全 文 ：翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细胞 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白表达的影响
刘 蕾 陈 光 王跃新 王淑秋 张鹏霞 王柏欣 王 薇1
(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)
〔摘 要〕 目的 探讨翻白草油对呼吸道合胞病毒(RSV)感染宿主 HeLa细胞 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白的影响作用。方法 RSV感染宿主 HeLa
细胞后，选取翻白草油进行干预，采用 Western印迹检测 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白的表达。结果 翻白草油(除翻白草油预处理作用方式)组与病毒组
比较，宿主 HeLa细胞 Bax蛋白的表达明显降低(P ＜ 0. 05)，而 Bcl-2 蛋白的表达明显增加(P ＜ 0. 05)。结论 翻白草油在三种作用方式下(直接灭
活、病毒复制、病毒吸附阶段)抗 RSV作用可能与调节 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白的表达有关。
〔关键词〕 翻白草油;呼吸道合胞病毒;HeLa细胞;Bcl-2 蛋白;Bax蛋白
〔中图分类号〕 R373. 1 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2013)18-4483-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2013. 18. 049
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(No. D201015)
1 佳木斯大学附属第一医院
第一作者:刘 蕾(1973-)，女，副教授，博士，硕士生导师主要从事呼
吸道病毒学研究工作。
呼吸道合胞病毒(RVS)是一群分布十分广泛的 RNA 病
毒，可以感染呼吸道、心肌等，并造成流行性传播〔1 ～ 3〕。翻白草
(Potentilla discolor Bunge)，又名鸡腿儿、鸡脚草、天青地白、白
头翁、叶下白，为蔷薇科委陵菜属植物翻白草的全草，具有解
毒、清热、止血消肿和止痢的作用，可治疗痢疾、疟疾、肺痈、疖
痈、咯血、崩漏、疮癣。现代医学研究其具有降低血糖、抗病毒、
抗菌和降低血脂〔4 ～ 6〕等丰富的药理作用，且毒副作用低。
1 材料与方法
1. 1 材料 HeLa细胞株和 RSV 病毒株由佳木斯大学病理生
理学教研室保存。翻白草油由本实验室提取，血清、RPMI1640
培养液、双抗(青霉素-链霉素)均购自美国 GIBCO 公司;β-ac-
tin、兔源 Bcl-2 多克隆抗体、兔源 Bax和辣根过氧化物酶(HRP)
标记羊抗兔 IgG抗体购自美国 Santa 公司;脱脂奶粉购自美国
BD公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 HeLa 细胞株在 10% RPMI1640 细胞培养
液(10% 胎牛血清、100 U /ml 青霉素、100 μg /ml 链霉素)，
37℃，5% CO2 培养，约 80%以上融合时取 0. 25%胰蛋白酶 －
0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，传代。
1. 2. 2 药物配制 用细胞维持液(含 2%胎牛血清)将翻白草
油(65. 6 mg /ml)按 1 ∶ 20、1 ∶ 40 等比例进行 2 倍倍比稀释，
0. 22 μm滤器抽滤除菌，4℃条件下保存。
1. 2. 3 病毒毒力测定 病毒毒力用 50% 细胞感染量
(CCID50)表示。将 RSV 液从 10
－1 ～ 10 －10做 10 倍系列稀释。
将各稀释度的 RSV 液接种 HeLa 细胞，设阴性对照，且每一稀
