗木的培育显得十分重要，因此，利用
球根白丝膜菌侵染油松等植物提高寄主植物的抗干
旱性，对于提高造林成活率、提高林地肥力利用率
及促进贫瘠林地上的林木生长有着十分重要的意义，
在我国广大西部干旱区筛选不同树种的优良菌根真
菌是实现菌根化苗木造林的重要技术基础［14］。而
有关球根白丝膜菌菌丝体方面研究报道较少，卢丽
君［15］报道了其在不同培养基和 pH 值培养条件下生
长特性的研究，邰图雅［16］报道了其分离及培养特
性的研究。迄今为止，关于球根白丝膜菌的 actin 基
因研究还未见报道，因此，本研究以球根白丝膜菌
菌丝体培养物为材料，用简并 PCR 法和 RACE 技术
克隆球根白丝膜菌 γ-actin cDNA，分析其在不同培
养条件下的表达，并验证其作为内标基因的可靠性，
旨在为探究球根白丝膜菌与油松菌根共生体的抗逆
性相关基因表达和调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料及试剂 球根白丝膜菌通过子实体组织
分离获得，现保存于内蒙古农业大学林学院微生物
实验室。EASY spin Plus 植物 RNA 快速提取试剂盒
（北京艾德莱生物科技有限公司）；GoldScript cDNA
合 成 试 剂 盒（Invitrogen）；MidiPurification Kit 离 心
柱型普通琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根公司）；5
RACE 试剂盒（Invitrogen）；SMAR TerTM RACE cDNA
Amplification Kit 试剂盒（Clontech）；Taq DNA 聚合
酶（TaKaRa）；克隆载体 pMD19-T（TaKaRa）；感受
态大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5α（TaKaRa）。
1.1.2 引物 根据已知真菌的肌动蛋白基因序列，
在其保守区域设计简并引物 Lb-actF 和 Lb-actR，利
用简并 PCR 扩增球根白丝膜菌 γ-actin cDNA 核心片
段 ；根据分离得到的核心片段序列，设计该基因的
特 异 性 引 物 GSP-1、GSP-2、GSP-3 和 GSP-4、GSP-
5，用于 5 和 3-RACE-PCR，引物由上海生工生物技
术公司合成（表 1）。
表 1 球根白丝膜菌 γ-actin 基因 cDNA 克隆引物序列
目的片段 名称 序列（5-3）
核心片段 Lb-actF ATGGARGARGARGTYGCYGC
Lb-actF GGRCCVGACTCGTCRTACTC
5-RACE GSP-1 AGAGTCCTTCTGTCCC
GSP-2 ATACCCACCATCACACCCTG
GSP-3 AAGCCAGCCTTGCACATGCC
3-RACE GSP-4 GAAGGTCAAGATAGTTGCTCCTCCCG
GSP-5 CGAAAGTACTCCGTGTGGATTGGTGG
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 采用 RNA 提取试剂盒提取
球根白丝膜菌总 RNA，利用紫外分光光度计测定其
纯度和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳进行浓度和完整
性检测。利用 GoldScript cDNA 合成试剂盒合成第一
链 cDNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。
1.2.2 球根白丝膜菌 γ-actin cDNA 全长扩增及产物
克隆、测序 核心片段扩增，以 cDNA 为模板进行
RT-PCR 扩增。反应体系（总体积 50 μL）：10×PCR
缓冲液 5 μL，2 mmol/L dNTPs 3 μL，10 μmol/L 的上
2016,32(7) 133张虹等：球根白丝膜菌 γ-actin基因的克隆及表达分析
游和下游引物各 2 μL，cDNA（约 30 ng）5 μL，5 U/μL
Taq 酶 0.5 μL，去离子水 32.5 μL。PCR 反应条件 ：
94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸 1 min，35 个循环 ；72℃延伸 10 min，4℃
保存。PCR 产物经 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳分离，将
目的 DNA 片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。
