全 文 ：翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细胞 Caspase- 3蛋白的影响
李玉芬1、 2 ,王淑秋1 ,刘　蕾 1 ,王淑湘 1
( 1.佳木斯大学基础医学院 ,黑龙江佳木斯 154007; 2. 牡丹江医学院第二附属医院 ,黑龙江牡丹江 154101)
摘要:目的: 检测翻白草油对呼吸道合胞病毒 ( RSV )感染宿主 HeLa细胞 Caspase- 3蛋白的影响 ,探讨翻白草油抗 RSV
的作用。方法: RSV感染宿主 HeLa细胞后 ,选取翻白草油进行抗 RSV病毒作用研究 ,采用 Western blot检测宿主 HeLa细胞
Caspa se- 3蛋白的表达。结果:翻白草油组与 RSV病毒组比较 ,宿主 HeLa细胞 Caspase- 3蛋白的表达明显降低 (P < 0. 05)。
结论: 翻白草油在直接灭活阶段和病毒生物合成阶段 ,抗 RSV作用可能与降低 Caspase- 3蛋白的表达有关。
关键词: 翻白草油 ; RSV ; HeLa细胞 ; Caspase- 3
中图分类号: R285; Q25　文献标识码: A　文章编号: 1008- 0104( 2013) 02- 0001- 02
　　呼吸道合胞病毒 ( respira to ry syncy tial v irus, RSV )属于
副黏病毒科 RN A病毒 , RSV病毒有 1个血清型可分为 A、 B
两个亚型 ,在我国主要流行 RV S病毒的 A亚型。 RSV病毒
是引起婴幼儿下呼吸道感染 (肺炎和细支气管炎 )最常见的
病因之一 ,尤其是早产儿、先天性心脏病患儿、免疫缺陷的婴
儿和儿童易发生严重 RSV感染 [1～ 3]。目前 ,除支持治疗以外 ,
尚无有效的抗 RSV病毒治疗药物 ,也没有研究成功的 RSV
疫苗可以有效减少疾病发生率和重症病例病死率。
翻白草是传统中药 ,性味苦 , 平 ,《本草纲目》等多种医
药典籍中均有记载 ,近 30年来的药理学研究证实 ,具有降低
血糖、抗病毒、抗菌和降低血脂等丰富的药理作用 ,且毒副作
用低 [4～ 7]。本文对翻白草油抗 RSV作用进行研究。
1　 材料与方法
1. 1　 化学试剂
翻白草油由本实验室提取。 RPMI1640培养液、胎牛血清
和青霉素 - 链霉素购自美国 Gibco公司。脱脂奶粉购自美国
BD公司。兔抗 Caspa se- 3多克隆抗体、β - actin和辣根过氧
化物酶标记的山羊抗兔 Ig G抗体购自美国 Santa公司。
1. 2　 细胞株和病毒株
HeLa细胞株和 RSV病毒株由佳木斯大学病理生理学
教研室保存。
1. 3　 细胞培养
HeLa细胞株在 10%细胞培养基 (含有 10% 胎牛血清、
青霉素 100U /m L、链霉素 100μg /m L) , 37℃ , 5% CO2条件下培
养 ,每 2天换液 1次 ,约 80% 融合时用 0. 25% 胰蛋白酶消化 ,
按 1: 2比例传代 ,直至所需细胞数。
1. 4　 药物配制
用 RPM I1640维持液 (含 2% 胎牛血清 )将翻白草油进行
稀释浓度为 0. 1mg /m L、 0. 025mg /m L和 0. 0063mg /mL ,
0. 22μm微孔滤器抽滤除菌 , 4℃保存备用。
1. 5　 100CCID50RSV病毒液配制
用 RPMI1640维持液 (含 2% 胎牛血清 )将 RSV病毒原
液 1000倍稀释 , 0. 22μm微孔滤器抽滤除菌 , 4℃保存备用。
1. 6　抗 RSV病毒的作用方式
每一浓度设 4个培养瓶 ,实验同时设病毒对照。
( 1)对 RSV病毒的直接灭活作用
不同浓度的翻白草油分别与 100CCID50RSV病毒液等
量混合 , 37℃作用 2h后 ,将其接种在 Hela细胞中 , 37℃吸附
2h后 ,弃上清 ,加维持液 5m L。
( 2)在生物合成阶段对 RSV病毒的作用
在长成单层 Hela细胞上 ,接种 0. 5mL的 100CCID50RSV
病毒病毒液 , 37℃吸附 2h ,弃病毒液。在药物无毒范围内加入
不同浓度的翻白草油 5mL。
1. 7　 Western blo t检测翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细
胞 Caspase- 3蛋白的影响
样品蛋白裂解 ,蛋白含量测定 ,蛋白变性 100℃、 5min,经
100V、 SDS- PAGE电泳分离后 , 260m A电转移到 PVDF膜
TBST缓冲液漂洗。5%脱脂奶粉封闭 37℃、 1h, TBST缓冲液
漂洗 , Caspase- 3兔源多克隆抗体 4℃过夜 , TBST缓冲液漂
洗 ,辣根过氧化物酶标记二抗 37℃ , 90min, TBST缓冲液漂
洗。ECL显色试剂显色 ,对照 Marker记录实验结果。将结果
进行拍照 ,用凝胶图象处理系统分析目标带的净光密度值。
1. 8　 统计学分析
数据用 SAS( 9. 13版 )软件处理 ,实验组与各对照组的比
较采用 dunnet t检验。
2　 结果
2. 1　 Western blo t检测翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细
胞的作用
实验结束时测定宿主 HeLa细胞 Caspase- 3蛋白水平 ,
在两种作用方式下 (翻白草油对 RSV病毒的直接灭活作用
和在生物合成阶段对 RSV病毒的作用 ) ,翻白草油组与病毒
组比较 ,宿主 HeLa细胞 Caspase- 3蛋白的表达明显降低