释度设 8 个复孔，培养 3 ～ 5 d，观察和记录细胞病变(CPE)。
CCID50 用 Reed-Muench法求出。
1. 2. 4 翻白草油对 HeLa细胞毒性测定 将不同浓度的翻白
草油分别加入 HeLa细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每
个浓度重复 8 个复孔，同时设立正常细胞对照，置于 37℃、5%
CO2 培养箱内培养，连续观察 3 d，记录细胞形态变化。培养结
束前 4 h，吸弃培养板中液体，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗 3 次，每
孔加入 MTT(5 mg /ml)20 μl，于 37℃培养箱中培养 4 h，去上清
后每孔加 DMSO 200 μl，微量振荡器振荡 5 min，酶标读数仪比
色(波长 490 nm)测吸光度值。实验重复 3 次。
1. 2. 5 翻白草油抗 RSV 的作用方式 每一浓度设 4 个培养
瓶，实验同时设病毒对照。(1)药物配制:用 2% RPMI1640 维
持液(含 2% 胎牛血清)将翻白草油进行稀释浓度为 0. 1、
0. 025、0. 006 3 mg /ml，0. 22 μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备
用。(2)100 CCID50 RSV 病毒液配制:用 2% RPMI1640 维持液
将 RSV病毒原液 1 000 倍稀释，0. 22 μm 微孔滤器抽滤除菌，
4℃保存备用。(3)对 RSV 的直接灭活作用:不同浓度的翻白
草油分别与 100 CCID50RSV液等量混合，37℃作用 2 h后，将其
接种 HeLa细胞，37℃吸附2 h后，弃上清，加 5 ml 维持液。(4)
在生物合成阶段对 RSV的作用:在长成单层 Hela细胞上，接种
0. 5 ml的 100 CCID50RSV病毒病毒液，37℃吸附 2 h，弃病毒液，
加入不同浓度的翻白草油 5 ml。不同浓度的翻白草油分别与
100 CCID50RSV液等量混合，立即加入 HeLa细胞中，37℃，吸附
2 h后，弃培养瓶液体，加入维持液 5 ml。(6)药物对细胞预处
理作用:预先加入不同浓度的翻白草油 5 ml于 HeLa细胞，37℃
条件下，作用 4 h 后，PBS 洗 3 次后，加入 100 CCID50 RSV 液
0. 5 ml，37℃条件下，吸附 2 h，弃 RSV液上清，加入细胞维持液
5 ml。
1. 2. 6 Western印迹检测 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白的影响 裂解
细胞样品，测定蛋白含量，100℃、5 min蛋白变性，经 100 V、十
二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，
260 mA电转移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，Tris 盐酸缓冲液
(TBST)缓冲液漂洗。5%脱脂奶粉 37℃封闭1 h，TBST 漂洗，
Bcl-2 蛋白或 Bax蛋白兔源多克隆抗体 4℃过夜孵育，TBST 漂
洗，HRP标记二抗 37℃，90 min，TBST 漂洗。增强化学发光法
(ECL)显色试剂显色，对照 Marker记录实验结果。将结果进行
拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的净光密度值。
1. 3 统计学方法 应用 SPSS统计软件进行分析，方差分析调
用 Proc GLM过程，组间比较采用 Dunnet t检验。
·3844·刘 蕾等 翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细胞 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白表达的影响 第 18 期
2 结 果
