全 文 ：第 38卷第 4期第 481页
2009年 8月 　　　　
华中科技大学学报(医学版)
A cta Med Univ Sci Technol H uazhong
　　　　 Vol.38　No.4　P.481
Aug.　2009
庞　然 ,女 , 1982年生 ,博士研究生
■通讯作者 , C orresp onding author , E-m ail:pangran05@163.com
蛇莓乙醇提取物的体外抗炎机制研究
庞　然1 　　张淑玲1■　　赵　雷1 　　刘双林3 　　董继华2 　　叶　翩1
华中科技大学同济医学院附属协和医院　1 感染科　2 中心实验室 , 武汉　430022
3华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科 ,武汉　430030
摘要　目的　研究蛇莓乙醇提取物在体外的抗炎作用 ,初步探讨其抗炎机制。方法　通过脂多糖(LPS)干预 RAW
264.7 巨噬细胞系建立炎症细胞模型 , ELISA 法检测上清液中 TNF-α、 NO 的分泌量 , 实时荧光定量 RT-PC R法检测
TNF-α、iNOS 、血红素氧合酶-1(HO-1)的基因表达 ,Western blo t法测定 HO-1的蛋白表达量 ,免疫细胞化学法检验核因
子-κB(NF-κB)的表达及分布变化。结果　蛇莓提取物干预后细胞所分泌的炎症介质(TNF-α和 NO)与炎症模型组相
比均显著降低(均 P<0.01),并存在剂量依赖关系;实时荧光定量 RT-PCR结果显示蛇莓提取物干预后细胞 TNF-α、iN-
OS 的 mRNA 表达水平显著降低 , HO-1 的 mRNA 表达水平明显升高 , 差异均有统计学意义 , 也存在剂量依赖关系;
Western blot结果显示药物干预后 HO-1 的蛋白表达水平明显升高(P<0.01);免疫细胞化学法结果显示仅有 LPS 干预
时 , NF-κB 表达增强且集中分布在细胞核 ,而药物干预时 , NF-κB 多分布在胞质。结论　蛇莓提取物通过抑制 NF-κB 的
激活 , 下调巨噬细胞表达炎症介质 ,同时促进 HO-1 的释放而发挥一定的抗炎作用。
关键词　蛇莓;　RAW 264.7 细胞系;　核因子-κB;　炎症介质;　血红素氧合酶-1
中图法分类号　R282　　DOI:10.3870/ j.issn.1672-0741.2009.04.016
Anti-inflammatory Effect of Duchesnea indica(Andr)Focke in vitro
Pang Ran , Zhang Shuling ■ , Zhao Lei et al
Department of In fectious Diseases , Union Hospital , Tongj i Med ical College ,
H uazhong University of S cience and Technology , Wuhan 430022
Abstract　Objective　To investig ate the anti-inflammato ry effect o f Duche snea indica(Andr)Focke in vitro.Methods　I n-
flammato ry cell model wa s established by LPS acting on the RAW 264.7 cell line.The secretion of TNF-αand NO in the super-
natant wa s determined by ELISA.The expression of m RNA of TNF-α, iNOS and heme oxygenase 1(HO-1)was de tected by
real-time PCR , the expression of HO-1 pro tein by Western blot , and the distribution o f nuclear facto r-κB(NF-κB)by immuno-
cy tochemical method respectively.Results　Immunocy tochemistry rev ealed that cy toplasm stained to brow n pre sented NF-κB
inactivation after inte rvention of the Duchesnea indica(Andr)Focke , and cell nucleus stained to br ow n presented NF-κB activa-
tion after inte rvention of LPS.The expression of H O-1 m RNA and pro tein could be significantly enhanced by Duchesnea indica
(Andr)Focke , while the expression of pr o-inflamma to ry mediator s TNF-α, NO (iNOS)pro tein and mRNA could be signifi-
cantly reduced in a do se-dependent manne r(P<0.01).Conclusion　The Duchesnea indica(Andr)Focke can significantly re-
sist inflammation by inhibiting the activa tion of NF-κB , regulating the expression and secre tion of pro-inflammatory mediato rs
ca tadromically in murine mac rophages treated by LPS , and enhancing the expression of HO-1.
