全 文 ：中总黄酮含量进行测定。实验证明，此法简便可行，适用于测定
紫茎泽兰色素提取物中总黄酮含量。
本实验首次采用冷冻干燥法制备紫茎泽兰色素样品。实验
证明，采用冷冻干燥法制出来的样品疏松，易于溶解，且容易保
存，确保了样品的质量稳定。
参考文献:
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学，2007，35(9) :1365．
收稿日期:2010-07-18; 修订日期:2010-11-05
基金项目:青海省科技成果推广项目(No． 2008 － J － 528) ;
国家自然科学基金·广东省人民政府自然科学基金
(No． U0632010) ;
中央高校基本科研业务费专项资金资助
作者简介:陈振平(1989-) ，女(汉族) ，河南开封人，现为暨南大学生命科
学学院硕士研究生，学士学位，主要从事抗病毒新药研究工作．
* 通讯作者简介:王一飞(1963-) ，男(汉族) ，河南郑州人，现任暨南大学
医学院药学院教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事新药研究工作．
柳兰叶凤毛菊等 19 种藏药提取物
体外抗呼吸道合胞病毒活性的实验研究
陈振平1，王巧利1，曾凡力1，李 深1，鞠怀强1，任 哲1，钱垂文1，吉守祥2，周建青3，王一飞1*
(1．暨南大学生物医药研究开发基地，广东 广州 510632;
2．青海民族大学化学与生命科学学院，青海 西宁 810008;3．青海师范大学化学系，青海 西宁 810008)
摘要:目的 对 19 种藏药提取物进行体外抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)活性的筛选。方法 采用细
胞病变效应法(cytopathogenic effect，CPE)观察药物对 Hep － 2 细胞的最大无毒浓度(TC0)和药物抑制 RSV 的致病变作
用。结果 从 19 种藏药中筛选出柳兰叶凤毛菊 Saussurea epilobioides Maxim 提取物具有显著的抗 RSV 活性，其 TC0 大于
500 μg /ml，且在预防给药，直接灭活，给药治疗 3 种加药方式下均具有抗 RSV 活性，其中预防给药对 RSV 具有更好的抑
制作用。结论 通过对 19 种藏药提取物的筛选，发现柳兰叶凤毛菊提取物具有抗 RSV的活性。
关键词:藏药; 呼吸道合胞病毒(RSV) ;Hep － 2 细胞; 柳兰叶凤毛菊
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 06． 036
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)06-1364-02
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)为副粘病
毒科、肺炎病毒属的负链 RNA病毒，其感染遍及全世界。RSV是
婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一，感染后易
遗留长期肺功能异常，可诱发过敏症和哮喘。目前，对 RSV 感染
尚无特效治疗和预防方案［1］，临床上多采用特异性抗体进行支
持疗法，或是被动免疫治疗如采用干扰素 (IFN)［2 ～ 4］等，也有采
用广谱抗病毒药如利巴韦林进行治疗。利巴韦林虽被证明可以
用于治疗 RSV感染，但由于其毒性较大，近年来对其疗效存在较
大争议［5］。
本实验以 Hep － 2 细胞作为体外抗 RSV活性药物筛选模型，
发现柳兰叶凤毛菊提取物具有显著的抗 RSV活性，并采取预防、
治疗及直接灭活等 3 种不同的给药方式对其抑制 RSV致病变作
用机理进行了初步探讨，为从传统中药中筛选新型抗病毒药物及
进一步研究其抗病毒的活性机理提供参考依据。
1 材料与仪器
1． 1 细胞和病毒 人喉表皮癌细胞 Hep － 2 细胞，由武汉大学医
学院病毒学研究所馈赠;呼吸道合胞病毒(RSV，Long 株)分离
株，为武汉大学医学院病毒学研究所保存毒株，按常规方法增殖
至实验需求量。
1． 2 药物 药品由青海民族大学化学与生命科学学院经以下流
程提取:待药材阴干后，粉碎过 80 目筛，冷藏保存。精确称取药
材粉末 2． 0 g，然后加入 10 倍体积的 95%乙醇，在 60℃水浴中回
流提取 1 h，抽滤，滤渣重复处理两次，合并滤液。将滤液浓缩成
膏，冷藏待用。样品由 DMSO稀释为 105 μg /ml 贮存液待用。阳
性对照药物利巴韦林购自泗水希尔康制药有限公司。
1． 3 试剂和器材 胎牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公
司) ;DMEM培养基(GIBCOBRL 公司) ;CO2 培养箱(日本 Sanyo
公司) ;96 孔培养板(美国 CORNING 公司) ;倒置显微镜(德国
