全 文 ：翻白草油对呼吸道合胞病毒感染宿主 HeLa细胞凋亡的影响
刘 蕾 张建华 陈 光 吴佳梅 代立娟1 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)
〔摘 要〕 目的 探讨翻白草油抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法 RSV感染宿主 HeLa细胞后，进行翻白草油干预，采用流式细胞术检
测宿主 HeLa细胞凋亡百分比;Western印迹和免疫荧光检测 caspase-3 蛋白的表达。结果 翻白草油(除药物预处理作用)组与 RSV病毒组比较，宿
主 HeLa细胞凋亡百分比及 caspase-3 蛋白的表达明显降低(P ＜ 0. 01)。结论 翻白草油在三种作用方式下(直接灭活阶段、病毒复制阶段、病毒吸附
阶段)有抗 RSV作用，可能与降低宿主 HeLa细胞凋亡及 caspase-3 蛋白的表达有关。
〔关键词〕 翻白草油;呼吸道合胞病毒(RSV) ;HeLa细胞;凋亡百分比;caspase-3
〔中图分类号〕 R3 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2013)16-3889-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2013. 16. 030
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(D201015)
1 佳木斯大学附属第一医院
第一作者:刘 蕾(1973-) ，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事呼
吸道病毒学研究。
The effect of Potentilla discolor oil induces the apoptosis in HeLa cells infected with RSV
LIU Lei，ZHANG Jian-Hua，CHEN Guang，et al.
College of Basic Medical Sciences，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China
【Abstract】 Objective To make sure the anti-RSV effect of Potentilla discolor oil. Methods The expression of caspase 3 was de-
tected by Western blot and the apotosis rate was determined by FACS in Hela cells infected with RSV，the protein was extracted to detect af-
ter Potentilla discolor oil intervention. Results Compared with the virus control group，the expression of caspase-3 protein and the apotosis
rate decreased obviously in Potentilla discolor oil group (P ＜ 0. 01). Conclusions Potentilla discolor oil has anti-RSV effect by direct inacti-
vation，inhibition of virus replication and virus absorption. The anti-RSV effect of Potentilla discolor oil is related to decreasing the expression
of caspase-3 protein and the apoptosis rate of Hela cells infected with RSV possibility.
【Key words】 Potentilla discolor oil;RSV;HeLa cells;Apoptosis rate;Caspase-3
呼吸道感染中 90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道
合胞病毒 (RSV)居首位〔1〕。人类 RSV 尤见于婴幼儿、老年人
及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院患者，大多数儿童和成
人哮喘发作与病毒感染有关，RVS是引起小儿及成人哮喘发作
的主要原因〔2 ～ 4〕。此外，RSV感染可引起一些肺外器官如中枢
神经系统(脑膜炎、脊髓炎、运动失调、偏瘫)、心脏(心肌炎、复