Key words　Duchesnea indica(Andr)Focke;　RAW 264.7 cell line;　nuclea r factor-κB;　media to rs of inf lammation;　
heme oxygenase-1
　　蛇莓作为一种传统中药 , 是蔷薇科植物蛇莓
[ Duchesnea indica (Andr)Focke] 的全草 ,具有较
强的抗肿瘤 、抗菌消炎 、免疫功能促进 、中枢神经系
统抑制作用。民间主要用于治疗发烧 、咳嗽 、吐血 、
咽喉肿痛 、痈肿 、烫伤等[ 1] 。现代化学和药理研究表
明蛇莓化学成分复杂 ,药理活性强 ,有较强的抗菌消
炎作用 ,但其产生抗炎作用的机制尚不明了。因此 ,
在文献报道的抗癌作用之外 ,本实验拟通过脂多糖
(LPS)刺激 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症
细胞模型 ,研究蛇莓提取物在体外的抗炎作用 ,初步
探讨其抗炎机制。
1　材料与方法
1.1　主要试剂
RPM I 1640 、Trizol 购自 Gibco 公司 , LPS 和
MT T 购自 Sigma公司 ,鼠 TNF-αELISA试剂盒和
血红素氧合酶-1(HO-1)羊抗鼠多克隆抗体购自
R&D Systems公司 ,NO检测试剂盒购自 Beyot ime
Biotech公司 ,M-MLV逆转录酶和 dNTP 购自 Pro-
mega公司 , SYBR Green 购自 Biot ium 公司 , Oligo
(dT18)及引物由 Invit rog en公司合成 ,兔抗鼠多克
隆 NF-κB p65 IgG 抗体购自 Santa C ruz公司 。
1.2　细胞与草药来源
小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7 购自中国典型培
养物保藏中心。蛇莓经湖北中医学院陈科力教授鉴
定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中 。
1.3　蛇莓乙醇提取物的制备
取 50 g 风干的蛇莓磨成粉末 ,用 70%乙醇于
85℃提取 3次(一次 500 ml ,每次 1.5 h),真空过滤
浓缩提取液 ,用去离子水稀释至 1 g/ml(药材∶水)
浓度。用 RPM I 1640 培养液将其稀释成 3 种浓度
10 、5和 1 mg/ L备用。
1.4　细胞培养
小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7使用 RPM I 1640
培养液(加入 100 U/ml青霉素 , 100 μg/ml链霉素
和 100 m l/L 胎牛血清), 50 ml/ L CO 2培养箱中
37℃培养 。
1.5　细胞模型的建立和干预
LPS处理前 24 h 将细胞接种于 6 、24或 96 孔
板上 , 24 h 后细胞贴壁后弃上清 , 加入含 LPS 10
μg/ L 的培养液和不同浓度的蛇莓提取物 ,作用不同
时间后收集细胞 ,分别使用免疫细胞化学法 、实时荧
光定量 RT-PCR 法 、ELISA 法 、Western blo t法检
测。
1.6　实验分组
①正常对照组:不用 LPS 处理也不加药物干
预;②炎症模型组:只用 10 μg/ L 的 LPS 处理而不
加药物干预;③阳性对照组:10 μg/ L 的 LPS 处理
细胞建立炎症模型后地塞米松(DM)0.5 μg/L 干
预;④阴性对照组:10 μg/L 的 LPS 处理细胞建立
炎症模型后黄芪多糖(APS)100 mg/L 干预;⑤实验
组:10μg/L 的 LPS 处理细胞建立炎症模型后用不
同浓度(10 、5和 1 mg / L)蛇莓提取物干预 。
1.7　药物细胞毒性的检测
MTT 法 , 在终止细胞培养前 4 h 加入 20 μl