5-RACE 扩增基因末端，采用 5-RACE 试剂盒
克隆球根白丝膜菌总 γ-actin 基因的 5 端序列。参照
试剂盒说明，对总 RNA 进行目的基因第 1 链 cDNA
的合成，纯化后，对 cDNA 末端加上多聚 C。用引
物 GSP-2 和试剂盒内的桥连铆钉引物 AAP 对已经
加 dC 尾 的 cDNA 进 行 PCR 第 1 轮 扩 增。PCR 反
应 体 系 ：加 dC 尾 的 cDNA 5.0 μL，10×PCR buffer
5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0
μL，10 μmol/L 的引物 GSP-2 和桥连铆钉引物 AAP
各 2.0 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL， 无 菌 去 离 子 水 补
至 50 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变性 2 min ；94℃
变 性 30 s，55℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸 2 min，35 个
循环 ；72℃延伸 5 min，4℃保存。用引物 GSP-3 和
试剂盒内的桥连通用扩增引物 AUAP 进行第 2 轮巢
式 PCR 扩增。PCR 反应体系 ：第 1 轮 PCR 产物 5.0
μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，
10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L 的引物 GSP-3 和
引物 AUAP 各 1.0 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，无菌去
离子水补至 50 μL。反应程序同上。将第 2 轮 PCR
产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。
3-RACE 扩 增 基 因 末 端， 参 照 RACE 试 剂 盒
说 明 书， 使 用 逆 转 录 酶 SMARTScribeTM Reverse
Transcriptase 和引物 3 CDS primer A 对总 RNA 进行
逆转录合成 cDNA。以上述合成的 cDNA 为模板，用
引物 GSP-4 和 UPM 进行第 1 轮 PCR 扩增。反应体系：
cDNA 2.5 μL，引物各 1 μL，Maser Mix 41.5 μL，无
菌去离子水补至 50 μL，降落 PCR 反应程序 ：94℃
30 s，72℃ 3 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，70℃ 30 s，
72℃ 3 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃
3 min，27 个循环。将第 1 轮 PCR 扩增产物稀释 50
倍， 用 引 物 GSP-5 和 UPM 进 行 第 2 轮 PCR 扩 增，
反应体系同上。PCR 反应程序：94℃ 30 s，68℃ 30 s，
72℃ 3 min，20 个循环。将第 2 轮 PCR 产物进行电泳，
并对目的条带进行切胶回收纯化。将上述 3 个纯化
后的 PCR 产物分别与 pMD19-T 连接，转化到感受
态细胞大肠埃希菌 DH5α，菌落 PCR 检测阳性克隆
后送至上海生工生物技术有限公司进行测序。
将上述 3 个纯化后的 PCR 产物与 pMD19-T 连接，
转化到感受态细胞大肠埃希菌 DH5α，菌落 PCR 检
测阳性克隆后送至上海生工生物技术有限公司进行
测序。
1.2.3 球根白丝膜菌 γ-actin 表达分析 分别在不同
碳源、磷水平条件下培养球根白丝膜菌菌丝体，进
行其 γ-actin 的表达特异性分析。PACH 培养基中分
别选用不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、D-山梨醇、
可溶性淀粉）；用 0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 和 0.8
mmol/L 6 个水平磷（KH2PO4）浓度，28℃培养菌丝
体 20 d 后提取菌丝体总 RNA。以等量的 RNA 反转
录 cDNA，取等量 cDNA 进行 RT-PCR 反应，再取等