Leica公司) ;超净工作台(苏州净化设备公司)。
2 方法
2． 1 病毒滴度测定 将活化好的毒株作 10 倍系列稀释，10 －1 ～
10 －9，常规方法感染致密单层 Hep － 2 细胞，每孔 100 μl，设 8 个
复孔，同时设正常细胞对照，34． 5℃，5% CO2 培养箱培养 4 d，每
天观察细胞病变效应(CPE)情况，CPE程度可分为从“+”～“+
+ + +”，按 Reed Muench［6］方法计算 TCID50。
2． 2 药物对 Hep － 2 细胞毒性测定 将胰酶消化后的 Hep － 2 细
胞，以 5 × 103 个 /孔密度接种到 96 孔培养板中，37℃，5% CO2 培
养 24 h后，弃液，用含鸡血清 2． 5%的 DMEM 培养基将药物倍比
稀释成 6 个系列浓度(起始浓度为 500 μg /ml)加入 96 孔板，100
μl /孔，每个稀释度设 3 个复孔，同时设正常细胞对照组，继续培
养 48 h后，观察并记录药物作用于细胞的最大无毒浓度 TC0。
2． 3 药物抗病毒的药效学实验 将 100TCID50的 RSV 病毒液接
种于已长成单层的 Hep － 2 细胞中，每孔 50 μl，并在药物无毒浓
度范围内加入含不同浓度的藏药提取物及利巴韦林的维持液，每
孔 50 μl，每个剂量组重复 3 孔，于 34． 5 ℃、5 % CO2 培养箱继续
培养。同时设正常细胞对照、病毒对照。每天在倒置显微镜下观
察细胞形态，以病毒对照组 CPE达到 75%，且细胞对照正常时为
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 6
实验观察终点，记录各孔 CPE 程度 。
2． 4 药物抗病毒作用机理实验 含鸡血清 2． 5%的 DMEM 培养
基将药物倍比稀释成 6 个系列浓度(柳兰叶凤毛菊起始浓度为
500 μg /ml，利巴韦林起始浓度为 25 μg /ml)。将实验分 3 组:预
防方式给药组，病毒感染细胞前 2 h给药;直接灭活病毒组，药液
与病毒液混合，置于 34． 5 ℃作用 2 h 后，加入细胞层;治疗方式
给药组，病毒感染细胞 2 h 后给药。每个药物浓度设 3 个复孔，
病毒量为 100TCID50。同时设正常细胞对照和病毒对照孔，实验
重复 3 次。每天在倒置显微镜下观察细胞形态，以病毒对照组
CPE达到 75%，且细胞对照正常时为实验观察终点，记录各孔
CPE 程度。
3 结果
3． 1 药物对 Hep － 2 细胞毒性测定 以正常细胞无自然蜕变、不
引起细胞病变的最高药物稀释浓度为对 Hep － 2 细胞的最大无
毒浓度 TC0，各样品的 TC0 如表 1 所示。
3． 2 药物抗病毒的药效学实验 表 2 为阳性对照药物利巴韦林
药效学实验 CPE 观察结果，柳兰叶凤毛菊抗病毒药效学实验
CPE观察结果见表 3。
表 1 藏药提取物对 Hep － 2 细胞毒性结果
样品
编号
植物名 拉丁名
TC0 /
μg·ml － 1
1 红花 Carthamus tinctorius L． 125
2 矮紫堇(青海) Corydalis hendersonii Hemsl． 31． 25
3 榼藤子 Entada phaseoloides (Linn．)Merr． 15． 625
4 麻花艽 Gentiana straminea Maxim． 250
5 藏麻黄(青海) Ephedra saxatilis Royle ex Florin 31． 25
6 翼首草(西藏) Pterocephalus bretschneideri Batal． Pretz． 7． 8125
7岩精(西藏鼠兔粪) Ochotona erythrotisr 31． 25
8
贯众
(即中华槲蕨、骨碎补)
Drynariabaronii Christ Diels． 62． 5
9 水柏枝(花) Myricaria garmanica L． 62． 5
10 藏马兜铃 Aristolochia griffithii Hook． f． et Thoms． ex Duchartre ＞ 500
11 细叶苦荬菜 Ixeridium gracile(DC．)Shih ＞ 500
12 苣荬菜 Sonchus arvensis L． ＞ 500
13 黄花铁线莲 Clematis intricata Bge． ＞ 500
14 肾瓣棘豆 Oxytropis kansuensis Bunge 62． 5
15 华北獐芽菜 Swertia wolfangiana Grtining 7． 812 5
16 甘青青兰(幼苗) Dracocephalum tanguticum Maxim． var． tanguticum ＞500
17 香鼠尾草 salvia japonica thunb ＞ 500
18 白花甘青乌头 Aconitum tanguticum (Maxim．)Stapf ＞ 500