M TT 溶液(浓度 5 g/L , pH 7.4),终止细胞培养后
每孔加入 150 μl DMSO ,Spect ramax 250全自动定
量绘图酶标仪测定 A490值。细胞病变效应(cyto-
pathic effect ,CPE)检测 ,细胞在提取液中培养 24 h
后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变 。
1.8　NF-κB的检测
利用免疫细胞化学法(SP)检测 NF-κB 的表达
及分布变化。将盖玻片置于培养板中 ,并将细胞接
种于培养板 ,待细胞爬片后 ,药物干预细胞 2 h 。去
上清 ,PBS 洗涤 , 4℃丙酮固定 10 min;用中性树脂
将盖玻片无细胞面贴于玻片上 , 30 ml/L 过氧化氢
甲醇溶液孵育 20 min以封闭内源性过氧化物酶;10
m l/L Triton X-100 37℃5 min , PBS 洗涤;加入山
羊血清室温孵育 20 min;然后加入兔抗鼠多克隆抗
体 NF-κB p65 IgG 抗体(1 ∶200), 4℃冰箱过夜 ,
PBS洗涤;加入二抗(生物素化羊抗兔 IgG , 1∶400),
37℃30 min ,PBS 洗涤;加入 HRP 结合链霉亲合素
(streptavidin-HRP , 1∶400),37℃30 min ,PBS洗涤;
DAB/H2O 2显色 ,苏木精衬染 ,常规脱水 、透明 、封片。
1.9　TNF-α的检测
ELISA 法检测 10 、5和 1 mg/L 3 种浓度的提
取物对炎症细胞模型中细胞因子 TNF-α的影响。
细胞干预 24 h 后取上清 ,利用相应的 ELISA 试剂
盒按说明进行操作 ,测定 TNF-α含量 ,每个实验均
设 2个复孔 。
1.10　NO的检测
使用G riess反应测定细胞培养液中 NO 衍生
物亚硝酸盐的水平 ,按亚硝酸盐检测试剂盒说明进
行操作 ,利用 N aNO 2的产生量绘制标准曲线 。
1.11　TNF-α、iNOS、HO-1 的 mRNA表达量检测
实时荧光定量 RT-PCR法检测 TNF-α、iNOS 、
HO-1的基因表达 。细胞干预 4 h 后提取 RNA ,细
胞总 RNA 提取采用 Trizol试剂提取法 ,具体方法
参照说明书。将 RNA 保存在 -80℃备用 。采用
ABI-7700序列检测仪 。
引物序列分别为 , Mus-iNOS:Forw ard:5′-
GGAGCGAG TTG TGGA TTGTC-3′, Reverse:5′-
GTGAGGGCT TGGCTGAG TGAG-3′;Mus-TNF-
α:Fo rw ard:5′-G TGGAACTGGCAGAAGAGGC-
3′, Reverse:5′-AGACAGAAGAGCGTGGTGGC-
3′;Mus-HO-1:Fo rw ard:5′-CACAGATGGCG T-
CACT TCG TC-3′, Rever se:5′-G TGAGGACCCA-
CTGGAGGAG-3′;Mus-β-act in:Fo rw ard:5′-GC-
TACAGCT TCACCACCACAG-3′, Reverse: 5′-
GG TCT T TACGGATG TCAACGTC-3′。 RNA 经
逆转录反应合成 cDNA , RT 及 PCR反应体系按试
剂盒说明书进行 。实验结果采用 ABI-7700自带软
件对数据自动分析 ,用所给 Ct值应用公式 Fo lds =
2-ΔΔCt进行基因表达差异性分析[ 2] 。
1.12　HO-1蛋白水平的检测
Western blot法检测药物干预前后细胞中 HO-
1的蛋白表达量的变化 。细胞干预 24 h 后 ,冷 PBS
洗涤 ,加入细胞裂解液 ,冰上孵育 15 min ,细胞刮刮
下并收集裂解液 , 10 000 r/min 4℃10 min ,取上清