杂性传导阻滞)、皮肤(分布在躯干和面部的皮疹)受损表现。
翻白草油是传统中药翻白草的挥发油。翻白草性味苦，平。功
用主治为祛风湿、解毒。治痢疾、风湿筋骨疼痛、瘫痪、癫痫、疮
疥等。药理学研究证实，具有降低血糖、抗病毒、抗菌和降低血
脂〔5 ～ 7〕等作用，且毒副作用低。翻白草油抗 RSV作用方面的研
究尚未见报道。本文旨在探讨翻白草油抗 RSV的作用。
1 材料与方法
1. 1 材料 翻白草油由本实验室提取，RPMI1640 培养液、胎
牛血清和青霉素-链霉素购自美国 GIBCO 公司。PE AnnexinⅤ
凋亡试剂盒、脱脂奶粉购自美国 BD 公司。兔抗 caspase-3 多克
隆抗体、β-actin、FITC标记的山羊抗兔 IgG 抗体和辣根过氧化
物酶标记的山羊抗兔 IgG 抗体购自美国 Santa 公司。HeLa 细
胞株和 RSV病毒株由佳木斯大学病理生理学教研室保存。
1. 2 细胞培养 HeLa 细胞株在 10%细胞培养基(含有 10%
胎牛血清、青霉素 100 U /ml、链霉素 100 μg /ml) ，37℃，5% CO2
条件下培养，每天换液 1 次，约 80%融合时用 0. 25% 胰蛋白酶
消化，按 1∶ 2 比例传代，直至所需细胞数。
1. 3 药物配制 用 RPMI1640 维持液(含 2%胎牛血清)将翻
白草油进行稀释浓度为 0. 1、0. 025 和 0. 006 3 mg /ml，0. 22 μm
微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。
1. 4 100CCID50 RSV 病毒液配制 用 RPMI1640 维持液(含
2% 胎牛血清)将 RSV病毒原液 1 000 倍稀释，0. 22 μm 微孔滤
器抽滤除菌，4℃保存备用。
1. 5 抗 RSV的作用方式 每一浓度设 4 个培养瓶，实验同时
设病毒对照。①对 RSV 的直接灭活作用:不同浓度的翻白草
油分别与 100CCID50RSV病毒液等量混合，37℃作用 2 h 后，将
其接种在 Hela 细胞中，37℃吸附 2 h 后，弃上清，加维持液
5 ml。②在生物合成阶段对 RSV 的作用:在长成单层 Hela 细
胞上，接种 0. 5 ml的 100CCID50RSV病毒液，37℃吸附 2 h，弃病
毒液。在药物无毒范围内加入不同浓度的翻白草油 5 ml。③
对 RSV吸附的作用:在药物无毒范围内，不同浓度的翻白草油
分别与 100CCID50RSV病毒液等量混合后，立即加到已长成单
层 Hela细胞的 96 孔细胞培养板中，37℃吸附 2 h 后，弃去 96
孔板中液体，加维持液 200 μl。④药物预处理作用:在药物无
毒范围内，每孔细胞预先加入不同浓度的翻白草油 200 μl，
37℃作用 4 h后用 PBS 洗涤 3 次，每孔再加入 100CCID50 RSV，
吸附2 h，弃病毒上清，加维持液 200 μl。
1. 6 流式细胞术检测翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细胞凋
·9883·刘 蕾等 翻白草油对呼吸道合胞病毒感染宿主 HeLa细胞凋亡的影响 第 16 期
亡百分率的影响 ①取翻白草油(0. 006 3 mg /ml)分别以 4 种
作用方式处理样本。细胞用 0. 25%胰酶消化，1 000 r /min离心
5 min弃培养液。②用孵育缓冲液洗重悬细胞，使细胞数为 1 ×
106。③取 100 μl的细胞悬液，分别加入 5 μl Annexin V-PE 和
5 μl 7AAD。④避光孵育 15 min，上机检测。
1. 7 Western印迹检测翻白草油对 RSV 感染宿主 HeLa 细胞
caspase-3 蛋白的影响 样品蛋白裂解，蛋白含量测定，蛋白变
性 100℃、5 min，经 100 V、SDS-PAGE电泳分离后，260 mA电转
移到 PVDF膜 TBST缓冲液漂洗。5%脱脂奶粉封闭 37℃、1 h，
TBST缓冲液漂洗，caspase-3 兔源多克隆抗体 4℃过夜，TBST
缓冲液漂洗，辣根过氧化物酶标记二抗 37℃，90 min，TBST 缓
冲液漂洗。ECL显色试剂显色，对照 Marker记录实验结果。
1. 8 统计学方法 采用 SAS9. 13 软件进行方差分析和 Dunnet
t检验。
2 结 果
2. 1 流式细胞术检测翻白草油对 RSV感染的宿主 HeLa细胞
凋亡的影响 直接灭活、生物合成、吸附、药物预处理、RSV 及
HeLa 细胞凋亡百分比分别为 8. 29% ± 0. 9%、10. 62% ±
1. 1%、10. 93% ± 1. 3%、19. 07% ± 2. 2%、20. 4% ± 2. 7% 和
5. 61% ± 0. 4%。翻白草药物作用组(除药物预处理作用方式
外)HeLa细胞凋亡百分比与 RSV 病毒对照组比较明显降低