19 柳兰叶凤毛菊 Saussurea epilobioides Maxim． ＞ 500
表 2 利巴韦林抗 RSV药效学实验结果
样品
25
μg·ml －1
12．5
μg·ml －1
6．25
μg·ml －1
3．125
μg·ml －1
1．562 5
μg·ml －1
0．781 25
μg·ml －1
利巴韦林 － － － － + +
“ －”示没有病变，0% ～25%为“ +”
表 3 柳兰叶凤毛菊提取物抗 RSV药效学实验结果
样品
500
μg·ml － 1
250
μg·ml － 1
125
μg·ml － 1
62． 5
μg·ml － 1
31． 25
μg·ml － 1
15． 625
μg·ml － 1
柳兰叶
凤毛菊
－ － － + + + + + +
“ －”表示没有病变;0% ～25%为“ +”;26% ～ 50%为“ + +”;51% ～ 75%
为“ + + +”;76% ～100%为“ + + + +”;RSV 对照组为“ + + + ”;细胞对照组
为“ －”
在抗病毒活性实验中，Hep － 2 细胞对照未出现病变，阳性对
照药物利巴韦林在 3． 125 μg /ml以上浓度时有明显抑制 RSV 的
作用(见表 2)。随着柳兰叶凤毛菊浓度的增大，Hep － 2 细胞病
变(指病毒引起的细胞病变:细胞变大，融合，脱落形成空斑)的
程度逐渐减弱，当药物浓度达到 125 μg /ml 时，细胞病变被完全
抑制，即柳兰叶凤毛菊提取物在体外完全抑制 RSV 增殖的有效
浓度为 125 μg /ml以上。结果见表 3。
3． 3 药物抗病毒作用机理实验
通过 CPE观察、记录和分析发现，阳性药物利巴韦林在预防
方式给药时，具有更好的抗 RSV效果，其有效浓度在 1． 562 5 μg /
ml以上，而直接灭活和治疗给药方式下，有效浓度分别为 6． 25
μg /ml和 3． 125 μg /ml以上(见表 4)。柳兰叶凤毛菊提取物在 3
种不同的给药方式下，对 RSV 均具有抑制作用，3 种方式的有效
浓度均为 125 μg /ml以上，且在预防方式给药时，细胞病变程度
明显比其它两种方式轻，说明其预防效果更好。结果见表 5。
表 4 利巴韦林不同给药方式对 RSV的抑制作用结果
加药
方式
25
μg·ml － 1
12． 5
μg·ml － 1
6． 25
μg·ml － 1
3． 125
μg·ml － 1
1． 5625
μg·ml － 1
0． 78125
μg·ml － 1
预防给药 － － － － － +
直接灭活 － － － + + + + + +
治疗给药 － － － － + +
“ －”表示没有病变;0% ～25%为“ +”;26% ～ 50%为“ + +”;51% ～ 75%
为“ + + +”;76% ～100%为“ + + + +”;RSV 对照组为 + + + ;细胞对照组为
“ －”
表 5 柳兰叶凤毛菊提取物不同给药方式对 RSV的抑制作用结果
加药
方式
500
μg·ml － 1
250
μg·ml － 1
125
μg·ml － 1
62． 5
μg·ml － 1
31． 25
μg·ml － 1
15． 625
μg·ml － 1
预防给药 － － － + + + +
直接灭活 － － － + + + + + + +
治疗给药 － － － + + + + + +
“ －”表示没有病变;0% ～25%为“ +”;26% ～50%为“ + +”;51% ～75%为“ +
+ +”;76% ～100%为“ + + + +”;RSV对照组为 + + + ;细胞对照组为“ －”
4 讨论
藏医药学历史悠久，是我国医药学的重要组成部分，它在总
结本民族医药临床实践经验的同时，又吸收了中医药学、天竺
(印度)、大食(今伊朗、伊拉克、埃及、巴勒斯坦等地)医药学理
论，逐步形成了具有本民族特色、完整理论的藏医药学体系。
柳兰叶凤毛菊 Saussurea epilobioides Maxim 是菊科凤毛菊属
植物，主要分布在我国青海、四川、西藏、甘肃等地，一般生长在
海拔较高的山坡草地和高山草甸中，在我国西北地区资源较多。
该植物全草可供药用，主治风湿筋骨痛和中毒性热症、骨折等
症，但其在抗病毒方面的研究国内外未见报道。
本文对 19 种藏药提取物进行了体外抗 RSV 的活性筛选研
究。结果显示，柳兰叶凤毛菊提取物具有明显抑制 RSV 增殖的
作用，其抗病毒活性具有剂量效应。对抗病毒作用机理的初步探
讨表明，柳兰叶凤毛菊提取物在预防给药、直接灭活和给药治疗
3种方式中对 RSV均具有抑制作用，且观察到在相同浓度下，对
RSV的抑制作用以预防给药方式最为显著，其具体机制有待进一
步研究。
综上所述，藏药柳兰叶凤毛菊提取物具有显著的抗 RSV 活
性，可进一步对其中的活性成分和抗病毒的作用机理进行研究，
为柳兰叶凤毛菊作为抗病毒感染药物进行进一步开发研究提供
理论依据。
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