量的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，经过 3 次重复，
通过比较目的条带的灰度判定基因表达的强弱。
1.2.4 序列比较与系统进化树构建 根据获得的
mRNA 拼接序列，网上 Blast 搜索同源性高的序列，
进行同源性分析。利用 NCBI 的 OFR Finder（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf /gorf. Html）识别 OFR（open
reading frame）序列并推定其所对应的氨基酸序列。
使用 ExPASy 数据库的 PortParam 软件在线（http://
www.expasy.org /tools /protparam.html）分析推定蛋白
质基本性质。利用 NCBI 保守结构域搜索（http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）， 分 析 蛋 白
质的保守结构域。在 GenBank 中，搜索不同真菌的
肌动蛋白序列，与球根白丝膜菌肌动蛋白序列进行
Clustal W 多重序列比较，使用 MEGA5 软件邻接法
（Neighbor-Joining，NJ 法）运算 1 000 次构建系统进
化树，用自展法（Bootstraping）对进化树进行评估。
2 结果
2.1 总RNA的检测结果
取 10 μL RNA 样 液， 稀 释 100 倍， 在 核 酸 蛋
白测定仪（Eppendrof BioPhotometer）中进行检测，
OD260/OD280 为 1.94-1.96，OD260/OD230 为 2.45-2.60，
说明 RNA 纯度高，无蛋白质、酚污染，均一性很好。
电泳结果（图 1）表明，28S rRNA、18S rRNA 与 5S
rRNA 带形整齐，无拖尾，说明 RNA 完整性很好，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7134
点样孔中及其附近也未发现有 DNA 的污染，证明提
取的 RNA 质量较高，可以用于后续的 RT-PCR。
2.3 氨基酸序列分析
Lb-act 编码 378 个氨基酸，理论分子质量大小
为 95.022 kD，理论等电点是 5.12 ；根据 Lb-act 氨基
酸序列，Blast 搜索出 12 种同源性高的序列，其中，
Lb-act 氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的
相似性。该序列与 Punctularia strigosozonata、裂褶
菌（Schizophyllum commune）、粗毛硬革菌（Stereum
hirsutum）、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）4 种真菌的
肌 动 蛋 白 氨 基 酸 序 列（EIN04355、XP003026150、
EIM-85406 和 XP001884444）相似性最高，达 99%，
其 次 与 嗜 蓝 孢 孔 菌 属 的 Fomitiporia mediterranea、
双 孢 蘑 菇（Agaricus bisporusva）、 干 朽 菌（Serpula
lacrymans）、 毒 蝇 伞（Amanita muscaria）4 种 真 菌
的 肌 动 蛋 白 氨 基 酸 序 列（EKM82128、EJD00785、
ABQ17974 和 EGO04181）相似性达 98%，与原毛平
革 菌 属（Phanerochaete） 的 Phanerochaete carnosa、
皱 木 耳（Auricularia delicate）、 乳 牛 肝 菌 等 真 菌 的
肌 动 蛋 白 氨 基 酸 序 列（EKM59011、EJD35981 和
AF156258）相似性达 97%。
2.4 不同碳源和磷水平培养条件下表达特性及稳
定性分析
半定量 PCR 分析结果（图 3，图 4）显示，不
论是单糖葡萄糖，还是双糖麦芽糖和蔗糖，多糖可
溶性淀粉以及醇类物质 D-山梨醇，还是在不同磷水
4 3 2 1 M
1-4 ：均为球根白丝膜菌的 RNA ；M ：DL2000 DNA Marker
图 1 球根白丝膜菌 RNA 电泳结果
2.2 cDNA全长的分析
用简并 PCR 法扩增出球根白丝膜菌肌动蛋白
基因核心片段，结果（图 2-A）显示，在标准分子
质量 1 kb 处出现较亮的 DNA 条带，大小基本接近
目的条带。图 2-B 和 2-C 显示，分别在 250 bp 处出
现了较亮的条带，表明 5 和 3 末端片段大小分别