(P ＜ 0. 01) (图 1)。
2. 2 Western印迹检测翻白草油对 RSV 感染宿主 HeLa 细胞
caspase-3 蛋白的影响 翻白草油(除细胞保护作用方式)组与
病毒组比较，宿主 HeLa 细胞 caspase-3 蛋白的表达明显降低
(P ＜ 0. 05) (表 1，图 2)。
表 1 Western印迹检测 RSV感染的宿主 HeLa细胞
Caspase-3 蛋白表达(x ± s)
组别 直接灭活 生物合成 吸附 药物预处理
RSV 0. 72 ± 0. 068 0. 53 ± 0. 054 0. 64 ± 0. 059 0. 59 ± 0. 051
翻白草油
0. 1 mg /ml 0. 58 ± 0. 0461) 0. 34 ± 0. 0362) 0. 50 ± 0. 0431) 0. 58 ± 0. 048
0. 025 mg /ml 0. 48 ± 0. 0462) 0. 30 ± 0. 0272) 0. 49 ± 0. 0461) 0. 53 ± 0. 051
0. 006 3 mg /ml 0. 41 ± 0. 0402) 0. 28 ± 0. 0272) 0. 38 ± 0. 0322) 0. 58 ± 0. 053
与 RSV组比较:1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01
图 1 流式细胞术分析翻白草油处理组 HeLa细胞凋亡
1:RSV;2:翻白草油(0. 1 mg /ml) ;3:翻白草油(0. 025 mg /ml) ;4:翻白草油(0. 006 3 mg /ml)
图 2 caspase-3 蛋白表达的Western印迹分析
·0983· 中国老年学杂志 2013 年 8 月第 33 卷
2. 3 激光共聚焦显微镜荧光定量分析翻白草油对 RSV感染宿
主 HeLa细胞 caspase-3 蛋白的影响 激光共聚焦显微镜观察结
果显示各组细胞内均可见不同强度的绿色荧光(图 3)。直接灭
活、生物合成、吸附、药物预处理和 RSV 组荧光强度分别为
1. 781 ± 0. 031、1. 747 ± 0. 030、1. 763 ± 0. 025、1. 917 ± 0. 031 和
1. 976 ± 0. 030。翻白草油(除药物预处理作用方式外)组荧光
强度明显低于 RSV组(P ＜ 0. 01) ;而翻白草油细胞保护作用方
式组荧光强度与 RSV 组比较无差异(P ＞ 0. 05)。实验结果表
明在三种作用方式下(直接灭活阶段、病毒复制阶段、病毒吸附
阶段)翻白草油可能通过抑制 RSV宿主 HeLa细胞 caspase-3 蛋
白抗 RSV，而翻白草油对 RSV无预防作用。
A:HeLa 细胞;B:RSV感染 HeLa 细胞;C:翻白草油对 RSV直接灭活
作用;D:翻白草油对 RSV生物合成阶段作用;E:翻白草油对 RSV吸
附阶段作用;F:翻白草油对 HeLa细胞的保护作用
图 3 caspase-3 蛋白表达(免疫荧光，×600)
3 讨 论
细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡
的重要机制，细胞凋亡是生命的基本特征之一〔8，9〕。细胞凋亡
失控导致许多疾病的发生。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspas-
es)属于 ICE /CED3 蛋白酶家族成员，是凋亡的重要发起者和
执行者。目前发现至少有 14 种之多，分别命名为 caspases-1 ～
14〔10，11〕。它是通过级联反应，最终激活核酸内切酶来实现的，
但普遍认为 caspases-3 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之
路，被认为是凋亡级联反应中的关键酶。
近年的研究发现病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系，许
多病毒性疾病(如病毒性肝炎、免疫缺陷获得性疾病等)的发生
与细胞凋亡密切相关，病毒感染宿主细胞后，通过各种机制参
与细胞凋亡的诱导〔12 ～ 14〕。本实验结果提示，Hela 细胞经 RSV
作用后，可以导致 caspase-3 被激活，参与了 RSV宿主 Hela细胞
的凋亡过程，而翻白草油通过降低宿主 HeLa 细胞 caspase-3 蛋
白表达，减少 RSV引起的宿主 HeLa细胞凋亡。
4 参考文献
1 Kim SR，Ki CS，Lee NY. Rapid detection and identification of 12 respira-
tory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex
PCR assay〔J〕. J Virol Methods，2009;156(1-2) :111-6.
