全 文 ：【收稿日期】2012-11-28
【基金项目】黑龙江省自然科学基金项目(D201015)
【作者简介】刘蕾(1973-) ，女，医学博士，从事中药抗呼吸道病
毒研究工作，Email:liuleitianxue@ 163． com;罗佳波
(1947-) ，通讯作者，男，教授，从事中药制剂与新药
开发研究工作，Email:ljb@ fimmu． com
文章编号:1005-376X(2013)01-0017-04 【论 著】
翻白草油体外抗呼吸道合胞病毒活性研究
刘蕾1，2，罗佳波1，谭晓梅1，马淑霞2
(1．南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515;2．佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)
【摘 要】目的 研究翻白草油抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用。方法 选取翻白草油进行抗 RSV研究，采用细胞病变反应
(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法观测翻白草油对 RSV作用。结果 MTT和 CPE试验结果表明翻白草油在 3 种作用方式(除细胞
保护作用方式)下能够增强宿主 HeLa细胞存活率，且细胞存活率与翻白草油浓度呈正相关，翻白草油对宿主 HeLa 细胞无保护
作用，不能阻断 RSV病毒进入细胞。结论 翻白草油有抗 RSV作用。
【关键词】翻白草油;呼吸道合胞病毒;抗病毒
【中图分类号】R373． 14 【文献标识码】A
The anti-virus effect of Potentilla discolor oil on respiratory syncytial virus in vitr
LIU Lei1，2，LUO Jia-bo1，TAN Xiao-mei1，MA Shu-xia2
(1． College of Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2． College of Basic Medical
Sciences，Jamusi University，Jamusi 154007，China)
【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of Potentilla discolor oil on respiratory syncytial virus (RSV)in vitro．
Methods Cytopathic effect (CPE)and 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)methods were used to
test the inhibitory effect of Potentilla discolor oil on RSV in vitro at different concentrations． Results The CPE and MTT results showed
that Potentilla discolor oil inhibited the proliferation of RSV through three ways (besides the cell protective effect)． The survival rate of
HeLa cells was increased obviously，and was positively correlated with the concentration of Potentilladiscolor oil． It could not block the vi-
rus entry into host cells． Conclusion Potentilla discolor oil has anti-RSV effect in vitro．
【Key words】 Potentilla discolor oil;Respiratory syncytial virus;Anti-virus
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，
RSV)属于副黏病毒科 RNA病毒，是引起婴幼儿下呼
吸道感染(肺炎和细支气管炎)最常见的病因之一，
尤其是早产儿、先天性心脏病患儿、免疫缺陷的婴儿
和儿童易发生严重 RSV 感染，而且在成人哮喘和慢
性阻塞性肺部疾病等疾病的急性发作中 RSV病毒起
重要作用［1 ～ 8］。翻白草是传统中药，性味苦、平。应
用历史悠久，《本草纲目》、《中国药植志》等多种医药
典籍中均有记载，功用主治主要为祛风湿，解毒。近
30 年来的药理学研究证实，具有降低血糖、抗菌和降
低血脂等丰富的药理作用［9 ～ 14］，且毒副作用低。但
是对翻白草中挥发油抗 RSV病毒作用的研究甚少。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 细胞株和病毒株 人宫颈癌细胞系HeLa细胞
株和 RSV病毒株由南方医科大学中医药学院保存。
1． 1． 2 主要试剂 RPMI 1640 培养基和青霉素 －链
霉素(美国 Gibco公司) ，胎牛血清(杭州四季青生物
工程材料有限公司) ，翻白草油(实验室提取) ，四甲
基偶氮唑(MTT) (Sigma公司)。