为 200-250 bp 和 250-500 bp。将测序结果经过全长
拼接，球根白丝膜菌肌动蛋白基因的 cDNA 全长序
列除 1 137 bp 的开放阅读框（ORF），起始密码子为
ATG，终止密码子为 TAA。还包含 5 端 92 bp 的非
编码片段和 3 端 128 bp 的非编码片段，同时 3 端
有一个 27 个核苷酸的 polyA 尾，将其命名为 Lb-act，
cDNA 全长序列提交 GenBank，登录号为 KC995173。
bp
MM
bp
250
500Ʒ
250
ƷBƷ 2000bpLb M 1000A C
M：DL2000 Marker；A：简并 PCR 结果；B：3RACE-PCR 结果；C：5RACE-PCR
结果
图 2 简并 PCR 及 RACE-PCR 产物凝胶电泳
2
28S rRNA
Lb-act
18S rRNA
1 43 5
1 ：葡萄糖 ；2 ：麦芽糖 ；3 ：蔗糖 ；4 ：D-山梨醇 ；5 ：可溶性淀粉
图 3 不同碳源培养条件下 Lb-act 的表达
28S rRNA
18S rRNA
Lb-act
1 2 3 4 5 6
1 ：0.025 mmol/ L ；2 ：0.05 mmol/L ；3 ：0.1 mmol /L ；4 ：0.2 mmol/ L ；
5 ：0.4 mmol/L ；6 ：0.8 mmol/L
图 4 不同磷水平下 Lb-act 的表达
2016,32(7) 135张虹等：球根白丝膜菌 γ-actin基因的克隆及表达分析
平条件下 Lb-act 基因均表达，且表达量基本一致，
表明该基因的表达不受外界碳源和磷水平变化的
影响。
2.5 系统发育树的构建
为进一步探讨球根白丝膜菌肌动蛋白与其他担
子菌（包括腐生型和外生菌根真菌）、丛枝菌根真菌
（AMF）和子囊菌肌动蛋白在分子系统学上亲缘关系，
根据 Lb-act 蛋白序列，在 GenBank 中搜索并参考卓
侃等［3］报道，获得 16 种真菌的肌动蛋白序列。利
用 MEGA5.0 软件，通过 N-J 法运算 1 000 次，获得
了球根白丝膜菌与上述 15 种真菌的肌动蛋白系统进
化树（图 5）。
Leucocortinarius bulbiger KC995173
Laccaria bicolor XP-001884444
Amanita muscaria ABQ17974
Suillus bovinus Q9Y701
Coprinopsis cinerea XP 001839365
Phanerochaete chrysosporium BAC79388
Acaulospora laevis CAE01405
Funneliformis caledonium CAE01402
Gigaspora margarita CAE01403
Scutellospora dipurpurescens CAE01410
Absidia glauca AAA32619
Paecilomyces lilacinus ADB44905
Podospora anserina XP-001911932
Penicillium marneffei XP-002153345
Aspergillus flavus EED51260
Phaeosphaeria nodorum XP-001791794 88
64
27
99
93
60
97
86
61
79
99
18
59 ᣵᆀ㧼
AMⵏ㧼ᆀ㧼
图 5 16 种真菌的肌动蛋白系统进化树
从系统进化树可以看出，上述 16 种肌动蛋白
序列聚类为担子菌、AM 真菌和子囊菌 3 个分化群。
本研究的球根白丝膜菌肌动蛋白聚在担子菌分化群，
与双色蜡蘑聚为一支，其亲缘关系最近，接着与毒
蝇伞、粘盖牛肝菌的肌动蛋白亲缘关系近，与灰拟
鬼伞和黄孢原毛平革菌的肌动蛋白亲缘关系较远。
这在一定程度上可以说明能够形成外生菌根的真菌
肌动蛋白相似性较高。本系统进化树中的 AM 真菌
肌动蛋白由 2 个次级分化群组成，光壁无梗囊霉与
Funneliformis caledonium 聚为一支，珍珠巨孢囊霉与
双紫盾巨孢囊霉聚为其姊妹支。子囊菌肌动蛋白由
2 个次级分化群组成。
3 讨论
肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在的最保守
的古老蛋白之一，在进化上具有高度的保守性［17］。
本研究通过简并 PCR 法和 RACE 技术首次克隆了球
根白丝膜菌 γ-肌动蛋白的 cDNA 全长序列，其具有
actin 基因的保守特征序列，与前人报道的真菌 γ-actin
基因特征一致［18］。 许多研究结果表明不同的生物
中肌动蛋白的数目变化很大［19］，除了大多数酵母菌