2 Nakamura K，Kato M，Sasaki A，et al. Respiratory syncytial virus-associat-
ed encephalopathy complicated by congenital myopathy〔J〕. Pediatr Int，
2012;54(5) :709-11.
3 代立娟，王 琳，冯 澜 . 肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕. 中
国老年学杂志，2013;33(3) :1309-12.
4 鄢莉宏，陈云天，陈小东，等 . 慢性阻塞性肺疾病稳定期患者呼吸道
合胞病毒感染与气道炎症的关系〔J〕. 中国老年学杂志，2010;30
(10) :2900-2.
5 Xiu LM，Miura AB，Yamamoto K，et al. Pancreatic islet regeneration by e-
phedrine in mice with streptozotocin-induced diabetes〔J〕. Am J Chin
Med，2001;29(3-4) :493-500.
6 Evstropov AN，Burova LG，Grek OR，et al. Experimental therapy of Cox-
sackie B3 virus infection with immunomodulator contained in water-solu-
ble Penthaphylloides fruticosa extract〔J〕. Zh Mikrobiol Epidemiol Immu-
nobiol，2005;(3) :102-4.
7 Subbotina MD，Timchenko VN，Vorobyov MM，et al. Effect of oral adm in-
istration of tormentil root extract (Potentilla tormentilla)on ro tavirus di-
arrhea in children:a randomized，double blind，controlled trial〔J〕. Pedi-
at Infect Dis J，2003;22(8) :706-11.
8 Xu M，Xia LP，Fan LJ，et al. Livin and caspase-3 expression are negatively
correlated in cervical squamous cell cancer〔J〕. Eur J Gynaecol Oncol，
2013;34(2) :152-5.
9 Li C，Ye H. Mifepristone sensitizing cisplatin for cervical adenocarcinoma
HeLa cell sensitivity to chemotherapy and its mechanism〔J〕. Eur J
Gynaecol Oncol，2013;34(2) :142-7.
10 Raymond AA，Méchin MC，Nachat R，et al. Nine procaspases are ex-
pressed in normal human epidermis，but only caspase-14 is fully pro-
cessed〔J〕. Br J Dermatol，2007;156(3) :420-7.
11 Concha NO，Abdel-Meguid SS. Controlling apoptosis by inhibition of
caspases〔J〕. Curr Med Chem，2002;9(6) :713-26.
12 Han X，Li Z，Chen H，et al. Influenza Virus A /Beijing /501 /2009
(H1N1)NS1 interacts with β-tubulin and induces disruption of the mi-
crotubule network and apoptosis on A549 cells〔J〕. PLoS One，2012;7
(11) :e48340.
13 Hong L，Zhang J，Min J，et al. A role for MHBst167 /HBx in hepatitis B
virus-induced renal tubular cell apoptosis〔J〕. Nephrol Dial Transplant，
2010;25(7) :2125-33.
14 Crane M，Iser D，Lewin SR. Human immunodeficiency virus infection
and the liver〔J〕. World J Hepatol，2012;4(3) :91-8.
〔2012-10-19 收稿 2013-01-29 修回〕
(编辑 安冉冉)
·1983·刘 蕾等 翻白草油对呼吸道合胞病毒感染宿主 HeLa细胞凋亡的影响 第 16 期