1． 1． 3 实验仪器 二氧化碳培养箱(美国 SIM 公
司) ，MoH 99-15 型微孔板酶标仪(芬兰 LM 公司) ，
Nikon Eclipse TS100 型倒置荧光显微镜(日本 Nikon
公司) ，生物安全柜( (北京东联哈尔仪器制造有限公
司)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 药物配制 用 RPMI 1640 维持液(含 2%胎
牛血清)将翻白草油(65． 6 mg /mL)按 1∶20 1∶40
1∶80 1∶160 1∶320和1∶640 比例进行倍比
稀释，0． 22 μm微孔滤器抽滤除菌，4 ℃保存备用。
1． 2． 2 RSV 病毒培养液的制备及其毒力测定 取
RSV病毒液 0． 5 mL接种到 70%单层 HeLa细胞的培
养瓶中，37 ℃吸附 2 h，加入 RPMI 1640 维持液(含
2%胎牛血清)1． 5 mL，置 37 ℃、5% CO2 条件培养，
当 HeLa细胞病变达 70%以上时，三冻三融收集 RSV
病毒液。以 50%细胞培养感染量(50% cell culture
infective dose，CCID50)表示病毒毒力，用 Reed-
Muench法求出 CCID50。将 RSV 病毒培养液做 10 倍
系列稀释从 10-1 ～ 10-10，接种于单层 HeLa 细胞中，每
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DOI:10.13381/j.cnki.cjm.2013.01.008
一稀释度设 8 个复孔，同时设阴性对照，37 ℃培养
3 ～ 5 d，观察细胞病变反应(cytopathic effect，CPE)。
1． 2． 3 翻白草油抗 RSV病毒的不同作用方式 (1)
对 RSV病毒的直接灭活作用:在药物无毒范围内，不
同浓度的翻白草油分别与 100 CCID50 RSV 病毒液等
量混合，37 ℃作用 2 h 后，将其接种每孔 HeLa 细胞
中，37 ℃吸附 2 h，弃上清，加维持液 200 μL，每一浓
度设 8 个复孔，同时设细胞对照和病毒对照，置于
37 ℃、5% CO2 孵箱培养。每天观察 CPE。当病毒对
照细胞病变达 75%以上，用 MTT 法检测细胞活力。
(2)在生物合成阶段对 RSV 病毒的作用:每孔 HeLa
细胞接种 20 μL 100 CCID50 RSV 病毒液，37 ℃吸附
2 h，弃病毒液。在药物无毒范围内加入每孔 200 μL
不同浓度的翻白草油，每一浓度设 8 个复孔，同时设
细胞对照和病毒对照，余方法同(1)。(3)对 RSV 病
毒吸附的作用:在药物最大无毒范围内，不同浓度的
翻白草油 100 μL分别与 100 CCID50 RSV病毒液 100
μL混合后，立即加到每孔 HeLa 细胞中，37 ℃吸附 2
h，弃去 96 孔板中液体，加 RPMI 1640 维持液 200
μL，每一浓度设 8 个复孔，同时设细胞对照和病毒对
照，余方法同(1)。(4)对 HeLa 细胞的保护作用:每
孔 HeLa细胞预先加入不同浓度(在药物最大无毒范
围内)的翻白草油 200 μL，37 ℃作用 4 h，吸弃培养板
中液体，PBS洗涤 3 次，每孔加入 100 CCID50 RSV 病
毒 20 μL，吸附 2 h，弃 RSV 病毒上清，加 RPMI 1640
维持液 200 μL，每一浓度设 8 个复孔，同时设细胞对
照和病毒对照，余方法同(1)。
1． 2． 4 MTT法检测翻白草油对 RSV 病毒宿主 HeLa
细胞存活率 /活力的影响 取对数生长期的细胞，
0． 02 EDTA-0． 25%胰蛋白酶消化计数，取细胞悬液
100 μL(约 1 × 104 个 /孔)分别接种于 96 孔板，18 h
待细胞贴壁后，不同作用方式分别处理后，置于 37
℃、5% CO2 培养箱内培养，连续观察 3 d，记录细胞
形态变化。培养结束前 4 h，吸弃培养板中液体，PBS
冲洗3 次，每孔加入 MTT(5 mg /mL)20 μL，RPMI
1640 维持液(含 2%胎牛血清)180 μL，于 37 ℃培养
箱中培养4 h，弃上清后每孔加 DMSO 200 μL，微量振
荡器振荡 10 min，酶标读数仪比色(波长 490 nm)测
吸光度值。实验重复 3 次。细胞存活率(%)=药物
作用组吸光度值 /细胞对照组吸光度值 × 100%。
1． 3 统计学分析 数据用 SAS(9． 13 版)软件处理，
调用 Proc GLM过程进行方差分析，实验组与各对照
组的比较采用 dunnet-t检验。
2 结果
2． 1 RSV 病毒毒力测定 用普通光学倒置显微镜
观察 CPE，与 HeLa 细胞对照组相比，RSV 病毒作用
的 HeLa细胞变圆，细胞呈典型的串珠样改变。72 h，
当 50% HeLa细胞出现病变时，视为 CPE 阳性细胞;
未出现细胞病变的 HeLa 细胞视为 CPE 阴性细胞。
采用 Reed-Muench 法计算 RSV 培养液在 HeLa 细胞
中的毒力为 105． 8 CCID50 /L，实验中病毒攻击量为 10
3
CCID50 /L。
2． 2 翻白草油对 HeLa 细胞的毒性作用 翻白草油
对 HeLa细胞的毒性作用表现为 HeLa 细胞增殖缓
慢、细胞变圆皱缩、颗粒较多、折光性强、部分细胞破
碎脱落等，且随着翻白草油浓度的降低，HeLa 细胞活
力逐渐增加。由图 1 可知翻白草油的最小毒性浓度
是 0． 10 mg /L。
+
-.