和丝状子囊菌只有 1 个单一的肌动蛋白基因外，其
他真菌有少数肌动蛋白基因［20］。从外生菌根真菌乳
牛肝菌克隆得到 2 个肌动蛋白基因，并通过实验证
实其肌动蛋白基因在营养菌丝及与宿主植物形成的
菌根共生体中表达恒定［21］，一个理想的内参基因应
该是稳定的表达于不同类型的细胞和组织中，且表
达量是无显著差别的［22］，本实验也得到相同结果，
在不同碳源和磷水平培养条件下，Lb-act 表达恒定。
16 种真菌 actin 基因氨基酸序列同源性比对分析表
明，球根白丝膜菌与其它 15 种真菌的 Actin 的氨基
酸序列仅在少数位点上有差异，由此说明 Actin 在
氨基酸序列水平上具有高度的同源性［23］，进一步证
明 actin 基因是高度保守的看家基因。因此，本实验
获得的 Lb-act 可为将来球根白丝膜菌 - 油松菌根共
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7136
生体功能基因的研究奠定基础。
由于肌动蛋白基因在进化上的保守性，常被用
于构建物种和基因系统进化树，以衡量不同物种之
间的亲缘关系和分化时间［24］。本研究构建的肌动蛋
白系统进化树中 16 种不同真菌肌动蛋白聚为担子
菌、AM 真菌和子囊菌 3 个分化群，这一聚类结果
与传统形态分类结果一致。另外，有学者认为担子
菌是由子囊菌进化而来［25］，但在该进化树中，担子
菌与子囊菌亲缘关系并不是最近，尽管不断发现的
分子特征给真菌系统学的研究提供了新的信息，但
分子系统学并不能解决所有与生物系统发育有关的
问题，因为分子本身也存在一定的局限性，某一特
定的分子信息可能缺乏解决真菌某一类群系统发育
历史所必需的一些性状［26］，因此 γ-actin 基因能否
反映较低分类阶元，如属级阶元物种的分类进化关
系及子囊菌与担子菌的系统进化关系有待更多物种
γ-actin 基因的获得来进一步验证。根据肌动蛋白基
因序列构建的系统进化树还只是基因的分子进化树，
虽然在区分亲缘关系较远的物种时具有一定的参考
价值，但对具较近亲缘关系的物种则无法做出精确
衡量。完善的物种进化树有待于今后更多肌动蛋白
基因的发现和系统进化分析方法的改进。将球根白
丝膜菌 Lb-act 蛋白序列与 Blast 搜索出的高同源性序
列进行比对分析发现，该序列与多种担子菌肌动蛋
白氨基酸序列高度相似，由聚类图可知，球根白丝
膜菌与双色蜡蘑亲缘关系最近，但这两种菌形态及
分类地位差异较大。在肌动蛋白序列分析中不同目
真菌聚为一类，一方面可能表明其肌动蛋白在进化
上具有高度保守性，另一方面可能与外生菌根真菌
本身的进化有关，这些疑问是今后关注的热点。本
聚类结果在肌动蛋白序列上初步分析了球根白丝膜
菌与其他 15 种真菌间的相互关系，但由于未搜索到
更多真菌肌动蛋白基因方面的信息，不能在较低的
分类阶元更好地反映球根白丝膜菌的分类进化地位，
因此球根白丝膜菌与其他真菌间的亲缘关系有待于
更进一步的研究。
4 结论
球根白丝膜菌肌动蛋白基因的 cDNA 全长序列
除 1 137 bp 的开放阅读框（ORF）外，还包含 5 端
92 bp 的非编码片段和 3 端 128 bp 的非编码片段，
同时 3 端有一个 27 个核苷酸的 polyA 尾，将其命名
为 Lb-act，Lb-act 氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列
有较高的相似性，该基因在不同碳源和磷水平条件
下表达恒定，可作为内参基因，cDNA 全长序列提
交 GenBank，登录号为 KC995173。
参 考 文 献
［1］Vidali L, Hepler PK. Actin and pollen tube growth［J］.
Protoplasma, 2001, 215 ：64-76.
［2］Collings DA, Harper JD, Marc J, et al. Life in the fast lane ：actin
based motility of plant peroxisomes［J］. Can J Bot, 2002, 80（4）：
430-441.
［3］卓侃 , 罗梅 , 廖金玲 , 等淡紫拟青霉 γ-actin 基因 cDNA 全长的
克隆与序列分析［J］. 植物保护 , 2010, 36（3）：78-81.
［4］方玲 , 刘歧莎 , 李倩 , 等 . 肌动蛋白基因和 β- 微管蛋白基因用
于真黏菌系统发育的可行性研究［J］. 菌物学报 , 2013, 32（6）：
1004-1011.
［5］ 白淑兰 . 菌根研究及内蒙古大青山外生菌根资源［M］. 呼和
浩特 ：内蒙古人民出版社 , 2011 ：160-161.