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保存于-20℃。用 BCA 法测定蛋白质浓度 , 取相
同量蛋白质用于 100 g/ L SDS 聚丙烯酰胺凝胶电
泳;转移至硝基纤维素膜 ,50 g/L 脱脂奶粉溶液 37
℃封闭 1 h;羊抗鼠 HO-1多克隆抗体(1∶200),4℃
孵育过夜 ,洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二抗(1
∶200)室温孵育 1 h ,再加入化学发光显色剂显色 ,
X光片曝光显影 , 凝胶成像分析系统扫描 , pro3.0
软件半定量分析 。
1.13　数据分析
应用 SPSS 12.0统计分析软件包 ,采取单因素
方差分析对实验数据进行处理 ,以 P<0.05为差异
有统计学意义。
2　结果
2.1　药物对细胞的毒性
MTT 实验结果显示 3 种浓度(10 、5和 1 mg/
L)药物干预细胞 24 h 后 ,对细胞活性没有显著影
响。CPE结果(图 1)亦如此。
2.2　炎症模型
LPS刺激细胞后 ,模型组细胞分泌的促炎症介
质显著高于正常对照组细胞;地塞米松(DM)干预
A:正常巨噬细胞;B:10 mg/ L 药物干预后巨噬细胞
图 1　CPE 结果(×100)
细胞后 ,细胞分泌的促炎症介质显著低于只有 LPS
刺激的模型组细胞(P<0.01)。结果显示通过 LPS
刺激 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系可以成功建立炎
症细胞模型 。
2.3　药物对 NF-κB的抑制效果
免疫细胞化学法结果显示蛇莓提取物干预时 ,
胞质被染成棕色(图 2A ～ C),DM 干预时 ,胞质亦被
染成棕色(图 2D),提示 NF-κB 多分布在胞质未被
激活;APS干预时 ,胞核被染成棕色(图 2E),仅有
LPS 干预时 ,胞核亦被染成棕色(图 2F),提示 NF-
κB表达增强且集中分布在细胞核 ,说明 A PS 、LPS
能诱导 NF-κB向细胞核转位 ,使 NF-κB活化;正常
对照组见图 2G 。
A:10 mg/ L 蛇莓干预后;B:5 mg/ L 蛇莓干预后;C:1 mg/ L 蛇莓干预后;D:DM 干预后;E:APS 干预后 , 红色箭头示被染成
棕色的胞核;F:LPS 干预后 , 红色箭头示被染成棕色的胞核;G:正常对照
图 2　免疫细胞化学法观察不同组 NF-κB 的变化(×100)
2.4　药物干预前后上清液中 TNF-α及 NO的水平
药物干预后上清液中 TNF-α及 NO 与模型组
相比显著降低 ,并且药物浓度越高 ,分泌的水平越
低 ,呈现剂量依赖型关系 ,它们之间的差异亦有统计
学意义(P<0.01)。见图 3。
2.5　药物干预前后 TNF-α、iNOS、HO-1 的 mRNA 水平
药物干预后细胞所表达的 TNF-α、iNOS mR-
NA 与模型组相比显著降低(P <0.01 或 P <
0.05),并且药物浓度越高 , TNF-α、iNOS mRNA 的
表达水平越低 ,呈现剂量依赖型关系 ,它们之间的差
异有统计学意义。药物干预后 HO-1 mRNA 水平
明显升高 ,并且药物浓度越高 , HO-1 mRNA水平越
高(P<0.01或 P<0.05),呈现剂量依赖型关系 ,它
们之间的差异亦有统计学意义。见图 4 。
·483·庞　然等.蛇莓乙醇提取物的体外抗炎机制研究
与模型组比较　＊P<0.01;与正常对照组比较　ΔP
<0.01
A:10 mg/ L蛇莓干预后;B:5 mg/ L 蛇莓干预后;C:
1 mg/ L 蛇莓干预后;D:DM 干预后;E:APS 干预
后;F:炎症模型;G:正常对照
图 3　不同组上清液中 TNF-α及 NO水平
2.6　药物干预前后 HO-1 的蛋白水平
Weste rn blo t结果显示 ,药物干预后 HO-1 的
蛋白水平与模型组相比明显升高(图 5),差异有统
计学意义(P<0.01)。