,6
2
5
7
/
*
0
4138
图 1 不同浓度翻白草油对 HeLa 细胞活力影响
2． 3 翻白草油抗 ADV致 CPE 活性 光镜下观察可
见 HeLa 细胞对照组细胞培养液清亮，细胞排列整齐
紧密，呈多边形或菱形，胞浆清楚;RSV 病毒对照组
HeLa细胞 CPE 表现为:细胞出现皱缩、变圆、空泡、
折光性强，细胞核皱缩、细胞呈典型串珠状，最后坏死
脱落;而药物作用组(除对细胞保护作用方式外)He-
La细胞形态明显偏正常，仅有部分 HeLa 细胞出现病
变的特征，呈皱缩状，或串状或脱落;多数细胞呈正常
HeLa的细胞形态(图 2)。
2． 4 MTT法检测翻白草油对 RSV病毒宿主 HeLa细
胞存活率 /活力的影响 MTT 试验结果表明，在 3 种
作用方式(除细胞保护作用方式外)下，无毒范围内
(0． 003 ～ 0． 1 mg /mL)的翻白草油能够增加宿主 He-
La 细胞存活率，且细胞存活率与翻白草油浓度呈正
相关(表 1)。
3 讨论
精油是指具有特殊香气的植物挥发油，植物精油的主
要成分是萜烯、倍半萜烯及其氧化物，另外还有羰基
化合物、酯、醇等。研究发现，植物精油成分具抗癌、
抗炎、利胆、抗病毒等药理作用，因此，植物精油的研
究和应用越来越受到人们的重视［15，16］。
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-3.2?NQ54,++6 /01:>?NQ54,++6
@7;M?/01OEFDRLQ54,++6 @7;M?/01GIB<=RLQ54,++6
@7;M?/01:>JA=RLQ54,++6 @7;M?HP-3.2K8=9CRLQ54,++6
图 2 光镜下观察 HeLa细胞形态
表 1 翻白草油抑制 RSV的致细胞病变作用(%，x ± s，n = 8)
翻白草油(mg /mL)
作用方式
直接灭活 生物合成 病毒吸附 细胞保护
0． 10 77． 4 ± 8． 0 76． 7 ± 3． 8 68． 9 ± 7． 8 －
0． 05 62． 1 ± 5． 7 70． 5 ± 8． 3 65． 8 ± 6． 8 －
0． 025 55． 5 ± 5． 5 67． 1 ± 7． 3 61． 3 ± 5． 1 －
0． 0125 50． 9 ± 3． 5 42． 8 ± 2． 6 57． 0 ± 4． 4 －
0． 0063 47． 0 ± 3． 4 36． 5 ± 5． 0 50． 1 ± 7． 0 －
0． 0030 35． 2 ± 4． 3 31． 5 ± 2． 9 36． 7 ± 3． 3 －
翻白草油是传统中药翻白草的挥发油。翻白草
具有丰富的药理作用，且毒副作用低。翻白草为蔷薇
科植物，在中国传统的医药典籍和各国民间都有广泛
的用途。人们对翻白草的化学成分、毒理、病理、药
理、生理等基础研究和翻白草的药用、食用、饲用、生
产化工原料等的应用研究都做了大量的工作，并取得
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丰硕的成果。但是对翻白草中挥发油抗 RSV作用的
研究尚未见报道。
本实验在光镜下和 MTT 方法观测翻白草油对
RSV 感染后宿主 HeLa 细胞增殖影响。在光镜下
RSV病毒作用 HeLa细胞后，细胞出现皱缩呈典型串
珠状，最后坏死脱落，而翻白草作用组(除对细胞保
护作用方式外)形态明显偏正常，仅有部分细胞出现
病变的特征，多数细胞呈正常 HeLa 的细胞形态。
MTT方法结果也表明翻白草油在 3 种作用方式(除
细胞保护作用方式外)下，能够增加宿主 HeLa 细胞
存活率，且 HeLa细胞存活率与翻白草油浓度相关。
本研究主要是针对翻白草油在体外抗 RSV 作用
的研究，但由于翻白草油进入机体后可能与血浆蛋白
或组织蛋白结合，或经肝脏酶代谢等一系列复杂的药
代动力学过程，而发挥其生物学作用，因此，翻白草油
体外抗 RSV病毒作用机制，及其在动物体内抗 RSV
的作用还需要进一步研究。
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