［6］邵东华 , 杨喜平 , 张晓东 , 等 . 浅黄根须腹菌侵染油松形成外生
菌［J］. 生态学杂志 , 2013, 32（1）：80-83.
［7］赵平娟 , 安锋 , 唐明 . 丛枝菌根真菌对连翘幼苗抗旱性的影
响［J］. 西北植物学报 , 2007, 27（2）：396-399.
［8］Zhong CL, Zhang Y, Zheng R, et al. Casuarina research and
application in China［J］. Symbiosis, 2010, 50（12）：107-114.
［9］张小燕 , 黄建国 , 许金山 , 等 . 外生菌根真菌与重金属相互作用
研究现状［J］. 江苏林业科技 , 2004, 31（2）：42-43.
［10］李喜梅 . 外生菌根菌对盐碱化土壤生物修复的初步研究［D］.
哈尔滨 ：东北林业大学林学院 , 2009.
［11］李涛 , 陈保冬 . 丛枝菌根真菌通过上调根系及自身水孔蛋白基
因表达提高玉米抗旱性［J］. 植物生态学报 , 2012, 36（9）：
973-981.
［12］吴小芹 , 孙民琴 , 高悦 , 等 . 几种外生菌根菌对松苗抗非根部
病害的影响［J］. 林业科学 , 2007, 43（6）：88-93.
［13］蒋晓梅 , 张新全 , 严海东 , 等 . 柳枝稷根组织实时定量 PCR 分
析中内参基因的选择［J］. 农业生物技术学报 , 2014, 22（1）：
55-63.
［14］姚庆智 , 闫伟 . 11 株外生菌根真菌菌株纯培养营养生理特性
的研究［J］. 内蒙古大学学报 ：自然科学版 , 2005, 36（2）：
2016,32(7) 137张虹等：球根白丝膜菌 γ-actin基因的克隆及表达分析
187-191.
［15］卢丽君 . 大青山外生菌根真菌培养特性及油松菌根合成研
究［D］. 呼和浩特 ：内蒙古农业大学林学院 , 2005.
［16］邰图雅 , 春蕾 , 斯日古楞 , 等 . 球根白丝膜菌的分离及培养特
性研究［J］. 内蒙古师范大学学报 ：自然科学汉文版 , 2015,
44（3）：412-415.
［17］张少斌 , 刘国琴 . 植物肌动蛋白异型体研究进展［J］. 植物学
通报 , 2006, 23（3）：242-248.
［18］Diez B, Marcos AT, Rodrguez M, et al. Structural and phylogenetic
analysis of the γ-actin encoding gene from the penicillin-producing
fungus Penicillium chrysogenus［J］. Current Microbiology, 2001,
42（2）：117-121.
［19］李园莉 , 江元清 , 赵武玲 , 等 . 谷子肌动蛋白基因的克隆及序
列分析［J］. 植物学通报 , 2002, 19（3）：310-316.
［20］朱雯雯 , 林晓飞 , 张文波 , 等 . 兴安落叶松肌动蛋白基因的分
离与序列分析［J］. 生物技术通报 , 2011（7）：95-100.
［21］Tarkka MT, Vasara R, Gorfer M, et al. Molecular characterization
of actin genes from homobasidiomycetes ：two different actin genes
from Schizophyllum commune and Suillus bovines［J］. Gene,
2000, 251（1）：27-35.
［22］朱芷葳 , 董常生 . 持家基因作为相对定量内标物的稳定性比
较［J］. 生物技术通讯 , 2006, 17（5）：807-809.
［23］Monizde S, Drouin G. Phylogeny and substitution rates of
angiosperm actin genes［J］. Molecular Biology and Evolution,
1996, 13 ：1198-1212.
［24］孙鹏 , 郭玉海 , 祁建军 . 地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列
分析［J］. 安徽农业科学 , 2008, 36（20）：8470-8471.
［25］邢来君 , 李明春 . 普通真菌学［M］. 北京 ：高等教育出版社 ,
1999.
［26］孙广宇 , 彭友良 , 李振歧 , 等 . 核苷酸序列分析在真菌系统学
研究中的应用［J］. 西北农林科技大学学报 ：自然科学版 ,
2003, 31 ：187-192.
（责任编辑 李楠）