3　讨论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的
作用 ,它通过激活机体的免疫系统 ,释放细胞因子 、
具有生物活性的脂类介质及活性氧等一系列炎症介
质 ,参与炎症反应[ 3] 。根据其对炎症反应的促进或
抑制效应的不同 ,这些炎症介质大致上可分为两类:
促炎介质和抗炎介质 ,两者的比例关系及动态变化
是决定炎症转归的关键因素[ 4] 。
当细胞面临有毒性的化学物质或病原体侵袭的
时候 ,机体的免疫系统会释放出 NF-κB。NF-κB 是
调控众多炎症基因表达的关键转录因子 ,其通常以
非活性状态存在于细胞质中 ,当细胞受到 TNF 、弗
波脂等刺激时 , NF-κB得以活化并从细胞质易位到
细胞核 ,启动多种炎症基因表达 ,使大量的炎性细胞
浸润于炎症部位[ 5-6] 。NF-κB发生核转位是一些免
疫和炎症反应的重要步骤 ,应用 NF-κB抑制剂以减
少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。TN F-α
在炎症细胞因子产生的级联反应中属于末期的效应
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分子 ,也是炎症中起正反馈调控的一个关键分子 ,参
与多种局部和全身的炎症反应[ 7] 。一氧化氮(NO)
是由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化生成 ,既是
一种新的第二信使神经递质 ,也是一个活性很强的
自由基 , 在体内广泛参与多种生理和病理过程 , 如
调节血管张力 、参与神经传递 、介导炎症反应和免疫
反应等。炎症反应过程中 ,在炎症介质产生的同时
抗炎因子 HO-1也被分泌和活化 。HO-1是催化血
红素降解的限速酶 , 从而生成胆绿素 、游离铁和
CO 。研究表明 ,它们不仅能清除机体的活性氧 ,还
能抑制多种促炎介质的产生 ,促进多种抗炎介质的
表达 ,并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应[ 8] 。本
实验即采用 TNF-α、NO 、NF-κB和 HO-1作为评价
药物抗炎效应的标准 。
实验结果显示 ,蛇莓提取物干预后细胞所分泌
的炎症介质(TNF-α和 NO)与模型组相比有显著降
低 ,且呈一定的剂量依赖关系 ,表明蛇莓提取物对以
上促炎因子有明显的抑制作用 ,提示该成分可能在
与促炎因子相关的炎性疾病中起到治疗作用 。实验
结果亦显示 LPS刺激细胞后 NF-κB得以活化并向
核内转位 ,而提取物干预后 NF-κB以非活性状态存
在于胞质中未被激活 ,进一步证实了提取物能通过
抑制 NF-κB活化发挥抗炎作用 。同时 ,提取物也对
抗炎介质产生一定的影响 。本实验结果显示提取物
能促进 HO-1的表达和释放 ,且该作用呈剂量依赖
性。以上结果表明 ,蛇莓提取物能通过抑制 NF-κB
活化 ,抑制多种炎性介质(TNF-α和 NO)释放 , 同
时 ,促进 HO-1的基因表达和释放而发挥抗炎作用 。
本实验选用DM 和 APS 分别作为阳性和阴性对照 。
DM 是传统的抗炎药物;APS 是临床上用于增强免
疫的免疫调节剂 ,能够增强促炎因子的释放[ 9] 。结
果显示 , 一定浓度的 DM 可以显著降低 NF-κB 活
化 , 而 APS 则没有这方面的作用 ,这与文献报道的
结果基本一致[ 10-11] 。
本研究从分子水平探讨了蛇莓乙醇提取物的体
外抗炎活性及其可能的分子机制。通过本研究发
现 ,蛇莓提取物能抑制促炎介质的表达 ,并促进抗炎
介质的表达 ,使得促炎/抗炎介质的比例偏向抗炎一
方 ,从而产生广泛的抗炎作用 ,为进一步研究和开发
新药提供一定的实验基础。
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