2. 1 RSV毒力测定 用普通光学倒置显微镜观察 CPE，与
HeLa细胞对照组相比，RSV 作用的 HeLa 细胞收缩变圆，典型
串珠样改变。72 h后，CPE阳性细胞为 50% HeLa 细胞出现病
变;CPE阴性细胞未出现细胞病变。通过 Reed-Muench 法计算
RSV液对 HeLa细胞的毒力为 105. 8 CCID50 /L，本实验病毒攻击
量为 103 CCID50 /L。
2. 2 翻白草油对宿主 Hela 细胞毒性作用 翻白草油对宿主
HeLa细胞毒性作用表现为细胞增殖缓慢、细胞皱缩变圆、颗粒
增多、折光性增强、部分细胞出现破碎脱落等，HeLa 细胞活力
随着翻白草油浓度的降低，逐渐增加，翻白草油的最小毒性浓
度是 0. 10 mg /L。见图 1。
2. 3 Western印迹检测翻白草油对 RSV 感染宿主 HeLa 细胞
Bax蛋白和 Bcl-2 蛋白的影响 翻白草油 (除翻白草油预处理
作用方式)组与病毒组比较，宿主 HeLa细胞 Bax蛋白的表达明
显降低(P ＜ 0. 05)，而 Bcl-2 蛋白的表达明显增加(P ＜ 0. 05)。
见图 2。
图 1 不同浓度翻白草油对 HeLa细胞活力影响
与 RSV病毒对照组比较:1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01
A:翻白草油对 RSV的直接灭活作用，B:翻白草油对 RSV生物合成阶段的作用，C:翻白草油对 RSV吸附阶段的作用，D:翻白草油预处理作用
图 1 翻白草油对 RSV感染宿主 HeLa细胞 Bax、Bcl-2 蛋白的影响
3 讨 论
植物挥发油的主要成分是倍半萜烯、萜烯、酯和醇等。研
究发现，其具有抗癌、抗菌和抗病毒等多种药理作用〔7〕，因此，
植物挥发油的研究日益受到人们的重视。翻白草油是传统中
药翻白草的挥发油，是传统中药，性味苦，平。翻白草应用历史
悠久，《本草纲目》和《救荒本草》等医药典籍记载，功用主要为
治痢疾、疮疥、祛风湿和解毒等。现代药理学研究证实翻白草
具有降低血糖、血脂和抗病毒、抗菌等多种药理作用。但抗
RVS作用的研究较少。
细胞凋亡是生命的基本特征之一，一种由基因调控的而使
细胞主动有序的死亡过程，是机体生长发育、细胞分化、生理及
病理性死亡的重要机制。细胞凋亡与细胞增殖共同维持机体
正常生长发育和内环境稳定。细胞增殖与凋亡失控导致许多
疾病的发生。凋亡一般由细胞外的调节因素与其在细胞表面
的受体结合而启动。
Bax /Bcl-2 系统介导的细胞凋亡途径是目前研究较为深入
的有关细胞凋亡的信号传导。细胞凋亡的发生和发展取决于
促凋亡与抑凋亡成员间的相对浓度，Bax 和 Bc1-2 是 Bcl-2 癌基
因家族中功能相反的两个重要成员，分别为促凋亡类蛋白抗凋
亡类蛋白，Bcl-2 /Bax比值决定细胞是否进入内源性凋亡途径，
当 Bax占优势时，细胞进入线粒体依赖的内源性凋亡途径，反
之，则不能进入〔8〕。Bax在正常细胞中主要分布在细胞质，在
凋亡刺激因子的作用下，可以发生转位与线粒体相互作用，破
坏线粒体膜的完整性，使线粒体内某些促凋亡分子外流，进而
活化基质金属蛋白酶(caspase-9)，激活 caspases-3 分子，启动细
胞凋亡过程〔9〕。Bc1-2 在线粒体外膜和 bax 结合形成异构二聚
体阻止 bax 对线粒体的损伤，以维持线粒体膜的完整性，抑制
细胞凋亡 Bax / Bcl-2 系统介导的细胞凋亡〔10〕。病毒感染与宿
主细胞凋亡有着密切的联系，病毒感染宿主细胞后，通过各种
机制参与宿主细胞凋亡的诱导〔11，12〕，
本研究结果提示 RSV 可能通过抑制凋亡抑制基因 Bcl-2
的表达，增加凋亡促进基因 Bax的表达，导致 caspase-3 被激活，
通过内源性(线粒体途径)诱导 Hela 细胞凋亡。另外，在三种
作用方式下翻白草油抗 RSV作用可能与抑制 RSV引起的宿主
细胞凋亡有关。翻白草油抗 RSV 病毒中线粒体途径起主要作
用，但对于该过程具体的调控机制、相关的分子机制以及是否
涉及其他信号分子，可能还有其他途径参与，还需做进一步的
实验研究。
4 参考文献