(P < 0. 05) (图 1～ 2)。
3　 讨论
病毒引起的感染性疾病一直严重威胁着人类的生命与
健康 ,全球每年约有 16万例婴幼儿死于 RSV引起的下呼吸
道感染 ,约 10%的 RSV毛细支气管炎和肺炎需要住院治疗 ,
患者医疗花费巨大 ,而 RSV感染后可出现的反复喘息甚至
哮喘 [8, 9]。传统中药具有多靶点作用机制、较少不良反应、无
耐药性等优点 ,从中药中筛选高效低毒的抗病毒药物具有重
要的意义。
细胞凋亡作为生命的基本特征之一 ,与细胞增殖共同维
持机体正常生长发育和内环境稳定 ,其失控导致许多疾病的
发生。Caspases- 3是胱冬蛋白酶 ( Ca spases) 家族成员之一 ,
也是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。病毒感染与宿主
细胞凋亡有着密切的联系 ,病毒感染宿主细胞后 , 通过各种
机制参与宿主细胞凋亡的诱导 [11]。
本实验通过 Westen blot方法对 Caspase- 3蛋白水平进
行检测 ,结果发现在两种作用方式下 (翻白草油对 RSV病毒
的直接灭活作用和在生物合成阶段对 RSV病毒的作用 )
RSV 病毒对照组 Caspase- 3蛋白水平高于翻白草油组
(P < 0. 05) ,结果提示 , Hela细胞经 RSV病毒作用后 ,可以
导致 Caspase- 3被激活 ,参与了 RSV宿主 Hela细胞的凋亡
过程 ,而翻白草油通过降低宿主 HeLa细胞 Caspase 3蛋白表
达 ,对 RSV直接灭活和影响 RSV生物合成。
·1·
第 36卷　第 2期　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　　　　　　　　　　　　　　Vo l. 36 No. 2
　 2013年 4月　　 　　　 HEILON GJIANG M EDICIN E AND PHARM ACY Apr.　 2013　 　　
　　
　　
　　
　　　
　　
　　
　　
　　
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(收稿日期: 2013- 01- 06)
基金项目: 黑龙江省自然科学基金资助项目 ,编号: D201015。
作者简介: 李玉芬 ( 1965～ )女 ,黑龙江人 ,在读硕士研究生 ,主任医师。
通讯作者: 王淑秋 ( 1957～ )女 ,黑龙江佳木斯人 ,硕士研究生导师。教授。E- mail: wang_ shuq@ 163. com。
The effect of Potentilla discolor oil on the expression
of Caspase 3 protein in HeLa cel ls infected with RSV
LI Yu- fen1, 2 ,W ANG Shu- qiu1 ,L IU Lei1 ,W ANG Shu- x iang1
( 1. College of Basic Medical Sciences , Jiamusi Universi ty, Jiamusi 154007, China; 2. Second Af filiated Hospi tal in Mudanjiang Medical College,
Mudan jiang 154101, China)
Abstract: Objective: To detect the ef fect of Po tentilla discolor oil on the expression of Caspase 3 pro tein in
HeLa cells infected wi th RSV , in order to analyze the anti- RSV ef fect of Po tentilla discolor oil. Methods: We
used the HeLa cells infected with RSV, ex t ract the protein to detect the expression of Caspase- 3 by w estern
blo t af ter Potentilla discolor oil. Results: Compared with thev irus control group, the expression of Caspase- 3
protein w ere significant ly lower in Potentilla discolor oil g roup ( P < 0. 05) . Conclusion: Potentilla discolor oil
has anti- RSV effect at the stage of direct inactiva tion and biosynthesis of the virus. The anti- RSV ef fect of
Potentilla discolor oil may be related to the decrease of Caspase- 3 protein’ s expression.
Key words: Potentilla discolor oil; RSV; HeLa cells; Caspase- 3
·2·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　 2013年 4月第 36卷第 2期