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〔2012-07-24 收稿 2013-01-12 修回〕
(编辑 袁左鸣)
蒺藜皂苷对人卵巢癌细胞 SKOV3 增殖的影响
陈志伟1，2 梅庆步 张 琪 许惠玉 郑立红 (齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
〔摘 要〕 目的 探讨蒺藜皂苷(STT)对体外培养的卵巢癌细胞株 SKOV3 增殖的影响及机制。方法 选择对数生长的卵巢癌细胞株 SKOV3
分为空白对照组，实验组加 STT。采用 MTT法检测细胞活性，流式细胞术(FCM)测定各组 SKOV3 肿瘤细胞凋亡率及细胞周期变化;应用免疫组化检
测 SKOV3 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达变化。结果 与对照组相比，实验组对卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用 (P ＜ 0. 05)。细胞周期分析显示，实
验组使卵巢癌细胞的 S期细胞比例减小，G1 期细胞比例增大(P ＜ 0. 05)。STT能够降低 Bcl-2 蛋白表达(P ＜ 0. 05)，增加 Bax 蛋白表达(P ＜ 0. 01)。
结论 STT能明显抑制卵巢癌细胞的增殖，其机制可能与细胞周期发生停滞有关，并通过影响细胞周期及下调 Bcl-2 蛋白和增加 Bax 蛋白的表达而
诱导细胞凋亡。
〔关键词〕 蒺藜皂苷;卵巢癌细胞 SKOV3;细胞增殖
〔中图分类号〕 R285. 5 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2013)18-4485-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2013. 18. 050
基金项目:黑龙江省教育厅项目(11541414)
1 黑龙江中医药大学博士后流动站
2 鸡西矿业集团总医院博士后工作站
通讯作者:郑立红(1963-)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤细胞遗
传研究。
第一作者:陈志伟(1972-)，男，教授，博士，主要从事中西医结合抗肿瘤
机制研究。
蒺藜为传统中药，蒺藜科(Zygophylaceae)蒺藜属，植物蒺
藜(Tribulus terrestris L. )的干燥成熟果实，性微温，味辛苦，
有小毒，主要成分是蒺藜皂苷。蒺藜皂苷具有抗衰老，促进免
疫功能增强和降血脂、血压等功效〔1，2〕。近些年发现蒺藜皂苷
类成分具有很好的抗肿瘤及诱导细胞凋亡的功效〔3〕。卵巢癌
是妇科肿瘤中死亡率最高的疾病之一。目前临床采用肿瘤细
胞减灭术与多种化疗方案相结合，但是其 5 年存活率没有明显
改善。临床上常用的治疗卵巢癌的化疗药物副作用较大，而
且容易出现耐药问题。本研究通过体外实验探讨蒺藜皂苷对
肿瘤细胞生长的影响及机制。
1 材料与方法
1. 1 细胞株及培养 人卵巢癌细胞株 SKOV3(购自于中国科
学院上海生物科学研究所)培养于含 10% 灭活小牛血清、
100 U /ml青霉素的 RPMI1640(GIBCO 公司生产)培养基中，
37℃、5%CO2 培养箱中培养。
1. 2 主要试剂和仪器 Bax和 Bcl-2 免疫组化试剂盒，DAB显
色剂(武汉博士德有限公司)。环磷酰胺(上海华联制药有限
公司生产)。HIMAS-1000 病理图文分析系统;流式细胞仪
(FACScan，Beckman公司)。蒺藜皂苷(陕西森弗生物技术有
限公司，纯度达 98%)，应用前以纯净水配成所需浓度。
1. 3 MTT法检测细胞活性 取处于对数生长期的细胞，调细
胞浓度至 1 × 105个 /ml，加入到 96 孔细胞培养板中，每孔
100 μl，待细胞贴壁后环磷酰胺组加环磷酰胺 100 mg /L，
200 μl;实验组加入 100 mg /L蒺藜皂苷药液 200 μl，对照组加
·5844·陈志伟等 蒺藜皂苷对人卵巢癌细胞 SKOV3 增殖的影响 第 18 期